The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) was identified to be involved in acidosis-induced ATP release from skeletal myocytes in vitro and from contracting muscle in vivo. My PhD studies aimed to investigate the underlying mechanism and identify the pathway for ATP release in acidosis-induced CFTR-regulated ATP release. Lactic acid (10 mM) decreased the intracellular pH of L6 skeletal myocytes to 6.87 ± 0.12 after 3 hours, and the lowered pH resulted in the elevation of ATP release from skeletal myocytes. The acidosis-induced ATP release was totally abolished by GlyH-101 (40 μM), an open-channel CFTR blocker, suggesting that CFTR was involved. The cAMP/PKA signaling pathway was involved in the CFTR-regulated ATP release from skeletal myocytes: 1). Forskolin increased the extracellular ATP and the phosphorylation of CFTR; IBMX, a phosphodiesterase inhibitor, further enhanced the forskolin-induced extracellular ATP and phosphorylation of CFTR; 2). Inhibition of PKA by its selective inhibitor KT-5720 abolished the acidosis-induced ATP release and the forskolin-induced phosphorylation of CFTR. In addition, the inhibition of Na+/H+ exchanger (NHE) by amiloride, or inhibition of Na+/Ca2+ exchanger (NCX) by its specific inhibitors SN-6 and KB-R7943 abolished the lactic-acid-induced ATP release from skeletal myocytes, indicating that NHE and NCX might be involved. Previous studies demonstrated that Connexin hemichannels and Pannexin channels were able to conduct ATP in response to stimuli. This study found that connexin 43 (Cx43) was strongly expressed on skeletal myocytes, while Pannexin 1 (Panx1) showed a strong expression in gastrocnemius muscle. Investigation of the role that Cx43 may play in acidosis-induced cAMP/PKA-activated CFTR-regulated ATP release from myocytes showed that: 1). Cx43 was immunoprecipitated with CFTR suggesting a physical interaction; 2). The opening of Cx hemichannels was increased by lactic acid and this lactic-acid-induced opening was inhibited by CFTRinh-172, suggesting the mediation of CFTR; 3). Inhibition of Cxs and Panxs with carbenoxolone abolished the acidosis-induced ATP release; moreover, specific silencing of the Cx43 gene using siRNA decreased both basal and acidosis-induced ATP release, suggesting that Cx43 was involved; 4). Overexpression of CFTR alone did not elevate the acidosis-induced ATP release, while overexpression of Cx43 alone doubled the acidosis-induced ATP, and co-overexpression of CFTR and Cx43 further elevated the acidosis-induced ATP release, supporting the concept that Cx43 functionally interacted with CFTR to induce the acidosis-induced ATP release. Panx1 was studied in native skeletal muscle, and found to be coimmunoprecipitated with CFTR. Inhibition of Panxs with gadolinium or probenecid abolished the muscle-contraction-induced ATP release, while inhibition with carbenoxolone or quinine reduced it to less than 10% of control, suggesting that Panx1 may be involved in the acidosis-induced ATP release during muscle contraction. All the in vitro and in vivo studies suggested that Cxs and Panx were involved in the acidosis-induced CFTR-regulated ATP release from skeletal myocytes and skeletal muscle. / published_or_final_version / Physiology / Doctoral / Doctor of Philosophy

<p>Liver cancer is a devastating disease that is the 5th most common cancer in men, 7th most common cancer in women, and the 3rd leading cause of cancer-related mortality. This disease arises from multiple etiological factors, including hepatitis viruses, environmental toxins, alcohol abuse, and metabolic syndrome, which induce a state of chronic inflammation. This diseased liver tissue background is a drastically different microenvironment from the healthy liver, especially with regards to immune cell prevalence and presence of mediators of immune function. It has been well-established that this altered tissue background contributes significantly to the tumorigenic process, yet its effects on the progression of the disease are more poorly understood. </p><p>To better understand the consequences of liver disease on tumor growth and the interplay with its microenvironment, we first utilized two standard methods of fibrosis induction and orthotopic implantation of tumors into the inflamed and fibrotic liver to mimic the liver condition in human HCC patients, and examined the immune infiltrate. Compared to non-diseased controls, tumor growth is significantly enhanced under fibrotic conditions. The immune cells that infiltrated the tumors are also drastically different, with decreased proportions of natural killer cells but greatly increased numbers of immune-suppressive CD11b+ Gr1hi myeloid cells in both models of fibrosis. In addition, there are model-specific differences: increased proportions of CD11b+ myeloid cells and CD4+ CD25+ T-cells are found in tumors in the bile duct ligation model but not in the carbon tetrachloride model. Importantly, the skewed immune infiltration into the tumor, while having some commonalities with the non-tumor tissue, had several distinct, tumor-specific populations. Induction of fibrosis also alters the cytokine production of implanted tumor cells, which could have far-reaching consequences on the immune infiltrate and its functionality. Taken together, this work demonstrates that the combination of fibrosis induction with orthotopic tumor implantation results in a markedly different tumor microenvironment and tumor growth kinetics. </p><p>Appreciating that the altered immune microenvironment dramatically shifts tumor progression, we sought to further explore the effects of individual inflammatory mediators on the development of the disease. Interleukin 18 (IL-18) is an inflammatory cytokine that is markedly increased in the circulation of patients with HCC correlated with poor prognosis. However, the precise role for IL-18 in HCC remains unclear, with reports presenting both pro- and anti-tumorigenic activities. To answer this question definitively, we interrogated in more detail the expression profiles of IL-18 in tissue specimens from HCC patients and conducted experimentation using multiple clinically relevant mouse models to explore the functional role of this cytokine in the context of HCC. Our results indicate that IL-18 exerts a tumor-suppressive effect mediated in large part by alterations in survival and functionality of T-lymphocytes which infiltrated the tumor microenvironment. This tumor-suppressive effect is however dependent upon the inflammatory milieu: In the absence of an inflammatory environment, whether from a chemical carcinogenesis model or a fibrosis induction model, loss of IL-18 signaling does not affect tumor growth. This effect is also stage-dependent. Taken together, our findings establish a tumor-suppressive role for IL-18 in established HCC and provide a mechanistic explanation for the complex relationship between its expression pattern and HCC prognosis. </p><p>In summary, this work demonstrates a dramatic shift in the microenvironment of developing HCC tumors in the presence of chronic inflammatory stimuli. This microenvironment, which more accurately models the situation in which tumors develop and progress in patients, alters the presence and functionality of many immune mediators. In particular, IL-18 signaling is a powerful mediator of tumor progression, however observation of its functionality is dependent on an inflammatory context. This work provides new insight into the complex processes underlying HCC tumor progression, and emphasizes the necessity for more accurate modeling of HCC progression in mice which takes into account the drastic changes in the tissue caused by chronic liver disease.</p> / Dissertation

M. Tech. Pharmaceutical Sciences / Bacteria are present in natural environments and can develop into biofilms. Mucus-like extracellular matrix produced by biofilms provides protection to biofilm formers by inhibiting antimicrobial penetration and de-activating antimicrobial molecules, while allowing strong attachment onto surfaces. Biofilm development is associated with otitis media and cystic fibrosis. In this study, selected biofilm-formers implicated in otitis media and cystic fibrosis, Pseudomonas aeruginosa and Moraxella catarrhalis, were used to evaluate the effect of combinations of mucoactive substances and antibiotics against their biofilms. Microtiter-plate assay and optical density measurements were used to evaluate antimicrobial and antibiofilm activities. Confocal scanning laser microscopy was used to visualise the effect of selected treatments against biofilms.

Η παρουσία λευκωματουρίας αποτελεί δυσμενή προγνωστικό παράγοντα για τους ασθενείς με σπειραματονεφρίτιδα (ΣΝ) χωρίς εντούτοις αυτό να επιβεβαιώνεται πάντα. Συνεπώς, είναι επιβεβλημένη η εύρεση περισσότερο ειδικών προγνωστικών δεικτών που να αντανακλούν τη διαδικασία επούλωσης της βλάβης ή εξέλιξής της σε ίνωση. Σκοπός, της παρούσας μελέτης ήταν η αναγνώριση πρώιμων δεικτών εξέλιξης της νεφρικής βλάβης σε ασθενείς με σημαντικού βαθμού λευκωματουρία. Ως τέτοιοι προγνωστικοί δείκτες μελετήθηκαν η έκφραση της τρανσγελίνης (SM22) και της τρανσγλουταμινάσης–2 (TG2). Η SM22 είναι μια πρωτεΐνη που εκφράζεται στα λεία μυϊκά κύτταρα και αποτελεί δείκτη της επιθήλιο-μεσεγχυματικής μετάπτωσης. Η TG2 αποτελεί ένα ένζυμο που επάγει τη νεφρική ίνωση μεταβάλλοντας την ομοιόσταση της εξωκυτταρίου θεμέλιας ουσίας. Η έκφραση της SM22 μελετήθηκε με τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας και του ανοσοφθορισμού, σε νεφρικές βιοψίες 67 ασθενών με διάφορους τύπους ΣΝ, και συσχετίστηκε με την κλινική τους πορεία μετά πάροδο πενταετούς παρακολούθησης. Επιπλέον, εξετάστηκε με τη μέθοδο του συνεντοπισμού, κατά πόσον η έκφραση της SM22 συμπίπτει με αυτήν της α–ακτίνης των λείων μυϊκών ινών (α–SMA). Η έκφραση της TG–2 μελετήθηκε με ανοσοφθορισμό σε νεφρικές βιοψίες από 32 ασθενείς με μεμβρανώδη νεφροπάθεια (ΜΝ). Όλοι οι ασθενείς με ΜΝ έλαβαν αγωγή με κορτικοειδή και κυκλοσπορίνη για 24 μήνες και σε 14 από αυτούς διενεργήθηκε επαναληπτική βιοψία και έγινε περαιτέρω μελέτη της TG2. Ως ομάδα ελέγχου για την έκφραση των παραπάνω μορίων χρησιμοποιήθηκαν τομές από υγιείς περιοχές νεφρών. Από τους 67 ασθενείς που μελετήθηκε η έκφραση της SM22, οι 46 διατήρησαν σταθερή νεφρική λειτουργία. Στις βιοψίες ελέγχου η έκφραση της SM22 περιορίστηκε στο τοίχωμα των αγγείων ενώ στους ασθενείς με ΣΝ επεκτάθηκε εντός των σπειραμάτων και του διάμεσου χώρου. Η SM22 βρέθηκε να σχετίζεται με το βαθμό σπειραματικής σκλήρυνσης και ίνωσης του διάμεσου χώρου, με το βαθμό μεσαγγειακής υπερπλασίας και την έκβαση της νεφρικής λειτουργίας. Η μελέτη συνεντοπισμού της SM22 και της α-SMA ανέδειξε περιοχές όπου οι δύο πρωτεΐνες εκφράζονταν ταυτόχρονα ενώ σε άλλες κάθε πρωτεΐνη εκφραζόταν χωριστά. Κατά το διάστημα παρακολούθησης οι 22 από τους 32 ασθενείς με ΜΝ παρουσίασαν σταθερή νεφρική λειτουργία. Η έκφραση της TG2 βρέθηκε αυξημένη στις βιοψίες των ασθενών με ΜΝ σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Η έκφραση της TG2 στις βιοψίες διάγνωσης ήταν περισσότερο αυξημένη στους ασθενείς με πιο έντονη διάμεση ίνωση και σπειραματική σκλήρυνση. Τέλος, η TG2 βρέθηκε αυξημένη στους περισσότερους ασθενείς στην επαναληπτική βιοψία, ενώ οι ασθενείς που παρουσίαζαν έντονη αύξηση της διάμεσης ίνωσης στην επαναληπτική βιοψία είχαν και εντονότερη έκφραση της TG2 κατά τη διάγνωση της νόσου. Συμπερασματικά, η έκφραση της SM22 βρέθηκε αυξημένη στο νεφρικό ιστό ασθενών με ΣΝ, ενώ η μελέτη συνεντοπισμού της SM22 και της α–SMA ανέδειξε την παρουσία πιθανώς διαφορετικών υποπληθυσμών μυοϊνοβλαστών. Όσον αφορά την TG2, η έντονη έκφραση της στο νεφρικό ιστό ασθενών με ΜΝ, η οποία καθίσταται εντονότερη μετά τη χορήγηση ανοσοκατασταλτικής αγωγής, υποδηλώνει τη συμμετοχή της TG2 στους μηχανισμούς βλάβης και εξέλιξης της ΜΝ. Επιπρόσθετα, η πρώιμη ανίχνευση της TG2 πιθανόν να έχει ιδιαίτερη σημασία στη ΜΝ καθώς η αυξημένη έκφρασή της φαίνεται να προηγείται της διάμεσης ίνωσης. / It is well established that albuminuria is an unfavorable prognostic factor for patients with various types of glomerulonephritis (GN), however, this is not observed in all patients. It is therefore important to identify more specific prognostic markers that reflect the healing process of injury or the progression to fibrosis. The aim of this study was to identify early markers of progression to renal injury in patients with significant degree of albuminuria. As such markers the expression of transgelin (SM22) and transglutaminase–2 (TG2) was studied. SM22 is expressed specifically in smooth muscle cells and is an early marker of epithelial to mesenchymal transition. TG–2 is an enzyme that contributes to renal scarring through altering extracellular matrix homeostasis. SM22 was studied in 67 patients with various kinds of GN and a 5 year follow up. SM22 was identified in kidney sections at the time of diagnosis using immunohistochemistry and immunofluorescence. SM22 expression was examined concerning its correlation with the clinical course of GNs. The expression of alpha smooth muscle actin (a–SMA) and co-localization with SM22 was also investigated. TG2 expression was studied by immunofluorescence in kidney sections from 32 patients with MN. These MN patients were subsequently treated by combination of cyclosporine and prednisolone for 24 months with a repeat biopsy taken in 14. Kidney sections from the normal part of kidneys were used as normal controls for the expression of the aforementioned molecules. Forty six out of 67 patients, that transgelin was studied, showed stable renal function. In control biopsies SM22 and a-SMA were restricted to vascular wall whereas in patients with GN expression was extended within glomeruli and the interstitium. SM22 expression correlated to the degree of glomerular sclerosis and interstitial fibrosis, to the degree of mesangial proliferation and renal function outcome. Double staining for co-localization of both SMM22 and a-SMA showed that in some areas of kidney tissue both proteins were identified whereas in other areas the expression of either SM22 or a-SMA was predominant. Twenty two out of 32 patients with MN showed stable renal function. TG2 immunostaining was increased in sections from patients with MN compared to healthy controls. TG2 at diagnosis was more intense in patients with more severe interstitial fibrosis and advanced glomerular sclerosis. TG2 significantly increased in most patients in the repeat biopsies whereas patients that showed a marked increase in interstitial fibrosis in the repeat biopsy had significantly more TG2 expression in the first biopsy. In conclusion, intense SM22 expression was observed in the renal tissue of patients with different types of GN. The co-localization study of SM22 and a–SMA suggests that different subpopulations of myofibroblasts might be involved in the development of kidney injury. As far it concerns TG2, its’ expression is increased in MN patients and continues to increase despite treatment which is suggestive of its’ involvement in the development and progression of renal scarring. Moreover, early detection of TG2 might be of value in MN since increased TG2 production seems to precede extensive interstitial fibrosis.

Σκοπός της συγκεκριμένης ερευνητικής εργασίας ήταν η αποσαφήνιση του ρόλου της αλβουμίνης στην πρόκληση νεφρικής ίνωσης, διαμέσου του συστήματος ΕΤ-1/ΝΟ. Για το λόγο αυτό πραγματοποιήθηκαν in vitro πειράματα, στα οποία χρησιμοποιήθηκαν ΗΚ-2 κύτταρα και διερευνήθηκε η επίδραση της αλβουμίνης στην αλλαγή της μορφολογίας, στην προσκόλληση, στη μετανάστευση, στην παραγωγή ΝΟ και cGMP, στην έκφραση των et-1, etr-a, etr-b, enos και inos και τη συσσώρευση των αντίστοιχων πρωτεϊνών, καθώς επίσης και των πρωτεϊνών τουμπουλίνης και ακτίνης και τέλος στην ενζυμική δραστικότητα της μεταλλοπρωτεϊνάσης MMP-2. Προέκυψε ότι η αλβουμίνη τροποποιεί την έκφραση των γονιδίων et-1 και των υποδοχέων της etr-a και etr-b, των συνθετασών του ΝΟ, enos και inos, τη συσσώρευση των αντίστοιχων πρωτεϊνών, του cGMP, καθώς και του παραγόμενου NO. Επίσης, η αλβουμίνη δεν επηρεάζει τη συσσώρευση της ακτίνης, ενώ προκαλεί ελάττωση της συσσώρευσης της τουμπουλίνης και αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού. Τέλος, επάγει την ενζυμική δραστικότητα της MMP-2 και τον πολλαπλασιασμό, ενώ εμποδίζει τη μετανάστευση και την προσκόλληση των HK-2. / The aim of this research was the elucidation of the role of albumin in the induction of renal fibrosis, through the activation of the ET-1/NO system. We performed in vitro experiments using HK-2 cells (human proximal tubular epithelial cells) and we studied the morphological alterations, cell adhesion, migration, production of NO and cGMP, expression of et-1, etr-a, etr-b, enos and inos and the accumulation of the subsequent proteins, as well as tubulin and actin. Finally we studied the enzymic activity of metalloproteinase MMP-2. Albumin was found to alter the expression of et-1, etr-a, etr-b and enos and the accumulation of the subsequent proteins. Moreover, it affects the amount of the synthesized and secreted cGMP and NO, reduces the accumulation of tubulin, while having no effect on the accumulation of actin and participates in the reorganization of the cytoskeleton. Furthermore, albumin alters the enzymic activity of MMP-2, induces cell proliferation and inhibits the adhesion and migration of the HK-2 cells.

Οι σπειραματονεφρίτιδες (ΣΝ) αποτελούν μια ομάδα νοσημάτων του σπειράματος ανοσολογικής αιτιολογίας που σε πολλές περιπτώσεις οδηγούν στην πλήρη καταστροφή του νεφρικού παρεγχύματος με αποτέλεσμα τη νεφρική ίνωση και την ανάγκη υποκατάστασης της νεφρικής λειτουργίας με μεθόδους εξωνεφικής κάθαρσης. Τα τελευταία χρόνια έχει σημειωθεί σημαντική πρόοδος στην ανίχνευση των μοριακών μηχανισμών που οδηγούν στη νεφρική ίνωση. Κεντρικό ρόλο στη διαδικασία αυτή φαίνεται να διαδραματίζει το Smad σηματοδοτικό μονοπάτι που διαμεσολαβεί τα σήματα του TGF-β στα νεφρικά κύτταρα. Ο ρόλος του TGF-β στη νεφρική βλάβη είναι πλέον καλά τεκμηριωμένος. Αντίθετα ελάχιστα είναι γνωστά για την έκφραση και τη λειτουργία του Smad σηματοδοτικού μονοπατιού στις ανθρώπινες ΣΝ. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της έκφρασης των παραγόντων pSmad2/3, p300, Sp1, Smad7 και Ski (μορίων που συμμετέχουν στο Smad σηματοδοτικό μονοπάτι) σε νεφρικές βιοψίες ασθενών με ΣΝ και η ανίχνευση της δράσης τους όσον αφορά την παθογένεση και την εξέλιξη της νεφρικής βλάβης. Χρησιμοποιήθηκαν 157 βιοψίες ασθενών με ΣΝ και 15 φυσιολογικά νεφρικά δείγματα από ασθενείς που είχαν υποβληθεί σε νεφρεκτομή για καρκίνο του νεφρού. Οι σπειραματονεφρίτιδες κατηγοριοποιήθηκαν σε πρωτοπαθείς (n=91) και δευτεροπαθείς (n=66) ή υπερπλαστικές (n=86) και μη υπερπλαστικές (n=71). Η μελέτη της έκφρασης των pSmad2/3, p300, Sp1, Smad7 και Ski έγινε με τη χρήση ανοσοