Notre équipe étudie les mécanismes de résistance à l’apoptose induite par divers agents dans les cellules de lymphomes B infectées ou non par le virus d’Epstein-Barr (EBV). EBV est un virus oncogénique de la famille des gamma-herpès virus qui est associé notamment au lymphome de Burkitt (LB) et aux syndromes lymphoprolifératifs post-transplantation (PTLD). Des résultats précédents ont montré que l’utilisation de la nutline-3, une molécule capable de se fixer sur MDM2, active p53 dans ces cellules tumorales. Cependant cette activation de p53 provoque l’apoptose des cellules B EBV(-) alors que les cellules B EBV(+) en latence III (exprimant toutes les protéines virales dites « de latence ») sont beaucoup plus résistantes. Mon travail de thèse a consisté à étudier les mécanismes impliqués dans cette résistance afin de mettre en place des stratégies thérapeutiques pour la contourner. La première partie de ma thèse a été consacrée à l’étude du rôle de l’autophagie dans la résistance des cellules EBV(+) en latence III à l’apoptose. L’autophagie est un processus de dégradation des protéines qui joue un rôle physiologique complexe impliqué à la fois dans la survie et dans la mort cellulaire. Les travaux effectués ont montré que: 1) l’autophagie est induite en réponse au traitement par la nutline dans les cellules EBV(+) en latence III ; 2) ces cellules expriment fortement la Bécline-1 et présentent une activation constitutive de l’autophagie ; 3) l’autophagie participe à la résistance de ces cellules à l’apoptose. La seconde partie de ma thèse a été consacrée au développement de nouvelles molécules ciblant les protéines anti-apoptotiques de la famille de Bcl-2. En effet, outre Bcl-2 qui est surexprimé dans les cellules EBV(+), les cellules de LB et les PTLD surexpriment aussi Mcl-1, une autre protéine anti-apoptotique. Or il a été montré que cette protéine était fréquemment à l’origine de résistance à des inhibiteurs déjà développés (et en essais cliniques) contre Bcl-2. Le développement de molécules ciblant Mcl-1 s’avère donc utile pour les contrer. Pour cela une collaboration avec une équipe de chimiste (dirigée par Fanny Roussi à l’Institut de Chimie des Substances Naturelles à Gif-sur-Yvette) a été mise en place. Nous avons identifié et étudié les mécanismes d’action de plusieurs molécules inhibitrices potentielles de Mcl-1 et/ou Bcl-xL capables d’induire l’apoptose dans nos deux modèles de lymphomes. / Our team investigates the mechanisms of resistance to apoptosis induced in various B-cell lymphomas including some infected by the Epstein-Barr virus (EBV). EBV is an oncogenic member in the gamma-herpesvirus family. Among other pathologies, it is associated with Burkitt’s lymphoma (BL) and post-transplant lymphoproliferative disorders (PTLD). Previously, our laboratory has found that in these tumor cells, the binding of nutlin-3 to MDM2 results in the activation of p53. However, although p53 activation leads to apoptosis in EBV(-) cells, EBV(+) latency III cells which express all viral « latency » proteins are much more resistant. During this PhD project, I studied the mechanisms involved in this resistance and made attempts to define new therapeutic strategies that would bypass them. First, the role played by autophagy was investigated. This catabolic process which degrades proteins and organelles is physiologically complex as it is involved in both cell survival and cell death. Our work has demonstrated that: 1) autophagy was induced in nutlin-3 treated EBV(+) latency III cells; 2) Beclin-1 was strongly expressed in these cells whose autophagy was constitutively activated; 3) autophagy was involved in the resistance to apoptosis observed in these cells. Second, I turned my efforts to the identification of new molecules targeting anti-apoptotic members of the Bcl-2 family. Like Bcl-2, the antiapoptotic protein Mcl-1 is heavily expressed in LB and PTLD cell lines but in this case, independently of their EBV status and this is a frequent cause for the observed resistance to Bcl-2 inhibitors that are currently tested in clinical trials. Molecules targeting Mcl-1 could thus prove promising to circumvent this resistance. In a collaboration with a Chemistry team supervised by Fanny Roussi at the Institut de Chimie des Substances Naturelles in Gif-sur-Yvette, we have identified the mechanisms of action of potential inhibitors of Mcl-1 and/or Bcl-xL, another anti-apoptotic molecules which induce apoptosis in our two lymphoma models.

La protéine Bcl xL, membre de la famille de Bcl 2, est essentiellement décrite pour son rôle dans l'inhibition de la mort des cellules. Récemment, un nouveau rôle lui a été attribué dans la régulation de la macro-autophagie, processus principalement décrit pour promouvoir la survie des cellules. Bcl xL exerce donc ses fonctions de survie à travers la régulation d'au moins deux processus différents.Si les fonctions anti-apoptotiques de Bcl xL ne sont plus à démontrer, ses fonctions dans la régulation de l'autophagie sont davantage débattues. Ainsi, nous avons centré ce travail sur la caractérisation des fonctions pro-autophagiques de Bcl xL afin de mieux comprendre ses fonctions de survie. Nos résultats suggèrent que Bcl xL subit in vivo et dans des cellules en culture une modification de type déamidation. Nous montrons que cette modification renforce les fonctions pro-autophagiques de Bcl xL sans affecter ses fonctions anti-apoptotiques. Par ailleurs, nous nous sommes intéressés à l'interaction entre Bcl xL et la petite GTPase Rab7, une protéine essentielle au processus autophagique et endocytique. Nous avons généré, et analysé d'un point de vue fonctionnel, des mutants de Bcl xL de type perte ou gain d'interaction avec Rab7. Notre principale conclusion est que Bcl xL stimule le trafic des vésicules médié par Rab7, et nous proposons que les fonctions pro-autophagiques de Bcl xL sont majoritairement dépendantes de son interaction avec Rab7. Cette étude contribue ainsi à mieux définir les fonctions pro-autophagiques de Bcl xL ainsi que les processus qui les régulent. Par ailleurs, elle approfondit nos connaissances des fonctions oncogéniques de Bcl xL en intégrant la composante supplémentaire de ses fonctions pro-autophagiques, et ouvre ainsi des perspectives pour l'élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-cancéreuses notamment. / Bcl xL, a member of the Bcl-2 family, is mainly described for its role in the inhibition of cell death. Recently, Bcl xL was attributed a new role in the regulation of macro-autophagy, a process described mainly for its contribution to cell survival. Hence, Bcl xL wields its survival functions through the regulation of at least two different processes. If the anti-apoptotic functions of Bcl xL are now well established, its role in the regulation of autophagy is more debated. Therefore we focused this work on the characterization of Bcl xL pro-autophagic functions in order to get a better understanding of its survival functions. Our results suggest that Bcl xL undergoes in vivo and in cultured cells a modification called deamidation. We show that this modification enhances its pro-autophagic functions without affecting its anti-apoptotic functions. In addition, we characterized an interaction between Bcl xL and the small GTPase Rab7 which is essential for autophagy and endocytosis. We generated mutants of Bcl xL either gaining or loosing interaction with Rab7. The functional analysis of these mutants suggested that Bcl xL stimulates the vesicle trafficking mediated by Rab7, and prompts us to hypothesize that Bcl xL pro-autophagic functions are mainly dependent on its interaction with Rab7. This study helps to better define the pro-autophagic functions of Bcl xL and the processes regulating them. It provides further insights in the oncogenic functions of Bcl xL by implementing additional component of its pro-autophagic functions, and opens perspectives for the development of new therapeutic strategies against cancer progression.

La famille des kinases Src, dont Lyn fait partie, joue un rôle clé dans le contrôle de nombreux processus biologiques. Lyn a une fonction bien établie dans les cellules hématopoïétiques et est notamment impliqué dans le maintien de différentes leucémies et son expression protéique est altérée dans les tumeurs solides. Plusieurs études ont mis en évidence qu’elle avait un rôle anti-apoptotique. Lyn peut être clivée par les caspases en donnant une protéine tronquée cytosolique. Nous avons ainsi montré que Lyn cytosolique (cLyn) régulait Bim, un membre pro-apoptotique de la famille Bcl-2, en le phosphorylant sur les tyrosines 92 et 161 en inhibant la fonction pro-apoptotique de Bim, en augmentant son interaction avec Bcl-XL, limitant ainsi la perméabilisation de la membrane externe mitochondriale et l’apoptose. Lyn possède également un rôle pro-inflammatoire. Nous avions préalablement montré que la surexpression de cLyn, chez la souris, conduit à un syndrome inflammatoire de la peau, ressemblant au psoriasis. Sur la base de ce résultat, nous avons voulu savoir si Lyn jouait un rôle dans cette maladie chronique de la peau. L’analyse de l’expression de Lyn chez des patients souffrant de psoriasis a montré que Lyn était surexprimée dans la peau lésionnelle par rapport à la peau non lésionnelle ou saine, résultats confirmés dans deux modèles de psoriasis chez la souris. De façon intéressante, nous avons montré que l’augmentation de l’expression de Lyn se situe à la fois dans le derme et dans l’épiderme chez l’homme et chez la souris, indiquant que le recrutement de cellules immunitaires dans la peau lésionnelle mais aussi la modulation de Lyn dans les kératinocytes sont impliqués. Par ailleurs, une augmentation de l’expression de Lyn a été observée dans les kératinocytes humains stimulés par le TNF-α et l'IL-17A. Afin de déterminer le rôle de Lyn dans cette maladie cutanée nous l’avons induit chez des souris déficientes pour Lyn. Une réduction significative du phénotype cutanée a été observée dans les souris LynKO, identifiant Lyn comme un nouvel acteur dans la pathogénie du psoriasis. De plus, nos résultats