Les insuffisances médullaires héréditaires (IMH) réunissent quatre syndromes principaux : le syndrome de Shwachman-Diamond, la Dyskératose Congénitale, l’anémie de Diamond Blackfan et l'anémie de Fanconi (FA) qui est le syndrome le plus fréquent. Alors que l'étiologie des autres IMH est reliée à des défauts de biogenèse des ribosomes ou d'homéostasie du nucléole, l'étiologie de la FA est considérée comme reposant principalement sur des défauts de réparation de l'ADN.La FA est un syndrome autosomique récessif rare qui inclut des défauts de développement, une prédisposition au cancer et des défauts hématologiques progressifs. Les patients présentent une pancytopénie précoce associée à une myélodysplasie qui les prédispose à la leucémie myéloïde aiguë. La sensibilité cellulaire aux agents pontants de l'ADN est la principale caractéristique qui distingue ce syndrome des autres IMH. La maladie est causée par des mutations homozygotes de la voie FANC-BRCA, qui réunit plus de vingt protéines nécessaires pour la réparation des pontages interbrins de l'ADN ainsi que pour la gestion du stress réplicatif et des conflits entre transcription et réplication. Parmi ces protéines, FANCA est retrouvée mutée chez 60% des patients atteints de FA.Dans ce travail, nous avons cherché à investiguer si la voie FANC ou la protéine FANCA étaient impliquées dans le fonctionnement du nucléole ou dans la biogenèse des ribosomes.Nous avons observé que les cellules déficientes en protéine FANCA ont une homéostasie nucléolaire altérée ainsi qu'une synthèse et une maturation des ARNr ralenties. Ces caractéristiques sont indépendantes de la signalisation des dommages de l'ADN mais sont à mettre en lien avec la présence de conflits entre la transcription et la réplication dans le nucléole. Nous avons montré que la déstructuration du nucléole mène à la stabilisation de la protéine p21 par la protéine nucléolaire NPM1. Egalement, nous avons montré que les ribosomes des cellules déficientes en protéine FANCA présentent un déséquilibre de Facteurs Eucaryotes d'Initiation de la traduction (EIFs) et de certaines isoformes de protéines ribosomales, telle que l'augmentation de la protéine RPL22L1, entrainant une baisse de la traduction.En conclusion, ce travail montre que le stress nucléolaire est impliqué dans l'étiologie de la FA, ce qui relie la FA aux autres IMH. Cette observation incite à étudier les relations entre la réponse aux dommages de l'ADN et le stress nucléolaire dans l'apparition de l'insuffisance médullaire. / Inherited bone marrow failure syndromes (iBMFs) group four main syndromes: Shwachman-Diamond syndrome, Dyskeratosis Congenita, Diamond Blackfan anemia and Fanconi anemia (FA), which is the most frequent one. Whereas the pathogenesis of the other iBMFs is linked to ribosomal biogenesis and nucleolar abnormalities, the pathogenesis of FA is considered to be mainly due to misrepaired DNA damage.The FA syndrome is a rare autosomic recessive disorder, which includes developmental defects, cancer predisposition and evolutive haematological alterations. The patients present an early pancytopenia associated with a progressive myelodysplasia that eventually predisposes them to acute myeloid leukemia. Cellular hypersensitivity to crosslinking agents is the main difference between this syndrome and other iBMFs. The pathology is due to homozygous mutations in the FANC-BRCA pathway, that groups more than twenty proteins necessary for interstrand crosslinks (ICls) repair, replication stress response and managing of conflicts between replication and transcription. Among them, the FANCA protein is mutated in 60% of the FA patients.In this work, we asked whether the FANC pathway or the FANCA protein might be involved in the nucleolar homeostasy or in ribosomal biogenesis.We observed that FANCA defective cells have an altered nucleolar homeostasy and a slowed ribosomal rRNA synthesis and processing, independently from DNA damage signalling but related to conflicts between replication and transcription in the nucleolus. We show that the destructuration of the nucleolus can lead to p21 stabilisation by the nucleolar protein NPM1. Also, we show that ribosomes in FANCA deficient cells present a misbalance of Eukaryotic translation Initiation Factors (EIFs), and of some ribosomal proteins isoforms, such as the increase of RPL22L1, leading to a translation slowdown.In conclusion, this study shows that nucleolar stress is involved in FA pathogenesis, which links FA to other iBMFs. This paves the way for the investigation of interplays between DNA damage and nucleolar stress in bone marrow failure onset.