Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The decrease in oxygen levels during storage of apples in controlled atmosphere (CA) reduces ethylene production, respiration rate and delay fruit ripening. Excessively low O2 levels induce the fermentative pathway, producing fermentation compounds, if in excess, cause flesh breakdown and affect the aroma. Therefore, it is essential to monitor the minimum O2 threshold during storage, using a technique called dynamic controlled atmosphere (DCA). This thesis is composed of five papers, which resulted from studies with the following aims: to evaluate volatile compounds production in apples after storage in controlled atmosphere (CA) with extremely low O2 levels and DCA, and compare them with standard CA; to compare storage in conventional CA with the DCA by the chlorophyll fluorescence technique (DCA-CF) and respiratory quotient (DCA-RQ) with respect to fruit quality maintenance; to determine the optimum RQ level for the different apples cultivars and evaluate the effect of different temperature and CO2 levels during DCA storage on apple quality. Royal Gala , Galaxy and Fuji Kiku apples were stored for 9 months and plus 7 days of shelf life (20 °C) before the quality analyses. In general, the fruit quality maintenance, on basis of storage conditions occur in the following order: DCA-RQ > DCA-CF > standard CA. Despite the higher production of fermentative compounds in the higher RQ levels, there was no greater difference between the levels of RQ studied, although a trend towards better RQ 1.5 on Royal Gala apples. 1-Methylcyclopropene (1-MCP) application in Galaxy and Fuji Kiku apple stored in DCA-RQ does not improve quality, furthermore 1-MCP increases decay incidence in Fuji Kiku apples. The temperature of 2.0 ºC in storage of Galaxy apples in DCA-RQ, maintains better quality than lower temperatures used in standard CA, saving electrical energy with the refrigeration systems of the storage rooms. 1-MCP application in fruits stored in standard CA may be another strategy to increase storage temperature. CO2 levels, in DCA-RQ storage, can be kept at 1.4 kPa for Fuji Kiku apples and up to 1.6 kPa for Galaxy apples. The use of extremely low O2 levels (0.5 to 0.7 kPa) or DCA-RQ decreases some volatile compounds, especially straight chain esters, while other impact compounds of the aroma are not impaired in relation to standard CA storage. In DCA-CF volatile compounds production are sharply reduced in comparison to standard CA and DCA-RQ, probably due to the initial low oxygen stress, which occurs in DCA-CF. / A diminuição dos níveis de oxigênio durante o armazenamento de maçãs em atmosfera controlada (AC) reduz a produção de etileno, a respiração e retarda a sua maturação. Níveis excessivamente baixos de O2 induzem a via anaeróbica da respiração, com produção de compostos da fermentação que, em excesso, causam distúrbios e afetam o aroma. Portanto, é necessário o monitoramento do limite mínimo de O2 durante o armazenamento, sendo esta técnica chamada de atmosfera controlada dinâmica (ACD). Esta tese é composta por cinco artigos científicos que resultaram de trabalhos de pesquisa com os seguintes objetivos: avaliar a produção de compostos voláteis em maçãs após o armazenamento em atmosfera controlada com níveis extremamente baixos de O2 e em ACD e compará-los com a AC convencional; comparar o armazenamento em AC convencional com a ACD pela técnica da fluorescência de clorofila (ACD-FC) e do quociente respiratório (ACD-QR), com relação à manutenção da qualidade dos frutos; determinar o QR ideal para diferentes cultivares de maçãs e avaliar o efeito da temperatura e níveis de CO2, durante o armazenamento em ACD sobre a qualidade de maçãs. Foram utilizadas maçãs Royal Gala , Galaxy e Fuji Kiku , armazenadas por nove meses e mais sete dias de vida de prateleira (20ºC), antes das análises de qualidade. De uma forma geral, a manutenção da qualidade dos frutos em função das condições de armazenamento ocorre na seguinte ordem: ACD-QR > ACD-FC > AC convencional. Apesar de maior produção de compostos da fermentação nos maiores níveis de QR, não houve grande diferença entre os níveis estudados, apesar de uma tendência de melhor manutenção da qualidade de maçã Royal Gala no menor QR (QR=1,5). A aplicação de 1-metilciclopropeno (1-MCP) em maçã Galaxy e Fuji Kiku armazenadas em ACD-QR não melhora a qualidade em relação aos frutos sem a aplicação do produto, inclusive, aumenta a ocorrência de podridões em Fuji Kiku . A temperatura de 2,0 ºC no armazenamento de maçãs Galaxy em ACD-QR mantém uma melhor qualidade que temperaturas mais baixas usadas em atmosfera controlada tradicional gerando economia de energia elétrica com a refrigeração das câmaras. A utilização de 1-MCP no armazenamento em AC convencional pode ser outra estratégia para aumentar a temperatura. Os níveis de CO2, em ACD-QR, podem ser mantidos em 1,4 kPa para a maçã Fuji Kiku e até 1,6 kPa para maçã Galaxy . A utilização de níveis extremamente baixos de O2 (0,5 0,7 kPa) ou ACD-QR causa a supressão de alguns compostos voláteis, especialmente ésteres de cadeia linear, enquanto outros compostos de impacto para o aroma não são prejudicados, quando comparado com a AC convencional. Em ACD-FC a produção de compostos voláteis é drasticamente reduzida em comparação com AC convencional e também ACD-QR, provavelmente em função do estresse inicial por baixo O2, que ocorre naquela condição de armazenamento.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 697140 bytes, checksum: a673ff7affad18149751f45b84127b29 (MD5) Previous issue date: 2009-02-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This work is a contribution to the studies about the role of KlRox1p in fermentative metabolism of Kluyveromyces lactis. Rox1p is known in Saccharomyces cerevisiae by repressing in aerobic conditions genes that are expressed when oxygen is limited. The kinetics growth of lineages of Kluyveromyces lactis MW270-7B and its derivative mutant K. lactis MW270- 7B rox1Δ was carry out on YNB media (Yeast Nitrogen Base) containing fermentative carbon sources (glucose and lactose) or non fermentative carbon sources (glycerol and ethanol) to determine the growth profile on this sources. Besides both yeasts had its fermentative capacity researched in the presence of an inhibitor of electron chain carrier, antimicin A on YPD (yeast extract, peptone and glucose). The results indicated that the absence of KlROX1 didn't favor the growth in fermentative carbon sources, but it favored in non fermentative carbon sources. The more fermentative capacity of K. lactis rox1Δ was confirmed for the higher ethanol yield for biomass detected in the absence and presence of antimicin A (10 and 20 µM). The lineages rox1 mutant and control were also cultivated on YNB plus glucose under aerobic continuous culture (D = 0,01 h-1) and later they were submitted to a hypoxic condition for 9 hours. Samples were collected every 3 hours for analysis of the expression of putative target genes of KlRox1p as well as analysis of ethanol and of the enzymatic activity of the alcohol desidrogenase (ADH). For the analysis of gene expression, recognition sequences for KlRox1p were researched in silico in the promoters of the genes KlAAC3, KlCOX5B, KlHEM13, KlHAP1, KlRAG1 and KlADH1 and they were found diverging of two nucleotide of the consensus sequence YYYATTGTTCTC. KlRox1p showed to have negative effect on expression of KlAAC3 and KlHEM13, but it didn't seem to act on KlCOX5B. The ethanol concentration, the activity of ADH and the expression of KlADH1 evidenced the metabolism more fermentative of K. lactis rox1Δ on aerobic and hypoxic conditions. And in a way not known, KlRox1p acts on expression of KlHAP1 and KlRAG1. The influence of KlRox1p on expression of KlADH1, KlRAG1 and KlHAP1 suggests the participation of KlRox1p in the control of key points of the fermentative metabolism: entrance of the glucose that determine the flow for the maintenance of fermentative way, as well as in the reductive reaction end that culminates with the ethanol production. The existence of genes that showed to be regulated negatively by KlRox1p in aerobic condition, like KlAAC3 and KlHEM13, indicates the existence in K. lactis of mechanism of transcriptional regulation for oxygen that intends to better use the oxygen in a limit condition, similar to the function of Rox1p in Saccharomyces cerevisiae. However that mechanism seems not just to be related with the concentrations of oxygen, but also with the carbon sources used, fermentative sources or non fermentative sources. / Esse trabalho é uma contribuição aos estudos sobre a função de KlRox1p no metabolismo fermentativo de Kluyveromyces lactis. Rox1p é conhecida em Saccharomyces cerevisiae por reprimir, em aerobiose, genes que são expressos em condição limitante de oxigênio. A cinética de crescimento de linhagens de Kluyveromyces lactis MW270-7B e sua mutante derivativa K. lactis MW270-7B rox1Δ foi realizada em meio YNB (Yeast Nitrogen Base) contendo fontes de carbono fermentáveis (glicose e lactose) ou não fermentáveis (glicerol e etanol) para determinar o perfil de crescimento nessas fontes. Além disso, ambas as linhagens tiveram sua capacidade fermentativa avaliada na presença de um inibidor da cadeia transportadora de elétrons, antimicina A, em meio YPD (extrato de levedura, peptona e glicose). Os resultados indicaram que a ausência de KlROX1 não favoreceu o crescimento em fontes de carbono fermentáveis, mas favoreceu em fontes de carbono não fermentáveis. A maior capacidade fermentativa de K. lactis rox1Δ foi confirmada pelo maior rendimento de etanol por biomassa detectada, na ausência e presença de antimicina A (10 e 20 µM). As linhagens mutante rox1 e controle também foram cultivadas em YNB e glicose em regime contínuo (D= 0,1h-1) sob aerobiose e, em seguida, submetidas à hipoxia por 9 horas. Amostras foram coletadas a cada 3 horas para análise da expressão de possíveis genes alvos de KlRox1p, bem como de etanol e da atividade da álcool desidrogenase (ADH). Para análise da expressão gênica, sequências de reconhecimento por KlRox1p foram pesquisadas in silico nos promotores dos genes KlAAC3, KlCOX5B, KlHEM13, KlHAP1, KlRAG1 e KlADH1 e foram encontradas divergindo de dois nucleotídeos da sequência consenso YYYATTGTTCTC. KlRox1p mostrou ter efeito negativo sobre as expressões de KlAAC3 e KlHEM13 em aerobiose, mas não pareceu atuar sobre KlCOX5B. A concentração de etanol, a atividade da ADH e a expressão de KlADH1 evidenciaram o metabolismo mais fermentativo de K. lactis rox1Δ tanto em aerobiose quanto em hipoxia. E, por um mecanismo ainda desconhecido, KlRox1p atuou sobre as expressões de KlHAP1 e KlRAG1. A influência de KlRox1p na expressão de KlADH1, KlRAG1 e KlHAP1, sugere a participação de KlRox1p no controle de pontos chaves do metabolismo fermentativo: entrada da glicose, que determina o fluxo para a manutenção de uma via fermentativa, bem como na reação redutiva final, que culmina com a formação de etanol. A existência de genes que mostraram ser regulados negativamente por KlRox1p em aerobiose, como KlAAC3 e KlHEM13, indica a existência em K. lactis de mecanismo de regulação transcricional por oxigênio que visa melhor utilizar o oxigênio numa condição limitante, semelhante à função de Rox1p em Saccharomyces cerevisiae. Esse mecanismo, entretanto, parece não estar relacionado apenas com as concentrações de oxigênio, mas também com metabolismo de carbono fermentável ou não fermentável.