ont établi que l’expression de Lyn dans les kératinocytes semblait suffisante pour le maintien du phénotype psoriasique, indiquant un nouveau rôle de Lyn dans les kératinocytes. Au cours de ce travail, nous avions observé que les caspases inflammatoires étaient activées dans la peau lésionnelle de patients atteints du psoriasis. Les caspases inflammatoires, suite à leur activation, vont cliver l’IL-1β et l’IL-18, ce qui conduit à leur maturation. Nous avons alors voulu savoir si les caspases participaient au développement du psoriasis. Nous avons pu montrer que lorsque nous induisions du psoriasis chez des souris, l’invalidation des caspases inflammatoires ou son inhibition pharmacologique réduisait de façon significative le développement de la maladie. Bien que les cellules immunitaires et les kératinocytes soient capables de secréter de l’IL-1β via l’activation de l’inflammasome, nos données ont établi que seule l’activation des caspases inflammatoires dans le système immunitaire semblait nécessaire pour une réponse inflammatoire complète. En résumé, l’ensemble de mon travail de thèse a permis de montrer un mécanisme moléculaire par lequel la kinase Lyn régule négativement la voie apoptotique mitochondriale, ce qui peut contribuer à la transformation et/ou la résistance des cellules cancéreuses. D’autre part, nos résultats montrent que Lyn pourrait être un régulateur important du psoriasis, et notre étude indique que les caspases inflammatoires activées dans les cellules immunitaires sont impliquées dans la pathogenèse du psoriasis. A ce jour, bien que plusieurs traitements aient été développés pour le psoriasis, la maladie reste non résolue, donc le développement de cibles thérapeutiques contre Lyn et les caspases inflammatoires pourraient être intéressant pour le traitement de la maladie. / The Src family kinase, of which Lyn is one member, plays a key role in controlling many biological processes. Lyn has a well-established function in hematopoietic cells, presenting an important role in the regulation of hematopoietic abnormalities. In fact, Lyn plays a key role in maintaining several kind of leukemia, and furthermore it expression is altered in solid tumors. Different studies have shown that Lyn has an anti-apoptotic role. Lyn can be cleaved by caspases, cysteine proteases involved in apoptosis and inflammation, giving a new protein with a cytosolic location, different from the WT and membrane-anchored form. We have shown that the cytosolic form of Lyn (cLyn) regulated Bim, a pro-apoptotic member of the Bcl-2 family, involved in the control of mitochondrial apoptosis. We have identified that Bim is phosphorylated on tyrosine 92 and 161 by Lyn, resulting in an inhibition of its pro-apoptotic function, increasing its interaction with anti-apoptotic members such as Bcl-XL, thus limiting the permeabilization of mitochondrial outer membrane and impairing cell apoptosis. Lyn also has a pro-inflammatory role. We have previously shown that overexpression of the caspase-cleaved form of Lyn, in mice, leads to an inflammatory skin syndrome, resembling human psoriasis. Based on this result, we wanted to know if Lyn played a role in this chronic skin disease. Analysis of Lyn's expression in psoriasis patients showed that Lyn was overexpressed in lesional skin compared to non-lesional or healthy skin, which was subsequently confirmed in two mouse models of psoriasis disease. Interestingly, we have shown that the increase in Lyn expression is in both the dermis and the epidermis in humans and in mice, indicating that recruitment of immune cells into lesional skin but also the modulation of Lyn in keratinocytes are involved. To determine the role of Lyn in this skin disease we induced a psoriasis-like phenotype in Lyn deficient mice. A significant reduction in cutaneous phenotype was observed in LynKO mice compared to WT mice, identifying Lyn as a new player in the pathogenesis of psoriasis. In addition, our results established that Lyn expression in keratinocytes seemed crucial and sufficient for the maintenance of the psoriasis phenotype, indicating a new role of Lyn in the regulation of keratinocytes. During this work, we observed that inflammatory caspases were activated in lesional skin from psoriasis patients. Inflammatory caspases, following their activation within the inflammasome, will cleave IL-1β and IL-18, leading to their maturation. We then wanted to know if inflammatory caspases participated in the development of psoriasis. We were able to show that when we induced a psoriasis-like disease in mice, the invalidation of inflammatory caspases or its pharmacological inhibition significantly reduced the development of the disease compared to WT mice. Although immune cells and keratinocytes were able to secrete IL-1β via activation of the inflammasome, our data established that only activation of inflammatory caspases in the immune system seemed necessary for a complete inflammatory response. In summary, my thesis shows a molecular mechanism by which Lyn tyrosine kinase negatively regulates the mitochondrial apoptotic pathway, which may contribute to the transformation and/or chemotherapeutic resistance of cancer cells. On the other hand, our results show that Lyn could be an important regulator of psoriasis and our study indicates that inflammatory caspases activated in immune cells are involved in the pathogenesis of psoriasis. To date, although several treatments have been developed for psoriasis, the disease remains unresolved, so the development of therapeutic targets against Lyn and inflammatory caspases could be of interest for the treatment of the disease.