Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-05-18T12:21:04Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Arissa Felipe Borges - 2013.pdf: 8506033 bytes, checksum: 5e9de67542df7e057a413d653adfb783 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-05-18T13:20:11Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Arissa Felipe Borges - 2013.pdf: 8506033 bytes, checksum: 5e9de67542df7e057a413d653adfb783 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-18T13:20:11Z (GMT). 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Monocyte-derived macrophages were incubated with promastigote forms and the infection was assessed under light microscopy (infection index = % infected macrophages x the mean number of parasites per macrophage) after 4 h or 48 h incubation. The NBT assay was used to evaluate the production of superoxide anion. Treatment with PAF 10-10 M, 3 h before the addition of the parasites, increased infection index after 4 h of incubation (Medium vs PAF: 212 vs 324, p <0.05), whereas the infection decreased after 48 h of incubation when PAF was added together with parasites (554 vs 181, p <0.05). The effect of PAF seems to be on macrophages and not on parasites, since the treatment of parasites before incubation with the cells decreased the infection index after 4 h (p <0.05). It was observed that treatment of macrophages with rIFNg, PAF and LPS simultaneously intensified the decreasing of infection index, but the results were not significantly different of those from cultures treated with only PAF. Treatment of macrophages with a PAF antagonist, PCA 4248, 30 min before incubation with the parasites caused a significant increase of the infection index in a concentration-dependent manner (p <0.05) after 48 h. The effect of PCA 4248 was observed only when it was present during the first 4 h of incubation. The inhibition of the reactive oxygen intermediates (ROI) and nitric oxide (NO) production with apocynin and aminoguanidine, respectively, increased the infection (Medium vs apocynin: 200 vs 501; vs Aminoguanidine: 389, p <0.05). In parallel, it was showed that L. (V.) braziliensis induces the production of ROI (superoxide anion) which is further increased by exogenous or endogenous PAF. In conclusion, PAF modulates phagocytosis and increases the microbicidal activity depending on the concentration, contributing to the control of the human macrophage infection with L. (V.) braziliensis. The data showed that Leishmania (V.) braziliensis induces the production of ROI and NO in human macrophages, and suggested that PAF-enhanced microbicidal activity is mediated by an increased production of ROI. The data indicate that PAF activates human macrophages, and can play an important role in the control of the infection by L. (V.) braziliensis. / O fator ativador de plaquetas (PAF) é produzido por macrófagos durante a inflamação e infecções. O papel do PAF na leishmaniose, doença causada pelo protozoário Leishmania spp ainda não está completamente elucidado. Neste trabalho foi avaliado se o PAF é capaz de modular a infecção de macrófagos humanos com L. (V.) braziliensis. Macrófagos foram derivados de monócitos e incubados com formas promastigotas, sendo a infecção avaliada sob microscopia de luz (Índice de infecção = % macrófagos infectados x número médio de parasitos por macrófagos), após 4 h ou 48 h de incubação. O ensaio do NBT foi utilizado para avaliar a produção de ânion superóxido. O tratamento com o PAF 10-10 M, 3 h antes da adição dos parasitos, aumentou o índice de infecção após 4 h de incubação (Meio vs PAF: 212 vs 324, p < 0,05), enquanto diminuiu este índice após 48 h de incubação, quando o PAF foi adicionado junto com os parasitos (554 vs 181, p < 0,05). O efeito do PAF parece ser nos macrófagos e não nos parasitos, uma vez que o tratamento dos parasitos antes da incubação com as células diminuiu significantemente a infecção após 4 h (p < 0,05). Foi observado que o tratamento dos macrófagos com rIFNg, PAF e LPS simultaneamente, apesar de causar uma redução mais acentuada nos índices de infecção, não mostrou diferença estatisticamente significativa em relação ao tratamento com o PAF sozinho. O tratamento dos macrófagos com um antagonista de PAF, o PCA 4248, 30 min antes da incubação com os parasitos causou um aumento significante do índice de infecção, de maneira dependente da concentração (p < 0,05), após 48 h. O efeito do PCA 4248 foi observado somente quando este estava presente durante as primeiras 4 h de incubação. A inibição da produção de reativos intermediários do oxigênio (ROI) e óxido nítrico (NO), com apocinina e aminoguanidina, respectivamente, aumentou a infecção (Meio vs Apocinina 10-3 M: 200 vs 501; vs Aminoguanidina 10-3 M: 389, p < 0,05). Em paralelo, a quantificação da produção de ânion superóxido, demonstrou que L. (V.) braziliensis induz a produção de ROI e que esta produção pode ser aumentada pelo PAF exógeno ou endógeno. Em conclusão, o PAF modula a fagocitose e aumenta a atividade microbicida, dependendo da concentração, contribuindo para o controle da infecção de macrófagos humanos com L. (V.) braziliensis. A infecção de macrófagos humanos com L. (V.) braziliensis induz a produção de ROI e NO, sendo sugerido que o PAF aumenta a atividade microbicida dos macrófagos via aumento da produção de ROI. Os dados indicam que o PAF ativa os macrófagos humanos, podendo ser relevante no controle da infecção por L. (V.) braziliensis.

Receptores do tipo Toll (TLRs) e o receptor do fator ativador de plaquetas (PAF-R) são altamente expressos em macrófagos. Neste estudo, investigamos o efeito da ativação do PAF-R na resposta de macrófagos peritoneais a agonistas de TLR. Descobrimos que PAF exógeno inibiu a produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-6, IL-12p40 e TNF-&#945;) e aumentou a produção de IL-10 em macrófagos estimulados com Pam3Cys (TLR2) e LPS (TLR4), mas não Poly(I:C) (TLR3). PAF não afetou a expressão de MyD88 e TRIF, sugerindo que o efeito do PAF na modulação das citocinas é downstream aos adaptadores. PAF inibiu a fosforilação induzida por LPS da subunidade p65 do NF-&#954;B que direciona a expressão de genes pró-inflamatórios, e aumentou a fosforilação da proteína precursora p105 do NF-&#954;B, que induz a expressão da IL-10. Esses resultados indicam que em macrófagos ativados com LPS, a diminuição da atividade transcricional da p65 e o aumento da fosforilação da p105 induzidos pelo PAF são responsáveis pela downregulation das citocinas pró-inflamatórias e upregulation da IL-10, respectivamente. / Toll-like receptors (TLRs) and platelet-activating factor receptor (PAF-R) are highly expressed in macrophages. In this work, we investigated the effect of PAF-R activation on peritoneal macrophages responses to TLR agonists. We found that exogenous PAF inhibited the production of pro-inflammatory cytokines (IL-12p40, IL-6 and TNF-&#945;) and increased IL-10 in macrophages challenged with Pam3Cys (TLR2) and LPS (TLR4), but not by Poly(I:C) (TLR3). PAF did not affect MyD88 and TRIF expression, suggesting that PAF modulation on cytokines is downstream to adaptors. PAF inhibited LPS-induced phosphorylation of NF-&#954;B p65 that drives inflammatory cytokine gene expression and increased NF-&#954;B p105 precursor phosphorylation, which induces IL-10 expression. These findings indicate that in LPS-activated macrophages, the impaired transcriptional activity of p65 subunit and enhanced p105 phosphorylation induced by PAF are responsible for the downregulation of pro-inflammatory cytokines and up-regulation of IL-10, respectively.

Receptores do tipo Toll (TLRs) e o receptor do fator ativador de plaquetas (PAF-R) são altamente expressos em macrófagos. Neste estudo, investigamos o efeito da ativação do PAF-R na resposta de macrófagos peritoneais a agonistas de TLR. Descobrimos que PAF exógeno inibiu a produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-6, IL-12p40 e TNF-&#945;) e aumentou a produção de IL-10 em macrófagos estimulados com Pam3Cys (TLR2) e LPS (TLR4), mas não Poly(I:C) (TLR3). PAF não afetou a expressão de MyD88 e TRIF, sugerindo que o efeito do PAF na modulação das citocinas é downstream aos adaptadores. PAF inibiu a fosforilação induzida por LPS da subunidade p65 do NF-&#954;B que direciona a expressão de genes pró-inflamatórios, e aumentou a fosforilação da proteína precursora p105 do NF-&#954;B, que induz a expressão da IL-10. Esses resultados indicam que em macrófagos ativados com LPS, a diminuição da atividade transcricional da p65 e o aumento da fosforilação da p105 induzidos pelo PAF são responsáveis pela downregulation das citocinas pró-inflamatórias e upregulation da IL-10, respectivamente. / Toll-like receptors (TLRs) and platelet-activating factor receptor (PAF-R) are highly expressed in macrophages. In this work, we investigated the effect of PAF-R activation on peritoneal macrophages responses to TLR agonists. We found that exogenous PAF inhibited the production of pro-inflammatory cytokines (IL-12p40, IL-6 and TNF-&#945;) and increased IL-10 in macrophages challenged with Pam3Cys (TLR2) and LPS (TLR4), but not by Poly(I:C) (TLR3). PAF did not affect MyD88 and TRIF expression, suggesting that PAF modulation on cytokines is downstream to adaptors. PAF inhibited LPS-induced phosphorylation of NF-&#954;B p65 that drives inflammatory cytokine gene expression and increased NF-&#954;B p105 precursor phosphorylation, which induces IL-10 expression. These findings indicate that in LPS-activated macrophages, the impaired transcriptional activity of p65 subunit and enhanced p105 phosphorylation induced by PAF are responsible for the downregulation of pro-inflammatory cytokines and up-regulation of IL-10, respectively.