A busca de estratégias eficientes para a manutenção de espécies em risco de extinção tem impulsionado a comunidade científica a pesquisar alternativas para a preservação de material genético, com intuito de formação de bancos de genoma e aplicação de biotécnicas reprodutivas. Este estudo teve por objetivo avaliar os efeitos de dois protocolos diferentes de resfriamento pré-congelamento para a criopreservação de sêmen de jaguatirica (n=3), gato-do-mato-pequeno (n=4) e gato doméstíco (n=15). Apenas seis amostras de sêmen de jaguatirica, sete de gato-do-mato-pequeno e treze amostras de gato doméstico apresentaram características qualitativas e quantitativas para serem submetidas aos dois métodos de resfriamento. Estas amostras foram processadas e diluídas em meio crioprotetor, com 4% de glicerol e divididas em duas alíquotas submetidas ao método rápido (30 min a 4°C) ou lento (= 2 horas a 4°C) de resfriamento e, em seguida congeladas. Após o descongelamento as amostras foram avaliadas para índice de motilidade, percentual de células com acrossoma intacto e de células viáveis. Ovócitos de gatas domésticas maturados in vitro foram utilizados para avaliar a capacidade de ligação espermática à zona pelúcida, em ensaios de ligação competitiva in vitro. Os espermatozóides criopreservados pelos dois métodos, diferenciados entre si pelo uso de corante vital, competiram pela ligação à zona pelúcida dos mesmos ovócitos, em iguais condições de tratamento. O índice médio da motilidade espermática, pós-congelamento, foi de aproximadamente 50% para todas as espécies nos dois métodos de resfriamento. O percentual de células com acrossoma intacto, para a jaguatirica, foi de aproximadamente 20% nos dois métodos de resfriamento enquanto o gato-do-mato-pequeno apresentou 30,8% de células com acrossoma intacto no método de resfriamento rápido e 33,4% no método lento. Para o gato doméstico, o percentual de células com acrossoma intacto foi de 33,4% e 32,7% nos métodos de resfriamento rápido e lento, respectivamente. O sêmen do gato-do-mato-pequeno sofreu a menor redução no percentual de células viáveis com 51,2% no método de resfriamento rápido e 44% no método lento. A jaguatirica apresentou os menores índices entre as três espécies com 24% de células viáveis no método rápido e 27,4% no método lento, e o gato doméstico apresentou 28,6% e 28,2% de células viáveis nos métodos rápido e lento, respectivamente. O número médio de espermatozóides ligados por ovócito foi maior (p < 0,05) para o resfriamento lento do sêmen de gato-do-mato-pequeno (5,8 +- 0,9) do que para o resfriamento rápido (2,7 +- 0,4). Já o resfriamento rápido proporcionou melhores resultados na taxa de ligação espermática para a jaguatirica (8,5 +- 1,3) (p < 0,01) e para gato doméstico (4,3 +-0,9) (p< 0,05), enquanto o método de resfriamento lento proporcionou 2,5 +- 0,3 espermatozóides de jaguatirica e 1,4 +- 0,2 espermatozóides de gato doméstico ligados por ovócito. As diferentes respostas entre as espécies podem ser devidas a características espermáticas espécie-específicas e individuais. Os resultados permitiram inferir que os protocolos de criopreservação devem ainda ser aperfeiçoados e adaptados à cada espécie e que o ensaio de ligação espermática competitiva foi eficiente na detecção de diferenças na função espermática entre tratamentos, o que não foi possível com as avaliações espermáticas de rotina