A compreensão dos mecanismos que regulam o endométrio e suas implicações clínicas podem contribuir para melhorar as taxas de implantação do embrião humano. Apesar de muitas proteínas e moléculas influenciarem a receptividade endometrial, sua contribuição coordenada para o processo de implantação do embrião ainda é pouco compreendida. Dentre a complexa rede que guia este processo em direção à preparação de um endométrio receptivo se encontram as citocinas, das quais a interleucina-11 (IL-11) e o fator inibidor de leucemia (LIF) desempenham papel essencial. Estudos demonstram que a interrupção das vias de sinalização celular dessas citocinas prejudica ou mesmo impede a implantação, implicando diretamente na fertilidade feminina. Além disso, a hiperinsulinemia afeta negativamente a fertilidade da mulher. Dentro desse contexto, a metformina, fármaco antidiabético, pode exercer efeitos positivos sobre a expressão da IL-11 e LIF, revertendo o possível prejuízo do excesso de insulina sobre a secreção dessas citocinas. Para avaliar esse efeito, utilizou-se um modelo de cultura primária de células estromais de endométrio humano expostas aos hormônios sexuais femininos estrogênio e progesterona, divididas em grupos: controle, metformina, insulina, e associação insulina e metformina. Utilizando RT-qPCR e ensaio imunoenzimático de ELISA, foram avaliadas a expressão gênica e proteica, respectivamente, das duas citocinas. Não foram observadas diferenças entre os grupos. O ensaio de MTT para avaliar a proliferação celular permitiu a verificação da ação antiproliferativa da metformina sobre o grupo hiperinsulinêmico. Embora as hipóteses formuladas nesse estudo encontrem forte sustentação na literatura, no modelo proposto não foi possível encontrar diferenças na expressão da IL-11 e LIF. Dada a complexa regulação de todos os fatores considerados nessa pesquisa e suas múltiplas inter-relações, mais estudos são necessários para esclarecer os mecanismos que orquestram essa complexa rede. / The understanding of the endometrium regulation and its clinical implications can help to improve implantation rates of the human embryo. Although many proteins and molecules influence the endometrial receptivity, their coordinated contribution to embryo implantation process is still poorly understood. Among the complex pathways involved in this process toward the preparation to a receptive endometrium are the cytokines, including interleukin -11 (IL- 11) and leukemia inhibitory factor (LIF) that play an essential role. It has been shown that disruption of cellular signaling pathways of these cytokines impairs or even prevents implantation, direct implications on fertility. Moreover, the hyperinsulinemia can negatively affected women's fertility. Within this context, metformin, an antidiabetic drug, may exert positive effects on the expression of IL-11 and LIF, reversing the possible effects insulin excess. To evaluate this effect, a model of primary culture of human endometrial stromal cells exposed to female sex hormones estrogen and progesterone was used. Cells were divided in groups: control, metformin, insulin, association insulin and metformin. From qRT-PCR and ELISA immunoenzymatic assay gene expression and protein, respectively, of the two cytokines were evaluated. No differences were observed between groups. Additionally, the assay to evaluate cell proliferation MTT found the important antiproliferative action of metformin on hyperinsulinemic group. In the proposed model could not find differences in the expression of IL-11 and LIF. Given the complex regulation of all factors considered in this study and their multiple interrelationships, more studies are required to unravel the mechanisms that orchestrate this complex network.

A compreensão dos mecanismos que regulam o endométrio e suas implicações clínicas podem contribuir para melhorar as taxas de implantação do embrião humano. Apesar de muitas proteínas e moléculas influenciarem a receptividade endometrial, sua contribuição coordenada para o processo de implantação do embrião ainda é pouco compreendida. Dentre a complexa rede que guia este processo em direção à preparação de um endométrio receptivo se encontram as citocinas, das quais a interleucina-11 (IL-11) e o fator inibidor de leucemia (LIF) desempenham papel essencial. Estudos demonstram que a interrupção das vias de sinalização celular dessas citocinas prejudica ou mesmo impede a implantação, implicando diretamente na fertilidade feminina. Além disso, a hiperinsulinemia afeta negativamente a fertilidade da mulher. Dentro desse contexto, a metformina, fármaco antidiabético, pode exercer efeitos positivos sobre a expressão da IL-11 e LIF, revertendo o possível prejuízo do excesso de insulina sobre a secreção dessas citocinas. Para avaliar esse efeito, utilizou-se um modelo de cultura primária de células estromais de endométrio humano expostas aos hormônios sexuais femininos estrogênio e progesterona, divididas em grupos: controle, metformina, insulina, e associação insulina e metformina. Utilizando RT-qPCR e ensaio imunoenzimático de ELISA, foram avaliadas a expressão gênica e proteica, respectivamente, das duas citocinas. Não foram observadas diferenças entre os grupos. O ensaio de MTT para avaliar a proliferação celular permitiu a verificação da ação antiproliferativa da metformina sobre o grupo hiperinsulinêmico. Embora as hipóteses formuladas nesse estudo encontrem forte sustentação na literatura, no modelo proposto não foi possível encontrar diferenças na expressão da IL-11 e LIF. Dada a complexa regulação de todos os fatores considerados nessa pesquisa e suas múltiplas inter-relações, mais estudos são necessários para esclarecer os mecanismos que orquestram essa complexa rede. / The understanding of the endometrium regulation and its clinical implications can help to improve implantation rates of the human embryo. Although many proteins and molecules influence the endometrial receptivity, their coordinated contribution to embryo implantation process is still poorly understood. Among the complex pathways involved in this process toward the preparation to a receptive endometrium are the cytokines, including interleukin -11 (IL- 11) and leukemia inhibitory factor (LIF) that play an essential role. It has been shown that disruption of cellular signaling pathways of these cytokines impairs or even prevents implantation, direct implications on fertility. Moreover, the hyperinsulinemia can negatively affected women's fertility. Within this context, metformin, an antidiabetic drug, may exert positive effects on the expression of IL-11 and LIF, reversing the possible effects insulin excess. To evaluate this effect, a model of primary culture of human endometrial stromal cells exposed to female sex hormones estrogen and progesterone was used. Cells were divided in groups: control, metformin, insulin, association insulin and metformin. From qRT-PCR and ELISA immunoenzymatic assay gene expression and protein, respectively, of the two cytokines were evaluated. No differences were observed between groups. Additionally, the assay to evaluate cell proliferation MTT found the important antiproliferative action of metformin on hyperinsulinemic group. In the proposed model could not find differences in the expression of IL-11 and LIF. Given the complex regulation of all factors considered in this study and their multiple interrelationships, more studies are required to unravel the mechanisms that orchestrate this complex network.

