Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-11-16T17:29:40Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 536096 bytes, checksum: ef28acbd4ebc8e3f4d2b3939b50658fb (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-16T17:29:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 536096 bytes, checksum: ef28acbd4ebc8e3f4d2b3939b50658fb (MD5) Previous issue date: 2018-07-17 / A ferrugem do cafeeiro causada pelo fungo Hemileia vastatrix vem causando grandes perdas na cafeicultura ao longo dos anos. O controle químico envolvendo fungicidas sistêmicos e protetores tem sido uma ferramenta importante, visando controle eficiente e evitando o surgimento de mutantes resistentes, na população do fungo aos fungicidas sistêmicos. Dentro os produtos mais utilizados, destacam-se os fungicidas cúpricos, preventivamente por sua eficiência, na inibição da germinação dos esporos; quando a incidência atinge 5 %, nos anos de alta carga de frutos pendentes nas plantas, torna-se necessário a utilização de fungicidas sistêmicos. A ocorrência de chuva tem efeito direto no sucesso do controle, pois pode alterar a dinâmica dos fungicidas na superfície foliar. Neste trabalho foi avaliado os efeitos e ocorrências de chuvas após aplicação de fungicidas sistêmicos e protetores, em folhas de cafeeiro, no controle da ferrugem. Foram realizados dois experimentos em casa de vegetação, onde as folhas destacadas de Coffea arabica var. Caturra foram submetidas a uma chuva de 30 mm. No primeiro teste avaliou-se fungicidas sistêmicos (epoxiconazole + piraclostrobina), hidróxido de cobre, sulfato de zinco e ácido bórico, misturados e sozinhos, utilizando a dose comercial. As folhas foram atomizadas e em seguida submetidas a chuva. No primeiro experimento aguardou-se 30 minutos para a aplicação da chuva. Os melhores resultados foram aqueles que continham (epoxiconazole + piraclostrobina) + hidróxido de cobre, onde a severidade foi praticamente zero Independiente do tempo de chuva após pulverização dos tratamentos. Concluiu-se que a aplicação destes fungicidas, mesmo após serem submetidos a chuva, teve controle eficiente da doença. No segundo experimento foi avaliado o oxicloreto de cobre adicionado adjuvantes. Com ocorrência de chuva de 30 mm após os tempos zero, 30, 120 e 480 minutos, depois da pulverização. Os tratamentos mais eficientes foram onde houve a mistura de oxicloreto de cobre 3,0 kg há -1 + OM a 0,75%, demostrando maior retenção na superfície da folha e maior controle da doença. Os menos eficientes foram aqueles que tinham oxicloreto de cobre + PAFE a 0,10% e 0,20%. Conclui-se que o uso de adjuvantes, pode favorecer a tenacidade e eficiência dos produtos, tendo em consideração a formulação do fungicida. / Coffee rust, caused by the fungus Hemileia vastatrix, has been causing significant yield losses of coffee crop over the years. Chemical control involving systemic curative and protective fungicides have been considered important tools, aiming the effective control and avoiding the emergence of resistant mutants in the fungal population to systemic fungicides. Among the most commonly used products, copper fungicides are prominent due to their preventative and efficient mode of action in inhibiting spore germination; when the incidence reaches 5% in the years of high pending fruits’ load, the use of systemic fungicides becomes necessary. In addition, rain has a direct impact on the management success due to the removal of deposits of products on the leaf surface. Thus, the objective of this study was to evaluate the retention time of systemic and protective fungicide residues on coffee leaves submitted to rain, aiming the control of rust. Two experiments were carried out, in which leaves of Coffea arabica var. Caturra were subjected to a 30-mm rainfall treatment. The first assay employed systemic fungicides (epoxiconazole + pyraclostrobin), copper hydroxide, zinc sulfate, and boric acid, mixed and alone, using the commercial dose. The leaves were atomized and then exposed to precipitation regime. In the first experiment, we allowed 30 minutes before the rainfall application. The best results were those containing (epoxiconazole + pyraclostrobin) + copper hydroxide, in which the severity was practically zero. Therefore, the application of these fungicides, even after being submitted to rain, showed effective control over the disease. Copper oxychloride added to the OM and PAFE was used in the second trial. 30-mm rainfall was applied after the times zero, 30, 120, and 480 minutes, respectively after spraying. The most efficient treatments were the mixture of copper oxychloride + OM at 0.75 %, showing greater retention at the leaf surface and greater control of the disease. The least efficient were those having copper oxychloride + 0.10% and 0.20% PAFE. To conclude, the use of mineral oil adjuvant may favor the tenacity and efficiency of the product, taking into account the formulation of the fungicide. / Currículo lattes e agência de fomento não encontrada.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-26T15:41:23Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 11424544 bytes, checksum: ca99a18cd5691209513b8bdabb2843dd (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-26T15:41:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 11424544 bytes, checksum: ca99a18cd5691209513b8bdabb2843dd (MD5) Previous issue date: 1986-08-21 / A duração do molhamento foliar, ou seja, o período em que as folhas do cafeeiro permanecem molhadas, é considerada pelos fitopatologistas como um dos principais fatores que influem na epidemiologia da ferrugem (Hemileia vastatrix Berk et Br.). A determinação desse período tem sido dificultada em razão do alto custo dos equipamentos envolvidos. Apare- lhos mais simples como aspergígrafo e orvalhógrafo não têm sido eficientes em alguns casos. Este trabalho teve por objetivo principal propor e verificar uma metodologia para a obtenção do período de molha- mento a partir de parâmetros agrometeorolõgicos, tais como temperatura do ar, umidade relativa, velocidade do vento etc. A parcela experimental foi definida em um talhão de cafeeiro de 60 x 15 m, formado por 32 linhagens-oan15 anos de idade, altura média de 2 m e espaçamento de 1,80 x 2,8om- localizado no “Campus" da Universidade Federal de Viçosa. Mediram-se as temperaturas dos bulbos seco e úmido e a velocidade do vento, registrando-se a temperatura foliar por meio de dois termopares instalados em duas folhas: uma sombreada e outra exposta. Em um abrigo meteorológico, colo- cado no interior da parcela experimental, instalaram-se ainda dois termoigrógrafos. O período de molhamento foliar foi observado de três maneiras: visualmente, através de um circuito elétrico e de um aspergígrafo. Os dados observados foram submetidos ã formulação teórica, resultando em um modelo físico-matemático para a obtenção do período de molhamento foliar. As observações foram utilizadas para o ajuste do modelo teórico e para a sua vali- dação. Assim, é possível calcular o período de molhamento com boa aproximação, utilizando-se apenas um psicrômetro ou um termoigrõgrafo.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:37:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1333692 bytes, checksum: 9bcd2dfa7f5cb679627a7e4240a82858 (MD5) Previous issue date: 2011-02-24 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The coffee leaf rust caused by the biotrophic fungus Hemileia vastatrix, it is the most important fungal disease of coffee, causing productivity losses and its control increases the costs of coffee production. This study aimed to identify genes of H. vastatrix that encode secreted proteins that may function as effectors needed for the establishment of the biotrophic interaction and / or as triggers of resistance responses, by analyzing a database consisting of 9828 expressed sequence tags (ESTs) from an susceptible interaction. These ESTs were generated by sequencing the 5' end of cDNA clones from a library constructed from mRNA isolated from coffee leaves collected 12 days after inoculation with single pustule isolation HV-01. It was obtained 1004 contigs and 3301 singlets after clustering the sequences using the CAP3 program. From 890 unique transcripts that encode proteins without similarity to sequences of non-redundant database of GenBank / NCBI, which had no identity to sequences of Coffea spp., also deposited in this database, were identified 46 ORFs that encode peptides over 60 amino acids with positive prediction from five or more parameters of algorithms used to predict secretion signal sequences. We selected five genes which were amplified from the H. vastatrix genome, generating fragments equal or higher than those amplified from cDNAs. These genes, unique to H. vastatrix showed no identity with cDNA sequences derived from germination spores, demonstrating that their expression may occur within the infected tissue. The secretion of proteins encoded by four genes was demonstrated using the Yeast Secretion System. Functional studies should be conducted to confirm the effector activity of the genes characterized, as well as from other genes identified in this study, whose origin and secretion of fungal the predicted proteins in yeast has been demonstrated. / A ferrugem causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix é a doença mais importante do cafeeiro, pois atinge, com gravidade, grandes áreas de lavouras, onde causa prejuízos na produtividade e seu controle aumenta os custos de produção. O presente trabalho teve por objetivo identificar genes de H. vastatrix que codificam proteínas secretadas que possam funcionar como efetores necessários para o estabelecimento da interação biotrófica e, ou, como desencadeadores de respostas de resistência, por meio da análise de um banco constituídos por 9828 etiquetas de sequências expressas (ESTs) em uma interação suscetível. Essas ESTs foram geradas pelo sequenciamento da extremidade 5´de clones de cDNA de uma biblioteca construída a partir de mRNA isolado de folhas de cafeeiro coletadas 12 dias após a inoculação com o isolado monopustular HV-01. Foram obtidos 1004 contíguos e 3301 singletos após o alinhamento das sequências pelo programa CAP3. A partir de 890 transcritos únicos que codificam proteínas sem similaridade a sequências do banco não redundante do GenBank/NCBI e que não possuíam identidade a sequências de Coffea spp. também depositadas nesse banco de dados, foram obtidas 46 ORFs que codificam peptídeos com mais de 60 aminoácidos e predição positiva em cinco ou mais parâmetros do algoritmo de predição de sequências sinal de exportação SignalP. Foram selecionados cinco genes que tiveram a região da ORF amplificada do genoma de H. vastatrix, gerando fragmentos iguais ou maiores aos amplificados a partir do cDNA. Esses genes, exclusivos de H. vastatrix, não mostraram identidade com sequências únicas derivadas de esporos germinados desse patógeno, demonstrando que a sua expressão ocorre no interior do tecido infectado. A secreção das proteínas codificadas por quatro genes foi confirmada em levedura. Estudos funcionais deverão ser realizados para comprovar a atividade efetora dos genes caracterizados, assim como dos demais genes identificados nesse estudo, cuja origem fúngica e secreção das proteínas preditas em levedura seja demonstrada.