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医科学) / 甲第18906号 / 医科博第62号 / 新制||医科||4(附属図書館) / 31857 / 京都大学大学院医学研究科医科学専攻 / (主査)教授 山下 潤, 教授 野田 亮, 教授 髙折 晃史 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Abstract Two major genes are involved in hereditary predisposition to breast and ovarian cancer – BRCA1 and BRCA2. However, germline mutations in these tumor suppressors account for a maximum 20% of the familial breast cancer cases. A significant portion of the genes predisposing to this disease is unknown and therefore needs to be discovered. The aim of this study was to identify novel breast cancer susceptibility genes from the interweaving BRCA/Fanconi anemia (FA) pathway. Five candidate genes – MERIT40, ABRAXAS, BRIP1, CHK1, and FANCA – were screened for mutations by utilizing conformation-sensitive gel electrophoresis and sequencing, or with multiplex ligation-dependent probe amplification in blood DNA samples of Finnish familial breast cancer patients. Investigation of the MERIT40 gene revealed novel nucleotide changes, being the first report on mutation screening of this gene. None of the observed alterations, however, appeared to be disease related, suggesting that germline mutations in MERIT40 are rare or absent in breast cancer patients. A missense alteration (c.1082G>A, leading to Arg361Gln) was identified in ABRAXAS in 3 out of 125 Northern Finnish breast cancer families (2.4%), but not in any of the 867 healthy controls. The prevalence of the mutation between familial and control cases was statistically significantly different (p=0.002). ABRAXAS c.1082G>A appears to have pathological significance based on its exclusive occurrence in cancer cases, evolutionary conservation, disruption of a putative nuclear localization signal, reduced nuclear localization of the protein, and defective accumulation at DNA damage sites. The BRIP1 (FANCJ) and CHK1 genes were screened for large genomic rearrangements, but no abnormalities were detected, ruling out a significant contribution to breast cancer susceptibility in the Northern Finnish population. A novel large heterozygous deletion was identified in the FANCA gene in one out of 100 breast cancer families, removing the promoter and the first 12 exons. The deletion allele was not present in the tested controls, suggesting that it might contribute to breast cancer susceptibility. This is the first report on the association of a large-size germline deletion in a gene acting in the upstream part of the FA signaling pathway with familial breast cancer. / Tiivistelmä BRCA1 ja BRCA2 ovat kaksi tärkeintä perinnöllisen rinta- ja munasarjasyövän alttiusgeeniä. Niissä esiintyvät ituradan muutokset selittävät kuitenkin vain noin 20 % familiaalisista rintasyöpätapauksista. Suurin osa alttiusgeeneistä on edelleen tunnistamatta ja näitä tekijöitä etsitään aktiivisesti. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on ollut tunnistaa uusia alttiustekijöitä toisiinsa läheisesti liittyviltä BRCA/Fanconin anemia (FA) signaalinsiirtoreiteiltä. Viisi kandidaattigeeniä - MERIT40, ABRAXAS, BRIP1, CHK1 ja FANCA – kartoitettiin mutaatioiden suhteen suomalaisissa rintasyöpäperheissä käyttämällä konformaatiosensitiivistä geelielektroforeesia ja sekvensointia, tai multiplex ligation-dependent probe amplification- menetelmää. MERIT40-geenissä havaittiin useita aikaisemmin raportoimattomia nukleotidimuutoksia, mutta yhdenkään niistä ei havaittu liittyvän rintasyöpäalttiuteen. MERIT40-geenimuutosten mahdollista yhteyttä rintasyöpäalttiuteen ei ole tutkittu aikaisemmin. ABRAXAS-geenissä havaittiin missense-mutaatio (c.1082G>A, joka johtaa Arg361Gln aminohappokorvautumiseen) kolmessa pohjoissuomalaisessa rintasyöpäperheessä (3/125, 2.4 %). Muutosta ei havaittu terveissä kontrolleissa (N=867), ja ero mutaation esiintyvyydessä familiaalisten rintasyöpätapausten ja terveiden kontrollien välillä oli tilastollisesti merkitsevä (p=0.002). ABRAXAS c.1082G>A-muutos on todennäköisesti patogeeninen, sillä kyseinen aminohappopaikka on evolutiivisesti konservoitunut ja sijaitsee todennäköisellä tumaanohjaussignaalialueella. Funktionaaliset kokeet osoittivat, että mutatoitunut proteiinituote lokalisoitui villityypin proteiinia heikommin tumaan ja sen ohjautuminen DNA-vaurioalueille oli puutteellista. BRIP1- (FANCJ) ja CHK1-geeneistä etsittiin laajoja genomisia uudelleenjärjestelyjä, mutta niitä ei havaittu. Näin ollen kyseisillä muutoksilla ei ole merkittävää roolia perinnöllisessä rintasyöpäalttiudessa suomalaisessa väestössä. FANCA-geenissä havaittiin laaja heterotsygoottinen deleetio yhdessä tutkitusta 100 rintasyöpäperheestä. Deleetio poistaa geenin promoottorialueen lisäksi sen 12 ensimmäistä eksonia. Deleetioalleelia ei havaittu terveissä kontrolleissa, joten se mahdollisesti liittyy perinnölliseen rintasyöpäalttiuteen. Tutkimus on ensimmäinen, jossa raportoidaan laaja genominen deleetio FA-signaalinsiirtoreitin ylävirran geenissä familiaalisessa rintasyövässä.