A compreensão dos mecanismos que regulam o endométrio e suas implicações clínicas podem contribuir para melhorar as taxas de implantação do embrião humano. Apesar de muitas proteínas e moléculas influenciarem a receptividade endometrial, sua contribuição coordenada para o processo de implantação do embrião ainda é pouco compreendida. Dentre a complexa rede que guia este processo em direção à preparação de um endométrio receptivo se encontram as citocinas, das quais a interleucina-11 (IL-11) e o fator inibidor de leucemia (LIF) desempenham papel essencial. Estudos demonstram que a interrupção das vias de sinalização celular dessas citocinas prejudica ou mesmo impede a implantação, implicando diretamente na fertilidade feminina. Além disso, a hiperinsulinemia afeta negativamente a fertilidade da mulher. Dentro desse contexto, a metformina, fármaco antidiabético, pode exercer efeitos positivos sobre a expressão da IL-11 e LIF, revertendo o possível prejuízo do excesso de insulina sobre a secreção dessas citocinas. Para avaliar esse efeito, utilizou-se um modelo de cultura primária de células estromais de endométrio humano expostas aos hormônios sexuais femininos estrogênio e progesterona, divididas em grupos: controle, metformina, insulina, e associação insulina e metformina. Utilizando RT-qPCR e ensaio imunoenzimático de ELISA, foram avaliadas a expressão gênica e proteica, respectivamente, das duas citocinas. Não foram observadas diferenças entre os grupos. O ensaio de MTT para avaliar a proliferação celular permitiu a verificação da ação antiproliferativa da metformina sobre o grupo hiperinsulinêmico. Embora as hipóteses formuladas nesse estudo encontrem forte sustentação na literatura, no modelo proposto não foi possível encontrar diferenças na expressão da IL-11 e LIF. Dada a complexa regulação de todos os fatores considerados nessa pesquisa e suas múltiplas inter-relações, mais estudos são necessários para esclarecer os mecanismos que orquestram essa complexa rede. / The understanding of the endometrium regulation and its clinical implications can help to improve implantation rates of the human embryo. Although many proteins and molecules influence the endometrial receptivity, their coordinated contribution to embryo implantation process is still poorly understood. Among the complex pathways involved in this process toward the preparation to a receptive endometrium are the cytokines, including interleukin -11 (IL- 11) and leukemia inhibitory factor (LIF) that play an essential role. It has been shown that disruption of cellular signaling pathways of these cytokines impairs or even prevents implantation, direct implications on fertility. Moreover, the hyperinsulinemia can negatively affected women's fertility. Within this context, metformin, an antidiabetic drug, may exert positive effects on the expression of IL-11 and LIF, reversing the possible effects insulin excess. To evaluate this effect, a model of primary culture of human endometrial stromal cells exposed to female sex hormones estrogen and progesterone was used. Cells were divided in groups: control, metformin, insulin, association insulin and metformin. From qRT-PCR and ELISA immunoenzymatic assay gene expression and protein, respectively, of the two cytokines were evaluated. No differences were observed between groups. Additionally, the assay to evaluate cell proliferation MTT found the important antiproliferative action of metformin on hyperinsulinemic group. In the proposed model could not find differences in the expression of IL-11 and LIF. Given the complex regulation of all factors considered in this study and their multiple interrelationships, more studies are required to unravel the mechanisms that orchestrate this complex network.

Base teórica: O processo de implantação do embrião no ser humano é extremamente complexo e, ao mesmo tempo, essencial para que a mulher possa engravidar. Neste processo, em que o endométrio precisa sofrer uma série de mudanças para tornar-se receptivo, a adequada expressão de MFG-E8 (milk fat globule epidermal growth factor 8), seu receptor a integrina αvβ3 e LIF (leukemia inhibitory factor) parecem ter um papel importante. Além do mais, mulheres com infertilidade e endometriose podem apresentar a falha de implantação como uma grande barreira para obter seu sucesso terapêutico. Objetivos: Avaliar o papel de MFG-E8 e do seu receptor integrina αvβ3 em um modelo de implantação in vitro com uma linhagem celular trofoblástica e outra de epitélio endometrial. Comparar a expressão de MFG-E8, de integrina αvβ3 e de LIF no endométrio de pacientes férteis e inférteis com endometriose durante a janela de implantação. Métodos: No primeiro ensaio, utilizando-se uma linhagem celular bem diferenciada de adenocarcinoma de endométrio (células Ishikawa) e uma linhagem de coriocarcinoma de trofoblasto, o modelo in vitro de implantação humana foi estabelecido. Para investigação do impacto do bloqueio de MFG-E8 e integrina αvβ3, ambas linhagens celulares foram pré-tratadas com anticorpos contra estas proteínas em diferente concentrações antes do ensaio de adesão. No ensaio subsequente, para comparar a expressão de MFG-E8, de integrina αvβ3 e de LIF no endométrio humano, foram realizadas biópsias no período da janela de implantação (LH+7 a LH+10) com cateter de Pipelle. As amostras foram submetidas a imunohistoquímica, e analisadas através do HSCORE. Resultados: Na avaliação in vitro observamos que as células Ishikawa pré-tratadas com anticorpo anti-MFG-E8 causaram diminuição da adesão das esferas Jar dose-dependente. Por outro lado, o pré-tratamento das esferas Jar não resultou em diminuição significativa da adesão. Pré-tratamento com anticorpos anti-integrina αvβ3, tanto de células Ishikawa como de esferas Jar, causaram inibição significativa, dose-dependente, da adesão das esferas. A análise imunohistoquímica das biópsias realizadas durante a janela de implantação mostrou uma expressão aumentada de MFG-E8 em pacientes com endometriose e infertilidade. Além do mais, houve expressão diminuída de LIF no grupo em estudo. Contudo, não houve diferença estatisticamente significativa na expressão de integrina αvβ3 entre os grupos em estudo. Conclusão: Este estudo demonstrou que, quando se bloqueia MFG-E8 ou seu receptor integrina αvβ3 em células Ishikawa em um modelo in vitro, ocorre uma diminuição de adesão das células Jar. Além do mais, bloqueando-se a integrina αvβ3 nas esferas Jar, também ocorre uma diminuição da adesão destas nas células Ishikawa. No entanto, quando estudamos o endométrio in vivo de pacientes com endometriose e infertilidade, encontramos a expressão aumentada de MFG-E8 e diminuída de LIF durante a janela de implantação no endométrio. / Background: The human implantation process is very complex and, at the same time, it is essential for women to achieve pregnancy. In this process, where the human endometrium must go through a lot of changes in order to become receptive, an adequate expression of MFG-E8 (milk fat globule epidermal growth factor 8), integrin αvβ3 and LIF (leukemia inhibitory factor) appear to play an important role. Furthermore, women with endometriosis and infertility may have in their implantation process the key to achieve pregnancy. Objectives: To investigate the role of MFG-E8 and its receptor integrin αvβ3 in the attachment of trophoblast cells to the endometrial epithelium, in an in vitro model. To compare endometrial expression of MFG-E8, integrin αvβ3 and LIF between fertile patients and patients with endometriosis and infertility during the window of implantation. Methods: In our first assay, by using a well-differentiated endometrial adenocarcinoma cell line (Ishikawa cells) and choriocarcinoma human trophoblast cells (Jar cells), an in vitro model mimicking human implantation was established. To investigate the impact of blocking MFG-E8 and integrin αvβ3, the cell lines were pretreated with antibodies against those proteins at different concentrations before the attachment assay. Moreover, to compare endometrial expression of MFG-E8, integrin αvβ3 and LIF, endometrial biopsies were performed during the window of implantation (LH+7 to LH+10) with the Pipelle catheter. The samples were submitted immunochemistry, and analyzed with HSCORE. Results: Pretreatment of Ishikawa cells with anti-MFG-E8 antibody caused a dosedependent and significant inhibition of attachment is our in vitro assay. On the other hand, pretreatment of Jar spheroids did not result in a significant effect on the attachment rate. Pretreatment of Ishikawa cells as well as Jar spheroids with anti-integrin avb3 antibodies resulted in a dose-dependent, significant inhibition of attachment. The immunochemistry analysis of the endometrial biopsies performed during the window of implantation showed increased MFG-E8 expression in patients with endometriosis and infertility. Moreover, there was lower LIF expression in the study group. Conclusion: This study showed that blocking MFG-E8 and its receptor integrin αvβ3 in Ishikawa cells diminishes Jar spheroid attachment in an in vitro model. Moreover, blocking integrin αvβ3 in the trophoblastic cells also diminished their attachment to the Ishikawa monolayer. Nevertheless, when we studied the endometrium of patients with endometriosis and infertility, we saw an increased expression of MFG-E8 and decreased expression of LIF during the window of implantation.

Base teórica: O processo de implantação do embrião no ser humano é extremamente complexo e, ao mesmo tempo, essencial para que a mulher possa engravidar. Neste processo, em que o endométrio precisa sofrer uma série de mudanças para tornar-se receptivo, a adequada expressão de MFG-E8 (milk fat globule epidermal growth factor 8), seu receptor a integrina αvβ3 e LIF (leukemia inhibitory factor) parecem ter um papel importante. Além do mais, mulheres com infertilidade e endometriose podem apresentar a falha de implantação como uma grande barreira para obter seu sucesso terapêutico. Objetivos: Avaliar o papel de MFG-E8 e do seu receptor integrina αvβ3 em um modelo de implantação in vitro com uma linhagem celular trofoblástica e outra de epitélio endometrial. Comparar a expressão de MFG-E8, de integrina αvβ3 e de LIF no endométrio de pacientes férteis e inférteis com endometriose durante a janela de implantação. Métodos: No primeiro ensaio, utilizando-se uma linhagem celular bem diferenciada de adenocarcinoma de endométrio (células Ishikawa) e uma linhagem de coriocarcinoma de trofoblasto, o modelo in vitro de implantação humana foi estabelecido. Para investigação do impacto do bloqueio de MFG-E8 e integrina αvβ3, ambas linhagens celulares foram pré-tratadas com anticorpos contra estas proteínas em diferente concentrações antes do ensaio de adesão. No ensaio subsequente, para comparar a expressão de MFG-E8, de integrina αvβ3 e de LIF no endométrio humano, foram realizadas biópsias no período da janela de implantação (LH+7 a LH+10) com cateter de Pipelle. As amostras foram submetidas a imunohistoquímica, e analisadas através do HSCORE. Resultados: Na avaliação in vitro observamos que as células Ishikawa pré-tratadas com anticorpo anti-MFG-E8 causaram diminuição da adesão das esferas Jar dose-dependente. Por outro lado, o pré-tratamento das esferas Jar não resultou em diminuição significativa da adesão. Pré-tratamento com anticorpos anti-integrina αvβ3, tanto de células Ishikawa como de esferas Jar, causaram inibição significativa, dose-dependente, da adesão das esferas. A análise imunohistoquímica das biópsias realizadas durante a janela de implantação mostrou uma expressão aumentada de MFG-E8 em pacientes com endometriose e infertilidade. Além do mais, houve expressão diminuída de LIF no grupo em estudo. Contudo, não houve diferença estatisticamente significativa na expressão de integrina αvβ3 entre os grupos em estudo. Conclusão: Este estudo demonstrou que, quando se bloqueia MFG-E8 ou seu receptor integrina αvβ3 em células Ishikawa em um modelo in vitro, ocorre uma diminuição de adesão das células Jar. Além do mais, bloqueando-se a integrina αvβ3 nas esferas Jar, também ocorre uma diminuição da adesão destas nas células Ishikawa. No entanto, quando estudamos o endométrio in vivo de pacientes com endometriose e infertilidade, encontramos a expressão aumentada de MFG-E8 e diminuída de LIF durante a janela de implantação no endométrio. / Background: The human implantation process is very complex and, at the same time, it is essential for women to achieve pregnancy. In this process, where the human endometrium must go through a lot of changes in order to become receptive, an adequate expression of MFG-E8 (milk fat globule epidermal growth factor 8), integrin αvβ3 and LIF (leukemia inhibitory factor) appear to play an important role. Furthermore, women with endometriosis and infertility may have in their implantation process the key to achieve pregnancy. Objectives: To investigate the role of MFG-E8 and its receptor integrin αvβ3 in the attachment of trophoblast cells to the endometrial epithelium, in an in vitro model. To compare endometrial expression of MFG-E8, integrin αvβ3 and LIF between fertile patients and patients with endometriosis and infertility during the window of implantation. Methods: In our first assay, by using a well-differentiated endometrial adenocarcinoma cell line (Ishikawa cells) and choriocarcinoma human trophoblast cells (Jar cells), an in vitro model mimicking human implantation was established. To investigate the impact of blocking MFG-E8 and integrin αvβ3, the cell lines were pretreated with antibodies against those proteins at different concentrations before the attachment assay. Moreover, to compare endometrial expression of MFG-E8, integrin αvβ3 and LIF, endometrial biopsies were performed during the window of implantation (LH+7 to LH+10) with the Pipelle catheter. The samples were submitted immunochemistry, and analyzed with HSCORE. Results: Pretreatment of Ishikawa cells with anti-MFG-E8 antibody caused a dosedependent and significant inhibition of attachment is our in vitro assay. On the other hand, pretreatment of Jar spheroids did not result in a significant effect on the attachment rate. Pretreatment of Ishikawa cells as well as Jar spheroids with anti-integrin avb3 antibodies resulted in a dose-dependent, significant inhibition of attachment. The immunochemistry analysis of the endometrial biopsies performed during the window of implantation showed increased MFG-E8 expression in patients with endometriosis and infertility. Moreover, there was lower LIF expression in the study group. Conclusion: This study showed that blocking MFG-E8 and its receptor integrin αvβ3 in Ishikawa cells diminishes Jar spheroid attachment in an in vitro model. Moreover, blocking integrin αvβ3 in the trophoblastic cells also diminished their attachment to the Ishikawa monolayer. Nevertheless, when we studied the endometrium of patients with endometriosis and infertility, we saw an increased expression of MFG-E8 and decreased expression of LIF during the window of implantation.

Base teórica: O processo de implantação do embrião no ser humano é extremamente complexo e, ao mesmo tempo, essencial para que a mulher possa engravidar. Neste processo, em que o endométrio precisa sofrer uma série de mudanças para tornar-se receptivo, a adequada expressão de MFG-E8 (milk fat globule epidermal growth factor 8), seu receptor a integrina αvβ3 e LIF (leukemia inhibitory factor) parecem ter um papel importante. Além do mais, mulheres com infertilidade e endometriose podem apresentar a falha de implantação como uma grande barreira para obter seu sucesso terapêutico. Objetivos: Avaliar o papel de MFG-E8 e do seu receptor integrina αvβ3 em um modelo de implantação in vitro com uma linhagem celular trofoblástica e outra de epitélio endometrial. Comparar a expressão de MFG-E8, de integrina αvβ3 e de LIF no endométrio de pacientes férteis e inférteis com endometriose durante a janela de implantação. Métodos: No primeiro ensaio, utilizando-se uma linhagem celular bem diferenciada de adenocarcinoma de endométrio (células Ishikawa) e uma linhagem de coriocarcinoma de trofoblasto, o modelo in vitro de implantação humana foi estabelecido. Para investigação do impacto do bloqueio de MFG-E8 e integrina αvβ3, ambas linhagens celulares foram pré-tratadas com anticorpos contra estas proteínas em diferente concentrações antes do ensaio de adesão. No ensaio subsequente, para comparar a expressão de MFG-E8, de integrina αvβ3 e de LIF no endométrio humano, foram realizadas biópsias no período da janela de implantação (LH+7 a LH+10) com cateter de Pipelle. As amostras foram submetidas a imunohistoquímica, e analisadas através do HSCORE. Resultados: Na avaliação in vitro observamos que as células Ishikawa pré-tratadas com anticorpo anti-MFG-E8 causaram diminuição da adesão das esferas Jar dose-dependente. Por outro lado, o pré-tratamento das esferas Jar não resultou em diminuição significativa da adesão. Pré-tratamento com anticorpos anti-integrina αvβ3, tanto de células Ishikawa como de esferas Jar, causaram inibição significativa, dose-dependente, da adesão das esferas. A análise imunohistoquímica das biópsias realizadas durante a janela de implantação mostrou uma expressão aumentada de MFG-E8 em pacientes com endometriose e infertilidade. Além do mais, houve expressão diminuída de LIF no grupo em estudo. Contudo, não houve diferença estatisticamente significativa na expressão de integrina αvβ3 entre os grupos em estudo. Conclusão: Este estudo demonstrou que, quando se bloqueia MFG-E8 ou seu receptor integrina αvβ3 em células Ishikawa em um modelo in vitro, ocorre uma diminuição de adesão das células Jar. Além do mais, bloqueando-se a integrina αvβ3 nas esferas Jar, também ocorre uma diminuição da adesão destas nas células Ishikawa. No entanto, quando estudamos o endométrio in vivo de pacientes com endometriose e infertilidade, encontramos a expressão aumentada de MFG-E8 e diminuída de LIF durante a janela de implantação no endométrio. / Background: The human implantation process is very complex and, at the same time, it is essential for women to achieve pregnancy. In this process, where the human endometrium must go through a lot of changes in order to become receptive, an adequate expression of MFG-E8 (milk fat globule epidermal growth factor 8), integrin αvβ3 and LIF (leukemia inhibitory factor) appear to play an important role. Furthermore, women with endometriosis and infertility may have in their implantation process the key to achieve pregnancy. Objectives: To investigate the role of MFG-E8 and its receptor integrin αvβ3 in the attachment of trophoblast cells to the endometrial epithelium, in an in vitro model. To compare endometrial expression of MFG-E8, integrin αvβ3 and LIF between fertile patients and patients with endometriosis and infertility during the window of implantation. Methods: In our first assay, by using a well-differentiated endometrial adenocarcinoma cell line (Ishikawa cells) and choriocarcinoma human trophoblast cells (Jar cells), an in vitro model mimicking human implantation was established. To investigate the impact of blocking MFG-E8 and integrin αvβ3, the cell lines were pretreated with antibodies against those proteins at different concentrations before the attachment assay. Moreover, to compare endometrial expression of MFG-E8, integrin αvβ3 and LIF, endometrial biopsies were performed during the window of implantation (LH+7 to LH+10) with the Pipelle catheter. The samples were submitted immunochemistry, and analyzed with HSCORE. Results: Pretreatment of Ishikawa cells with anti-MFG-E8 antibody caused a dosedependent and significant inhibition of attachment is our in vitro assay. On the other hand, pretreatment of Jar spheroids did not result in a significant effect on the attachment rate. Pretreatment of Ishikawa cells as well as Jar spheroids with anti-integrin avb3 antibodies resulted in a dose-dependent, significant inhibition of attachment. The immunochemistry analysis of the endometrial biopsies performed during the window of implantation showed increased MFG-E8 expression in patients with endometriosis and infertility. Moreover, there was lower LIF expression in the study group. Conclusion: This study showed that blocking MFG-E8 and its receptor integrin αvβ3 in Ishikawa cells diminishes Jar spheroid attachment in an in vitro model. Moreover, blocking integrin αvβ3 in the trophoblastic cells also diminished their attachment to the Ishikawa monolayer. Nevertheless, when we studied the endometrium of patients with endometriosis and infertility, we saw an increased expression of MFG-E8 and decreased expression of LIF during the window of implantation.

Em nosso trabalho anterior mostramos que dentre as citocinas analisadas, os níveis do mRNA de LIF nas células estromais pediátricas, de SMD e de SMD-LMA foram maiores quando comparados às células estromais de crianças saudáveis. No presente estudo, observamos um aumento tempo dependente nos níveis da proteína LIF após adição de SFB em todas as células analisadas (células estromais de crianças saudáveis, de SMD e de SMD-LMA). O envolvimento de p38, ERK e JNK na expressão LIF nestas células foi determinado pelo uso de inibidores dos membros das proteínas quinase ativadas por mitógenos: ERK (PD98059), p38 (SB302580) e JNK (SP600125) os quais inibiram a produção de LIF nas células estromais de crianças saudáveis, após estas serem estimuladas por SFB. No entanto, os níveis da expressão de LIF-induzido por soro nas células estromais de SMD e de SMD-LMA tratadas com SB302580 (p38) foram significativamente diminuídos, em comparação com a inibição observada no tratamento com PD98059 e SP600125 (p <0001, teste ANOVA). Em adição analisamos as formas fosforiladas de p38 e ERK, após 48hs na ausência ou na presença de soro por diferentes tempos. Níveis de atividade de ERK e do p38 foram inicialmente elevados na ausência de soro. A atividade de p38 foi sustentada após tratamento com SFB, entretanto, ERK apresentou uma variação de atividade durante o tratamento. Sugerimos que a sinalização das MAPKs (p38, ERK e JNK), em resposta a fatores de crescimento presentes no soro, parece desempenhar um papel importante na expressão da LIF em células estromais de crianças saudáveis, mas a sinalização do p38 parece ser funcionalmente mais importante nas mielodisplasias ou naquelas associadas à LMA / Our previous report showed that among the cytokines analysed, LIF mRNA levels in stromal cells from pediatric MDS and MDS-AML were higher as compared to those found in healthy stromal cells. In the present study, we have observed an increased protein LIF levels in a time dependent manner after FCS stimulation in all stromal cells analysed (MDS, MDS-AML and healthy children) and the involvement of p38, ERK and JNK pathways in the LIF expression in these cells was determined. In stromal cells from two healthy children, LIF production was equally inhibited in a dose dependent manner after FCS stimulation by mitogen-activated protein kinase (MAPKs) members inhibitors: ERK (PD98059), p38 (SB302580) and JNK (SP600125). However, in MDS and MDS-AML stromal cells, the levels of LIF-induced by serum, were significantly decreased by SB302580, as compared with the inhibition observed by treatment with PD98059 and SP600125 (p <0,001, ANOVA test). In addition we have analysed the presence of p38 and ERK phosphorylated forms in stromal cells, after 48hs of serum starvation or in the presence of FCS for different times. Activated ERK and p38MAPK levels were initially elevated in the absence of serum. p38MAPK activation was sustained after treatment with FCS, whereas ERK presented a variation of the activated forms during treatment. We suggest that the signalling of the MAPKs (p38, ERK and JNK) in response to growth factors present in the serum, seems to play an important role in the LIF expression by stromal cells of healthy children, but p38 MAPK signalling appears to be functionally more important in MDS and MDS-AML

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The manipulation of oocytes enclosed in follicles Ovarian Pre-Antral, allows increasing the reproductive potential of females from the isolation and cultivation. The follicular viability can be affected negatively correlated with age, malnutrition, exposure to radio or chemotherapy and health conditions. The alternatives are to use these research for development of culture media which provides the maintenance of viability allows the activation and follicular development in vitro, for subsequent fertilization. Physiologically various growth factors are involved in the process of folliculogenesis, many of which have so far not been tested in goats. Among them the Sphingosine 1-phosphate (S1P) and Leukemia Inhibitory Factor (LIF), since, follicular development were obtained with these factors in other species, allowing follicular growth and ant apoptotic effect on ovarian tissue. The aim of this study was to evaluate the addition of different concentrations of S1P and the LIF to culture media separately, evaluating the maintenance of viability, activation and follicular development. Thus, the preantral follicle cultured with S1P in situ LIF for 7 days and follicular development as possible to maintain viability, activation and growth of preantral follicle in vitro. Concluding that the S1P 1 ng/ml LIF and 10ng/ml, were the concentration that the maintenance of viability and follicular activation of in situ and grown in vitro for 7 days improved the viability, activation and preantral follicular growth. / A Manipulação de Oócito Incluso em Folículos Ovariano Pré-Antral (MOIFOPA) possibilita o aumento do potencial reprodutivo das fêmeas a partir do isolamento e cultivo de FOPA. A viabilidade folicular pode sofrer influências negativas com a idade, desnutrição, exposição a rádio ou quimioterápicos e condições sanitárias adversas. As alternativas para aproveitamento desses FOPA são pesquisas voltadas para elaboração de meios de cultivos que proporcione o manutenção da viabilidade a possibilite a ativação e o desenvolvimento folicular in vitro, para posterior fertilização. Fisiologicamente vários fatores de crescimento estão envolvidos durante o processo da foliculogênese, muitos dos quais até o momento não foram testados em cabras. Dentre eles, a Esfingosina 1-fosfato (S1P) e o Fator Inibidor da Leucemia (LIF), uma vez que, o desenvolvimento folicular foram obtido com esses fatores em outras espécies, possibilitando crescimento folicular e efeito anti-apoptótico no tecido ovariano. O objetivo desse trabalho foi avaliar a adição de diferentes concentrações de S1P e o do LIF separadamente aos meios de cultivo, avaliando a manutenção da viabilidade, ativação e desenvolvimento folicular. Dessa forma, os FOPA cultivados in situ com S1P e LIF por 7 dias possibilitaram desenvolvimento folicular conforme a manutenção da viabilidade, ativação e crescimento dos FOPA in vitro. Concluindo que a S1P 1ng/ml e o LIF 10ng/ml, foram as concentração que condicionaram a manutenção da viabilidade e a ativação dos FOPA in situ cultivados in vitro por 7 em dias melhor mantiveram a viabilidade, ativação e crescimento folicular.

Em nosso trabalho anterior mostramos que dentre as citocinas analisadas, os níveis do mRNA de LIF nas células estromais pediátricas, de SMD e de SMD-LMA foram maiores quando comparados às células estromais de crianças saudáveis. No presente estudo, observamos um aumento tempo dependente nos níveis da proteína LIF após adição de SFB em todas as células analisadas (células estromais de crianças saudáveis, de SMD e de SMD-LMA). O envolvimento de p38, ERK e JNK na expressão LIF nestas células foi determinado pelo uso de inibidores dos membros das proteínas quinase ativadas por mitógenos: ERK (PD98059), p38 (SB302580) e JNK (SP600125) os quais inibiram a produção de LIF nas células estromais de crianças saudáveis, após estas serem estimuladas por SFB. No entanto, os níveis da expressão de LIF-induzido por soro nas células estromais de SMD e de SMD-LMA tratadas com SB302580 (p38) foram significativamente diminuídos, em comparação com a inibição observada no tratamento com PD98059 e SP600125 (p <0001, teste ANOVA). Em adição analisamos as formas fosforiladas de p38 e ERK, após 48hs na ausência ou na presença de soro por diferentes tempos. Níveis de atividade de ERK e do p38 foram inicialmente elevados na ausência de soro. A atividade de p38 foi sustentada após tratamento com SFB, entretanto, ERK apresentou uma variação de atividade durante o tratamento. Sugerimos que a sinalização das MAPKs (p38, ERK e JNK), em resposta a fatores de crescimento presentes no soro, parece desempenhar um papel importante na expressão da LIF em células estromais de crianças saudáveis, mas a sinalização do p38 parece ser funcionalmente mais importante nas mielodisplasias ou naquelas associadas à LMA / Our previous report showed that among the cytokines analysed, LIF mRNA levels in stromal cells from pediatric MDS and MDS-AML were higher as compared to those found in healthy stromal cells. In the present study, we have observed an increased protein LIF levels in a time dependent manner after FCS stimulation in all stromal cells analysed (MDS, MDS-AML and healthy children) and the involvement of p38, ERK and JNK pathways in the LIF expression in these cells was determined. In stromal cells from two healthy children, LIF production was equally inhibited in a dose dependent manner after FCS stimulation by mitogen-activated protein kinase (MAPKs) members inhibitors: ERK (PD98059), p38 (SB302580) and JNK (SP600125). However, in MDS and MDS-AML stromal cells, the levels of LIF-induced by serum, were significantly decreased by SB302580, as compared with the inhibition observed by treatment with PD98059 and SP600125 (p <0,001, ANOVA test). In addition we have analysed the presence of p38 and ERK phosphorylated forms in stromal cells, after 48hs of serum starvation or in the presence of FCS for different times. Activated ERK and p38MAPK levels were initially elevated in the absence of serum. p38MAPK activation was sustained after treatment with FCS, whereas ERK presented a variation of the activated forms during treatment. We suggest that the signalling of the MAPKs (p38, ERK and JNK) in response to growth factors present in the serum, seems to play an important role in the LIF expression by stromal cells of healthy children, but p38 MAPK signalling appears to be functionally more important in MDS and MDS-AML

Orientadores: Liliana Aparecida Lucci de Angelo Andrade, Fatima Aparecida Böttcher-Luiz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T02:59:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pietro_Luciana_D.pdf: 3492137 bytes, checksum: 723d823e8ddb16925da7aa8f48f22ea1 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A invasão do endométrio pelo trofoblasto extraviloso é fundamental no desenvolvimento do feto e da placenta, processo este controlado por fatores ligados à atividade imunológica e hormonal que, quando alterada, pode resultar em interrupção da gestação e/ou geração das chamadas doenças trofoblásticas gestacionais. Em algumas situações, pode haver evolução para o coriocarcinoma, neoplasia maligna do trofoblasto, em que há evidências da atuação das moléculas ligadas ao processo de fusão celular e inflamação. Porém, os estudos neste tema são incipientes e inconclusivos. Considerando essas informações, o objetivo deste trabalho é estudar de forma comparativa a expressão das citocinas LIF, IL-6 e do ativador de transcrição STAT-3, além da telomerase, em material de aborto, de placenta normal a termo e de coriocarcinoma. Métodos: a expressão destas moléculas foi avaliada pelos métodos: imunoistoquímica (IHQ), imunofluorescência (IF), Western Blotting (WB) e Real-Time PCR (RT-PCR), em amostras de material de aborto, placenta normal a termo e coriocarcinoma (N=12 cada um). Os ensaios de WB e Real-Time PCR empregaram material a fresco de placenta normal a termo e seu cultivo celular e cultura da linhagem BeWo. Resultados: no material de aborto, as reações de IHQs evidenciaram expressão moderada de IL-6 em 58,4% dos casos e intensa de STAT-3 em 33,3%. Na placenta normal, observou-se intensa marcação de IL-6 em 50% e de STAT- 3 em 16,7% dos casos, enquanto que, no coriocarcinoma, houve expressão intensa de IL-6 em 50% e de STAT-3 em 75% dos casos. Por outro lado, as reações para LIF tiveram expressão nula em todos os três grupos. Pelo WB houve expressão proteica de IL-6 apenas no material fresco de placenta normal e ausência de expressão na sua cultura primária e na linhagem BeWo; LIF não foi expresso em todos os grupos estudados. STAT-3 foi detectado no citoplasma em todos os grupos, entretanto, a expressão nuclear da STAT-3 fosforilada (pSTAT-3) não foi observada na IF e nem pelo WB. Na análise gênica pelo RTPCR houve forte expressão de IL-6 e STAT-3 no material fresco de placenta normal e expressão muito fraca na cultura primária de placenta normal e na linhagem BeWo; a expressão de LIF foi muito fraca em todos os grupos. Apenas a linhagem BeWo demonstrou forte expressão gênica da telomerase, contrastando com a completa falta de expressão no material fresco de placenta normal e em sua cultura primária. Conclusão: A intensa expressão IHQ de IL-6 e STAT-3 no coriocarcinoma indica a atuação de ambas na carcinogênese. A expressão proteica de IL-6 no material fresco de placenta normal e sua ausência no material de cultura primária e na linhagem BeWo pode ser ocasionado pelo contato célula-a-célula nas culturas aderentes, inibindo o crescimento celular e, consequentemente, as vias de sinalização. A falta de expressão da pSTAT-3 tanto na IF como por WB demonstra que a via JAK-STAT está sendo desativada. A ausência de expressão de LIF, em todos os métodos estudados, sugere que esta citocina poderia estar sendo inibida por meio de proteínas SOCS3 ou, atuando, de modo indireto, na proliferação celular do coriocarcinoma. O aumento da atividade da telomerase nas células BeWo reforça sua relação com o fenótipo maligno e a aponta como um bom marcador para progressão da doença / Abstract: The invasion of the endometrium by extravillous trophoblast is a fundamental process in the growth of the fetus and placenta. The process is controlled by factors related to the immune and hormonal activity that, when changed, may result in termination of pregnancy and development of so-called gestational trophoblastic diseases. In some cases, changes can result in malignancy, in which some molecules play a role in cell fusion process and inflammation, although studies in this area are inconclusive. Considering this information, the study had the aim of investigating the expression of cytokines LIF, IL-6, STAT- 3 and the function of telomerase to understand their participation in abortion, in normal at term placenta and choriocarcinoma. Methods: The expression of the molecules was assessed by immunohistochemical assay (IHC), immunofluorescence (IF), Western Blotting (WB) and Real-Time PCR (RT - PCR) using fixed material from biopsies of abortions, normal at term placentas and choriocarcinoma along with fresh tissue of normal at term placenta and their primary culture and BeWo cell line. Paraffin embedded material used in IHC and IF assays were obtained from the Department of Pathology files. Tests of WB and Real-Time PCR employed fresh material, obtained from cell cultures of normal at term placenta and the BeWo line. Results: IHC reactions to abortion biopsies showed moderate staining for IL-6 in 58.4% of cases and intense for STAT-3 in 33.3 % of cases. In biopsies of normal placenta, there was intense reaction for IL-6 in 50% of cases, intense for STAT-3 in 16.7%; choriocarcinoma showed intense staining for IL- 6 in 50% of cases and also for STAT-3 in 75% of cases. On the other hand, LIF expression was missing in all three groups. WB analyses showed IL-6 protein in fresh material from normal placentas, but no expression in placenta primary cultures and BeWo line. LIF was absent in all groups. Cytoplasmic STAT-3 was observed in all groups, while the nuclear expression of phosphorylated STAT-3 was absent. On gene analyses a strong expression of IL-6 and STAT- 3 was observed from fresh normal placenta, but very weak expression in primary cultures of normal placenta and BeWo cell line. LIF expression was very weak in all groups. In regard to the gene expression of telomerase, it was strong in the BeWo line which contrasted with its complete lack of expression in fresh normal placenta and its primary culture. Conclusion: The high expression of IL-6 and STAT-3 in biopsies of choriocarcinoma indicates the role of both in tumor progression. Regarding protein expression, the presence of IL-6 in the material from fresh normal placenta, and its absence in primary culture and BeWo line may be caused by the cell-to-cell contact cultures by inhibiting cell growth and thus signaling pathways. However, the lack of expression of phosphorylated STAT-3 whether through IF or WB shows that its JAK-STAT pathway is inhibited. Lack of expression of the LIF suggests that it might be involved indirectly in choriocarcinoma cell proliferation or be inhibited by SOCS3 protein. Moreover, the increased telomerase activity of BeWo cells enhances their relation to the malignant phenotype and indicates a good marker for disease progression / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutora em Ciências Médicas