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:37:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1555014 bytes, checksum: 0c6c5a8ef13ff1e9dfba0b83360516de (MD5) Previous issue date: 2007-03-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Evidence is presented to show that Hemileia vastatrix, the causal agent of coffee leaf rust, has two types of teliospores in the life cycle: thin and smooth-walled, globose to napiform teliospores typically germinating with a four-celled promycelium (basidium), each cell producing a sterigma and basidiospore; thick-walled, ornamented, sub-reniform uredinioid teliospores. Caryological studies using Giemsa staining and image cytometry demonstrate that the first division of meiosis occurs in the uredinioid teliospores, and the second division only takes place after germination in the appressorium (delayed meiosis). The intent of examining the caryological status of H. vastatrix spores through flux cytometry was not implemented because this technique dependended on protoplast isolations that proved impossible with the treatments that were attempted for this fungus. Factors affecting the frequency and type of germination (mycelial versus appressorial) and of the uredinioid teliospores were investigated and analysed. Most germinate in the dark at temperatures between 22 and 26 oC, and appressorial formation is obtained under low temperatures (22 oC), in the dark. Teliospores were recorded from various localities in Minas Gerais, confirming the previous dubious record of the occurrence of this spore type in Brazil, and their occurrence appeared to be conditioned by the changing humidity during periods of lower temperatures in the winter and spring. A significant proportion of teliospores showed abnormal germination; the number of promycelial cells varying from three to seven, with or without the production of sterigmata and basidiospores. This body of information may explain the high number of races identified thus far in H. vastatrix, a supposedly functionally asexual fungus that produces non-functional basidiospores, according to the current views. The existence of an additional process allowing genetic recombination might explain the emergence of new races and the continuing breakdown of resistance in new coffee varieties. / Produziram-se evidências de que Hemileia vastatrix, o agente etiológico da ferrugem do cafeeiro, tem dois tipos de teliósporos no seu ciclo de vida: teliósporos globosos a napiformes de paredes finas e lisas e que germinam tipicamente pela formação de um promicélio (basídio) com quatro células, cada qual produzindo um esterigma sobre o qual um basidiósporo é produzido e teliósporos uredinóides subreniformes com parede espessa lisa ventralmente e equinulada dorsalmente. Estudos cariológicos usando corante Giemsa e citometria de imagem demonstraram que em teliósporos uredinóides a primeira divisão da meiose ocorre nos esporos e a segunda divisão ocorre apenas depois da germinação no apressório. A proposta de examinar o status cariológico de esporos de H. vastatrix pela citometria de fluxo não foi implementada, pois dependia do prévio isolamento de protoplastos, que foi impossível com os tratamentos testados para este fungo. Fatores que afetam a freqüência e o tipo de germinação (micelial versus apressorial) dos teliósporos uredinóides foram investigados e analisados. A maior proporção de germinação foi obtida no escuro entre 22 e 26 oC e a formação de apressorios foi obtida sob temperaturas amenas próximo de 22 oC no escuro. Teliósporos foram coletados em várias localidades em Minas Gerais, confirmando o relato, até então duvidoso, de ocorrência deste tipo de esporo no Brasil. Sua ocorrência pareceu condicionada a mudanças em condições de umidade em períodos de temperatura mais baixa no inverno e na primavera. Uma significativa proporção dos teliósporos apresentou um padrão de germinação anormal com um número de células no promicélio variando de três a sete, com ou sem produção de esterigmas e basidiósporos. O conjunto de observações efetuadas neste trabalho pode contribuir para explicar a ocorrência de um número relativamente grande de raças reconhecido para H. vastatrix que seria de acordo com o conceito usualmente aceito funcionalmente estritamente assexuado, produzindo basidiósporos não funcionais. A existência de um processo adicional para promoção da recombinação genética poderia explicar o aparecimento de novas raças e a continuada quebra de resistência em novas variedades de cafeeiro.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-12-02T13:12:59Z No. of bitstreams: 1 Gabriela del Carmen Calderon Estrada.pdf: 1790318 bytes, checksum: 59a9ef3279b882660365d852f8a0f3a1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-02T13:12:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gabriela del Carmen Calderon Estrada.pdf: 1790318 bytes, checksum: 59a9ef3279b882660365d852f8a0f3a1 (MD5) Previous issue date: 2015-12-11 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The rust, caused by the fungus Hemileia vastatrix Berk & Br., is the main disease of coffee (Coffea arabica L.) in Latin America. The principal damage caused is defoliation and death of lateral branches, which causes premature fruit losses. Guatemala produces coffee in 270,000 hectares, and near of the 82% is cultivated with susceptible varieties to coffee rust races. Coffee rust epidemic is a complex process based on the relationships between the environment, plant growth, and crop practices. The objective of this study was to develop models for risk analysis based on decision trees in order to understand how cropping patterns determine the progress of the disease in Guatemala to identify and prioritize the important factors. For this work were used 1215 observations, obtained in 35 coffee plots from April 2013 to December 2014. The modeled variable was the leaf severity. Using the CHAID (Chi-Square Automatic Interaction Detection) algorithm were developed two decision trees. The first predicts leaf severity in plots where the producer does not follow the disease, while the second requires rust monitoring 28 days before the date of the severity risk analysis. In the trees, the main predictor was the fungicide spraying per year. The following predictor variables on the tree were related with the tissue availability for new infections, which also stimulates microenvironments with high relative humidity, warm temperatures, and foliar wetness prevalence. Only for non-monitoring tree was included the average rainfall, which suggests that climate relationship with the epidemic, is at microclimate level. The tree for plots with disease monitoring includes in all levels the 28 before severity and replaced management or climate variables getting similar predicted values. The accuracy of the tree for monitored plots was 65.85% with an estimated accuracy by cross validation of 73.34%, and for the monitored plots, the accuracy was 62.53% and 68.54%, respectively. Risk analysis models prove to be tools of support in making management decisions to implement the control of coffee rust and allow list in order of importance, management practices, and climatic factors that influence disease severity in different crop patterns. / A ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo Hemileia vastatrix Berk & Br., é a principal doença do cafeeiro (Coffea arabica L.) na América Latina. O principal dano é desfolha e morte de ramos laterais, que provocam perdas prematuras de frutos. A Guatemala produz café em 270.000 hectares, sendo que cerca de 82% é cultivado com variedades suscetíveis às raças de ferrugem. A epidemia da ferrugem é um processo complexo baseado nas relações entre ambiente, crescimento da planta, e práticas de manejo. O objetivo deste estudo foi desenvolver modelos para análise de risco baseados em árvores de decisão, a fim de entender como os padrões de cultivo determinam o progresso da doença na Guatemala para identificae e priorizar os fatores importantes. Para este trabalho foram utilizadas 1215 observações, obtidas de 35 lavouras de abril de 2013 a dezembro de 2014. A variável modelada foi a severidade da folha. Utilizando o algoritmo CHAID (Chi-Quadrado Detecção Automatic Interaction), foram desenvolvidas duas árvores de decisão. A primeira árvore permite prever a severidade na folha nas parcelas em que o produtor não realiza acompanhamento da doença, enquanto a segunda requer o monitoramento da ferrugem 28 dias antes da data da análise de risco da severidade. Nas árvores, o principal preditor foi o número de aplicações de fungicida por ano. As seguintes variáveis preditoras na árvore foram relacionadas com disponibilidade de tecido para novas infecções, que podem favorecem a formação de microambientes com alta umidade relativa, temperaturas amenas e prevalência da molhadura folhar. Apenas para a árvore de não monitoramento foi incluída a variável da precipitação média, o que sugere que a relação do clima é em nível microclimático. A árvore com monitoramento inclui em todos os níveis a severidade aos 28 dias antes e substitui variáveis de manejo ou clima, estimando valores semelhantes. A acurácia da árvore para lavouras não monitoradas foi de 65,85% com uma estimativa de acurácia por validação cruzada de 73,34%. Na árvore para lavouras monitoradas a acurácia foi de 62,53% e 68,54%, respectivamente. Os modelos de análise de risco demonstram ser ferramentas de apoio na tomada de decisões de manejo para implementar o controle da ferrugem do cafeeiro e possibilitam listar, em ordem de importância, as práticas de manejo e fatores climáticos que influenciam na severidade da doença em diferentes padrões do cultivo.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-25T07:11:38Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1723831 bytes, checksum: cf2815d4e6da475d371abe6dea9ab071 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-25T07:11:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1723831 bytes, checksum: cf2815d4e6da475d371abe6dea9ab071 (MD5) Previous issue date: 2015-02-19 / O café constitui um dos principais produtos agrícolas mundiais devido às grandes rendas econômicas que gera nos países onde é cultivado. Nesta cultura, comumente podemos observar pragas como Brevipalpus phoenicis e doenças como Hemileia vastatrix que podem ocasionar grandes perdas econômicas, caso medidas de controle não sejam tomadas. O controle destas pragas e doenças usualmente é feito com a aplicação de agrotóxicos, que podem ocasionar problemas tanto nas pragas que se deseja atingir (resistência) como nos inimigos naturais que podem ser afetados indiretamente. O controle biológico torna-se uma opção viável para a diminuição do uso de agrotóxicos e o ácaros predadores fitoseídeos são objeto de muitas pesquisas sobre sua capacidade de explorar diversos recursos na sua alimentação e sua aplicabilidade nesse tipo de controle. O predador Ricoseius loxocheles (Ácari: Phytoseiidae) tem a capacidade de se alimentar e carregar esporos de ferrugem do cafeeiro e por ser membro de uma família de ácaros predadores possui potencial para agente de controle biológico. No entanto, pouca informação existe sobre sua função ecológica no sistema cafeeiro. Nesse contexto, o objetivo do estudo foi determinar a capacidade predatória de R. loxocheles sobre B. phoenicis e o desempenho do fitoseídeo em diferentes fontes alternativas de alimento avaliando sua sobrevivência e reprodução. Os resultados mostraram que o ácaro B. phoenicis não representa uma presa potencial para o fitoseídeo R. loxocheles, já que o sucesso reprodutivo desse ácaro predador foi negativo quando unicamente tinha a presença da praga, ocasionando a morte do fitoseídeo. O crescimento populacional (ri) de R. loxocheles foi positivo em mudas de café infectadas por ferrugem. Adicionalmente, foi demonstrado que o ácaro aproveita diversos recursos alimentícios alternativos, como ferrugem de café, ferrugem de trevo e o pólen de taboa para seu sucesso reprodutivo. Das fontes testadas, apenas o pólen apícola foi o único recurso não viável que reduziu a oviposição e ocasionou a sua morte. / Coffee is one of the main crops in the world, due to the large economic importance that generates in the countries where it is cultivated. This culture is commonly attacked by some pests and diseases, such as Brevipalpus phoenicis and Hemileia vastatrix, respectively, that can produce great economic losses if a not appropriate control is used. The control of these pests and diseases is usually done applying chemicals products that can cause several problems: the target pests can become resistant and the natural enemies can be also indirectly affected. So, biological control becomes a viable option for the reduction of pesticide use, considering that the phytoseiids has been the subject of many studies due their ability to explore various food sources. The phytoseiid mite Ricoseius loxocheles (Acari: Phytoseiidae) has the ability to feed and carry coffee leaf rust spores. However, the little information about this behavior limits to understand their role in agricultural systems, especially in the coffee crops. Then, the objective of this study was to evaluate the predatory ability of R. loxocheles on B. phoenicis and the performance (survival and reproduction) of this phytoseiid on different food sources. The results showed that B. phoenicis does not represent a potential prey for R. loxocheles, considering that the reproductive success of this predatory mite was negative when this pest was the diet, resulting in the death of the phytoseiid. Population growth (ri) of R. loxocheles was positive on coffee plants infected by the rust, but the mite had also good population performance on several alternative food resources, such as coffee rust, rust clover and the cattail pollen for their reproductive success. However, from all alternative food sources tested bee pollen was the only non-viable resource that reduced oviposition of R. loxocheles and caused the death of the phytoseiid mite.

Made available in DSpace on 2015-03-26T12:42:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1536759 bytes, checksum: edfc663b086d5a927204773326c9803e (MD5) Previous issue date: 2013-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Coffee leaf rust, caused by the biotrophic fungus Hemileia vastatrix, is the main phytosanitary problem of the coffee plant. The disease may cause yield losses ranging from 35 to 50% if control measures are not implemented. During the interaction with the host plant, rust fungi secrete a variety of effector proteins that modify the structure and function of the host cell allowing the biotrophic interaction. Some of these effector proteins, known as avirulence proteins (Avr), are recognized by plant proteins encoded by resistance genes, which triggers a defense response against pathogen infection. At least nine dominant genes (SH1 to SH9) that confer resistance to coffee leaf rust have been genetically identified, but despite many years of research on this pathosystem, the complementary Avr genes of H. vastatrix have not yet been identified or characterized. One approach that can be used for this purpose is to conduct an transcriptome and bioinformatics analyses in order to identify candidate genes