A busca de estratégias eficientes para a manutenção de espécies em risco de extinção tem impulsionado a comunidade científica a pesquisar alternativas para a preservação de material genético, com intuito de formação de bancos de genoma e aplicação de biotécnicas reprodutivas. Este estudo teve por objetivo avaliar os efeitos de dois protocolos diferentes de resfriamento pré-congelamento para a criopreservação de sêmen de jaguatirica (n=3), gato-do-mato-pequeno (n=4) e gato doméstíco (n=15). Apenas seis amostras de sêmen de jaguatirica, sete de gato-do-mato-pequeno e treze amostras de gato doméstico apresentaram características qualitativas e quantitativas para serem submetidas aos dois métodos de resfriamento. Estas amostras foram processadas e diluídas em meio crioprotetor, com 4% de glicerol e divididas em duas alíquotas submetidas ao método rápido (30 min a 4°C) ou lento (= 2 horas a 4°C) de resfriamento e, em seguida congeladas. Após o descongelamento as amostras foram avaliadas para índice de motilidade, percentual de células com acrossoma intacto e de células viáveis. Ovócitos de gatas domésticas maturados in vitro foram utilizados para avaliar a capacidade de ligação espermática à zona pelúcida, em ensaios de ligação competitiva in vitro. Os espermatozóides criopreservados pelos dois métodos, diferenciados entre si pelo uso de corante vital, competiram pela ligação à zona pelúcida dos mesmos ovócitos, em iguais condições de tratamento. O índice médio da motilidade espermática, pós-congelamento, foi de aproximadamente 50% para todas as espécies nos dois métodos de resfriamento. O percentual de células com acrossoma intacto, para a jaguatirica, foi de aproximadamente 20% nos dois métodos de resfriamento enquanto o gato-do-mato-pequeno apresentou 30,8% de células com acrossoma intacto no método de resfriamento rápido e 33,4% no método lento. Para o gato doméstico, o percentual de células com acrossoma intacto foi de 33,4% e 32,7% nos métodos de resfriamento rápido e lento, respectivamente. O sêmen do gato-do-mato-pequeno sofreu a menor redução no percentual de células viáveis com 51,2% no método de resfriamento rápido e 44% no método lento. A jaguatirica apresentou os menores índices entre as três espécies com 24% de células viáveis no método rápido e 27,4% no método lento, e o gato doméstico apresentou 28,6% e 28,2% de células viáveis nos métodos rápido e lento, respectivamente. O número médio de espermatozóides ligados por ovócito foi maior (p < 0,05) para o resfriamento lento do sêmen de gato-do-mato-pequeno (5,8 +- 0,9) do que para o resfriamento rápido (2,7 +- 0,4). Já o resfriamento rápido proporcionou melhores resultados na taxa de ligação espermática para a jaguatirica (8,5 +- 1,3) (p < 0,01) e para gato doméstico (4,3 +-0,9) (p< 0,05), enquanto o método de resfriamento lento proporcionou 2,5 +- 0,3 espermatozóides de jaguatirica e 1,4 +- 0,2 espermatozóides de gato doméstico ligados por ovócito. As diferentes respostas entre as espécies podem ser devidas a características espermáticas espécie-específicas e individuais. Os resultados permitiram inferir que os protocolos de criopreservação devem ainda ser aperfeiçoados e adaptados à cada espécie e que o ensaio de ligação espermática competitiva foi eficiente na detecção de diferenças na função espermática entre tratamentos, o que não foi possível com as avaliações espermáticas de rotina

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-12-02Bitstream added on 2015-03-03T12:06:28Z : No. of bitstreams: 1 000806927.pdf: 1884256 bytes, checksum: 34e30cf4b909e11722195260f1d006ce (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A produção de embrião in vitro (PIV) tem sido uma grande alternativa para os programas de preservação de felídeos selvagens ameaçados de extinção. No entanto, a PIV necessariamente depende de outras técnicas de reprodução assistida como a maturação in vitro (MIV), fertilização in vitro (FIV), transferência de embrião (TE), e criopreservação de gametas. Essas técnicas de reprodução assistida já foram transferidas com sucesso do gato doméstico para seus parentes selvagens. Já o uso de sêmen liofilizado também resultou em filhotes vivos de diversas espécies de produção, mas em gatos domésticos isso ainda não ocorreu. O objetivo do presente estudo foi verificar a fragmentação do DNA do sêmen liofilizado e a viabilidade de seu uso através da utilização da ICSI para a PIV de embriões de gatos domésticos. Foram colhidas amostras de 3 gatos normospérmicos que foram utilizadas a fresco, congeladas/descongeladas e liofilizadas. Foram realizados testes para avaliação de integridade de DNA (Laranja de Acridina Convencional, Ensaio do Cometa Alcalino, Laranja de Acridina na citometria de fluxo, e TUNEL). O método de TUNEL mostrou ter maior sonsibilidade para detecção de fragmentação de DNA e detectou grau elevado de lesão de DNA do sêmen liofilizado em comparação com o sêmen fresco e congelado/descongelado dos mesmos doadores. Não foi possível produzir embrião de gato através da técnica de ICSI utilizando sêmen que foi liofilizado em meio SOF / The in vitro production of embryos (IVP) has been a good alternative for conservational programmes of wild felids threatened by extinction. However, IVP depends upon several other assisted reproduction techniques such as in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF), embryo transfer (ET), gamete cryopreservation. These techniques were already successfully employed in wild felines. Freeze-dried sperm has also been used to produce live offspring of several species, but in domestic cat this has not been reported yet. Hence, the objective of the present study was to verify the sperm DNA fragmentation after the freeze-drying process as well as the feasibility of using freeze-dried sperm together with ICSI to produce cat IVP embryos. Fresh, frozen/thawed, freeze-dried sperm samples of 3 normospermic cats were used in this experiment. Sperm DNA integrity assessments were performed (Conventional Acridine Orange, Alkaline Comet Assay, Acridine Orange using flow cytometry, and TUNEL). TUNEL assessment showed higher sensitivity to detect DNA fragmentation and it detected higher DNA fragmentation in freeze-dried sperm when compared to frozen/thawes and fresh semen from the same donors. It was not possible to produce IVP embryos making use of freezedried sperm that used SOF as medium and ICSI

Orientador: Maria Denise Lopes / Banca: Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga / Banca: Jussara Maria Tebet / Banca: Maria Isabel Mello Martins / Banca: Camila de Paula Freitas Dell'Aqua / Resumo: A produção de embrião in vitro (PIV) tem sido uma grande alternativa para os programas de preservação de felídeos selvagens ameaçados de extinção. No entanto, a PIV necessariamente depende de outras técnicas de reprodução assistida como a maturação in vitro (MIV), fertilização in vitro (FIV), transferência de embrião (TE), e criopreservação de gametas. Essas técnicas de reprodução assistida já foram transferidas com sucesso do gato doméstico para seus parentes selvagens. Já o uso de sêmen liofilizado também resultou em filhotes vivos de diversas espécies de produção, mas em gatos domésticos isso ainda não ocorreu. O objetivo do presente estudo foi verificar a fragmentação do DNA do sêmen liofilizado e a viabilidade de seu uso através da utilização da ICSI para a PIV de embriões de gatos domésticos. Foram colhidas amostras de 3 gatos normospérmicos que foram utilizadas a fresco, congeladas/descongeladas e liofilizadas. Foram realizados testes para avaliação de integridade de DNA (Laranja de Acridina Convencional, Ensaio do Cometa Alcalino, Laranja de Acridina na citometria de fluxo, e TUNEL). O método de TUNEL mostrou ter maior sonsibilidade para detecção de fragmentação de DNA e detectou grau elevado de lesão de DNA do sêmen liofilizado em comparação com o sêmen fresco e congelado/descongelado dos mesmos doadores. Não foi possível produzir embrião de gato através da técnica de ICSI utilizando sêmen que foi liofilizado em meio SOF / Abstract: The in vitro production of embryos (IVP) has been a good alternative for conservational programmes of wild felids threatened by extinction. However, IVP depends upon several other assisted reproduction techniques such as in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF), embryo transfer (ET), gamete cryopreservation. These techniques were already successfully employed in wild felines. Freeze-dried sperm has also been used to produce live offspring of several species, but in domestic cat this has not been reported yet. Hence, the objective of the present study was to verify the sperm DNA fragmentation after the freeze-drying process as well as the feasibility of using freeze-dried sperm together with ICSI to produce cat IVP embryos. Fresh, frozen/thawed, freeze-dried sperm samples of 3 normospermic cats were used in this experiment. Sperm DNA integrity assessments were performed (Conventional Acridine Orange, Alkaline Comet Assay, Acridine Orange using flow cytometry, and TUNEL). TUNEL assessment showed higher sensitivity to detect DNA fragmentation and it detected higher DNA fragmentation in freeze-dried sperm when compared to frozen/thawes and fresh semen from the same donors. It was not possible to produce IVP embryos making use of freezedried sperm that used SOF as medium and ICSI / Doutor