of H. vastatrix that fulfill a set of specific criteria common to effector proteins, and their validation by conducting functional assays for effector activities. Therefore, the objectives of this study were: (i) to identify genes of H. vastatrix that encode proteins secreted during the germination of urediniospores as well as during the biotrophic interaction with the coffee plant, (ii) to express the effector gene candidates from H. vastatrix in the yeast secretion trap system (YST) in order to obtain biological confirmation of the secretion prediction made by bioinformatics tools, (iii) to analyze the genomic structure of a select group of effector gene candidates, (iv) to perform expression analysis of the identified candidates during different stages of infection; and (v) to establish a protocol for transient expression of H. vastatrix secreted proteins in coffee leaves based on the Type III Secretion System of Pseudomonas syringae pv. garcae. Initially, the secretome of germinated urediniospores of H. vastatrix was characterized by constructing a cDNA library from mRNA isolated from urediniospores germinated in vitro during 16 hours. After analysis of the ESTs using bioinformatics tools, 146 ORFs that encode secreted proteins were selected. Annotation of these proteins showed that 20% of the secretome from germinated urediniospores consists of hydrolytic enzymes and that most (67%) of the identified secreted proteins have unknown function. From the latter group of sequences, 35 complete ORFs encoding proteins sharing features with effectors from filamentous fungi and named H. vastatrix effector candidates (HvECs) were selected for further analysed. The genomic sequences of 22 of these HvECs were characterized, confirming the ORFs predicted by bioinformatics. The secretion of eight selected HvECs was confirmed in yeast and their expression analysis revealed a differential expression, which possibly occurs in coordination with the morphological changes of the pathogen during the early stages of infection. The secretome of H. vastatrix during a compatible plant-rust interaction was also characterized by a combination of Sanger sequencing and 454 pyrosequencing. This integrated approach allowed the massive sequencing of a substantial number of sequence tags (ESTs) of genes expressed at four different times during the biotrophic interaction: 48 hours, 72 hours, 9 days and 12 days after inoculation of coffee leaves with H. vastatrix. After bioinformatics analyses of these ESTs, 75 HvECs were selected and an expression analyses based on RT- PCR confirmed the fungal origin for 62 of them. 22 of these HvECs are preferentially expressed during the interaction of the fungus with the coffee plant and show distinct patterns of expression along the progress of infection. Using the pEDV system and the Type III Secretion System of P. syringae pv. garcae it was established a protocol to express transiently secreted proteins from H. vastatrix in coffee leaves established. Transient expression of HvEC-016 inside the cytoplasm of coffee plants carrying the rust resistant gene SH1, triggered a plant defense response indicating that there may have occurred a recognition of the HvEC-016 effector protein mediated by the R protein encoded by SH1. The catalog of effector gene candidates for H. vastatrix expressed during both urediniospore germination and the interaction with the coffee plant and the transient assay established in this study is an important plataform to identify additional avirulence genes from Hemileia vastatrix. / A ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix, é o principal problema fitossanitário da cafeicultura, podendo ocasionar perdas da ordem de 35 a 50% da produção se não forem implantadas medidas de controle. Durante a interação com a planta hospedeira, os fungos causadores de ferrugens secretam um arsenal de proteínas efetoras que modificam a estrutura e a função da célula hospedeira, permitindo o estabelecimento da interação biotrófica. Algumas dessas proteínas efetoras, denominadas proteínas de avirulência (Avr), são reconhecidas por proteínas codificadas por genes de resistência, o que desencadeia uma resposta de defesa da planta contra a infecção pelo patógeno. Já foram identificados geneticamente pelo menos nove genes dominantes (SH1 a SH9) que conferem resistência à ferrugem do cafeeiro, no entanto, apesar de muitos anos de pesquisa neste patossistema, os genes Avr complementares de H. vastatrix ainda não foram identificados ou caracterizados. Uma abordagem que pode ser realizada com esta finalidade é a análise do transcriptôma e de bioinformática para identificar genes candidatos de H. vastatrix que cumpram uma lista de critérios específicos em banco de dados de sequências, seguida da validação por meio de ensaios funcionais para atividades de efetores. Diante do exposto, os objetivos desse estudo foram: (i) identificar genes de H. vastatrix que codificam proteínas secretadas, expressas durante a germinação dos urediniósporos e também durante a fase biotrófica da interação com o cafeeiro; (ii) expressar genes candidatos a efetores de H. vastatrix, utilizando o sistema armadilha de secreção em levedura YST (Yeast Secretion Trap) para confirmação biológica da predição de secreção realizada por ferramentas de bioinformática; (iii) analisar a estrutura genômica dos genes candidatos a efetores selecionados; (iv) efetuar a análise da expressão temporal dos genes identificados durante as diferentes fases da patogênese; (v) estabelecer um protocolo de expressão transiente de proteínas secretadas de H. vastatrix em folhas de cafeeiro, com base no Sistema de Secreção Tipo III de Pseudomonas syringae pv. garcae. Inicialmente, caracterizou-se o secretoma de urediniósporos germinados de H. vastatrix por meio da construção de uma biblioteca de cDNA a partir de mRNA isolado de urediniósporos germinados in vitro por 16 horas. Após análises das sequências por ferramentas de bioinformática, foram selecionadas 146 ORFs que codificam proteínas secretadas. Durante a anotação dessas sequências constatou-se que 20% do secretoma de urediniósporos germinados são constituídos por enzimas hidrolíticas e que a maioria (67%) das proteínas secretadas identificadas possui função desconhecida. A partir dessas sequências foram selecionadas 35 ORFs completas que codificam proteínas com características comuns aos efetores de fungos filamentosos, denominados genes candidatos a efetores de H. vastatrix (HvECs H. vastatrix effector candidates). Desses, 22 HvECs tiveram suas sequências genômicas caracterizadas, confirmando as ORFs preditas por bioinformática. A secreção de oito HvECs selecionados foi comprovada em levedura, e sua expressão diferenciada, que possivelmente ocorre com as mudanças morfológicas do desenvolvimento do patógeno nos estágios inicias de infecção, foi comprovada por meio RT-qPCR. Posteriormente, caracterizou-se o secretoma de H. vastatrix expresso durante uma interação compatível com o cafeeiro, por meio da combinação de sequenciamento Sanger e pirossequenciamento 454. Esta abordagem integrada permitiu o sequenciamento massivo de um substancial número de etiquetas de sequências expressas (ESTs) em folhas de café infectadas com H. vastatrix, amostradas em quatro tempos diferentes durante a fase biotrófica da interação: 48 horas, 72 horas, 9 dias e 12 dias após a inoculação. Após análises de bioinformática foram selecionados 75 genes e as análises de RT-PCR confirmaram a origem fúngica de 62 genes HvECs. Desses, 22 HvECs são preferencialmente expressos durante a interação com o cafeeiro, apresentando padrões distintos de expressão durante a fase biotrófica da interação. Adicionalmente, desenvolveu-se um protocolo de expressão transiente de proteínas secretadas de H. vastatrix em folhas de cafeeiro, por meio do sistema pEDV e do Sistema de Secreção Tipo III de P. syrigae pv. garcae. A expressão transiente do gene HvEC-016 no citoplasma de cafeeiros resistentes à ferrugem, portadores do gene SH1, desencadeou uma resposta de defesa das plantas, indicando que pode ter ocorrido o reconhecimento da proteína efetora HvEC-016 mediada pela proteína R codificada pelo gene SH1. Esse sistema de expressão transiente e o catálogo de genes candidatos a efetores de H. vastatrix expressos tanto durante a germinação dos urediniósporos como na interação com o cafeeiro, disponibilizados por esse estudo, constituem uma importante plataforma para a identificação de outros genes de avirulência de Hemileia vastatrix.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:39:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2656828 bytes, checksum: 8bc70c0429aa62c04a9679cf9f1486b7 (MD5) Previous issue date: 2010-07-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / In order to support the breeding programs coffee that to aim to obtain cultivars resistant to rust (Hemileia vastatrix), this work aimed to study the resistance inheritance of Híbrido de Timor UFV 443-03 and identify molecular markers linked characterized genes. To study the inheritance were evaluated three populations originated from cross the Híbrido de Timor UFV 443-03 resistant parent and Catuaí Amarelo (UFV 2148-57) susceptible cultivar. These plants analyzed, 243 correspond to an F2 population of 114 susceptible backcrossing (BCs) and 87 resistant backcrossing (BCr). Inoculation was performed with a spore suspension (2mg/mL) isolated from the Race I of H. vastatrix in leaf discs, with three replicates for the F2 and RCs, and two for RCr. Plants of the Catuaí Amarelo UFV 2148-57 were susceptible in all inoculations, while the Híbrido de Timor UFV 443-03, the plant F1 and the BCr plants were resistant. Segregation analysis of F2 populations obtained two significant cases, the resistance of a coffee Híbrido de Timor UFV 443-03 the H. vastatrix was governed by two independent and dominant genes (15:1, P = 63.10) and the other three genes is conferred by two dominant and one recessive (61:3, P = 8.87). Plants of the BCs were used to confirm the segregation patterns, which segregated in a rate of 3:1 (P = 74.56), expected segregation for two and three genes. This result demonstrate that the resistance of the Híbrido de Timor is conditioned by two dominant independent genes or three independent genes (two dominant and one recessive). As was found oligogenic inheritance (two or three genes), for confirmation and identification of molecular markers linked to genes, they were treated as QTL, and then located in link genetic map. For this, subjects in the F2 population were analyzed with a total of 110 molecular markers. As 16 markers showed distortion of Mendelian segregation expected rate, the map was constructed with 94 markers (62 AFLP, 28 SSR and 4 RAPD). Whereas a LOD score minimum of three and of 40% recombination maximum, the markers were grouped into 11 linkage groups covering a distance 964.31 cM of the genome, with 13 markers not in any of the linkage groups formed. The longest interval between two markers was 32.1 cM and 68.57% of the markers did not exceed 20 cM. The characterization and identification of QTLs were performed by simple mark and simple interval methods. Methodology of the simple mark was possible to identify markers five associated with QTLs by the methods of ANOVA, regression and maximum likelihood. These QTLs were confirmed by simple interval methodology by means of regression and maximum likelihood. Two QTLs were identified in a 2 linkage group the 0 cM marker 21a, explaining 9.6% of the phenotypic variation. The other was located in 3 linkage group to 13 cM marker 43a, explaining 9.3% of the phenotypic variation. These two QTLs confirm the number and position in the coffee resistance Híbrido de Timor UFV 443-03 H. vastatrix is governed by two independent and dominant genes, thus demonstrating the importance of genomics to identify them. It should be noted that the information obtained in this study are unique to coffee, which may be useful in breeding programs based on assisted selection and positional cloning of the gene for rust resistance. So, should provide support for future breeding populations to obtain more productive and resistance. / Com o intuito de dar suporte aos programas de melhoramento do cafeeiro que visam à obtenção de cultivares resistentes à ferrugem (Hemileia vastatrix), neste trabalho objetivou-se estudar a herança da resistência do Híbrido de Timor UFV 443-03 e identificar marcadores moleculares ligados aos genes caracterizados. Para o estudo de herança foram avaliadas três populações originadas do cruzamento entre o progenitor resistente Híbrido de Timor UFV 443-03 e o cultivar suscetível Catuaí Amarelo (UFV 2148-57). Dessas plantas analisadas, 243 correspondem a uma população F2, 114 a retrocruzamento suscetível (RCs) e 87 a retrocruzamento resistente (RCr). A inoculação foi realizada com a suspensão de esporos (2 mg/mL) do isolado da Raça I de H. vastatrix, em discos foliares, com três repetições para as populações F2 e RCs e duas para RCr. As plantas do Catuaí Amarelo UFV 2148-57 foram suscetíveis em todas as inoculações, enquanto o Híbrido de Timor UFV 443-03, a planta F1 e as plantas do RCr foram resistentes. Pela análise de segregação das populações F2, obtiveram-se duas hipóteses significativas: uma de que a resistência do cafeeiro Híbrido de Timor UFV 443-03 a H. vastatrix era governada por dois genes dominantes e independentes (15:1; P = 63,10) e a outra de que era conferida por três genes, sendo dois dominantes e um recessivo (61:3; P = 8,87). Plantas do RCs foram utilizadas para a confirmação dos padrões de segregação e segregaram na proporção de 3:1 (P = 74,56), o que era esperado para dois e para três genes. Esse resultado indicou que a resistência desse Híbrido de Timor é condicionada por dois genes dominantes independentes ou três genes independentes (dois dominantes e um recessivo). Como a herança encontrada foi oligogênica (dois ou três genes), para a confirmação e identificação de marcadores moleculares ligados aos genes, estes foram tratados como QTL e, então, localizados em mapa genético de ligação. Para isso, os indivíduos da população F2 foram analisados com um total de 110 marcadores moleculares. Como 16 marcadores apresentaram distorção da razão de segregação mendeliana esperada, o mapa foi construído com 94 marcadores (62 AFLP, 28 SSR e 4 RAPD). Considerando um LOD score mínimo de 3 e máxima recombinação de 40%, os marcadores ficaram agrupados em 11 grupos de ligação, cobrindo uma distância de 964,31 cM do genoma, e 13 marcadores não se ligaram a nenhum dos grupos formados. O maior intervalo entre dois marcadores foi de 32,1 cM, e 68,57% dos marcadores não excederam 20 cM. A caracterização e identificação de QTLs foram realizadas com o auxílio de metodologias de marca simples e intervalo simples. Pela metodologia da marca simples foi possível identificar cinco marcadores associados aos QTLs pelos métodos da ANOVA, regressão e máxima verossimilhança. Esses QTLs foram confirmados pela metodologia de intervalo simples por meio da regressão e máxima verossimilhança. Dois QTLs foram identificados, um deles no grupo de ligação 2 a 0 cM do marcador 21a, explicando 9,6% da variação fenotípica. O outro ficou localizado no grupo de ligação 3 a 13 cM do marcador 43a, explicando 9,3% da variação fenotípica. Esses dois QTLs confirmam, em número e posição, que a resistência do cafeeiro Híbrido de Timor UFV 443-03 a H. vastatrix é governada por dois genes dominantes e independentes, mostrando, assim, a importância da genômica para a identificação destes genes. Cabe salientar que as informações deste trabalho são inéditas para o caso do cafeeiro e podem ser úteis em programas de melhoramento baseado em seleção assistida e na clonagem posicional do gene de resistência à ferrugem. Assim, os dados deste estudo deverão fornecer subsídios para futuros trabalhos de melhoramento visando à obtenção de populações mais resistentes e produtivas.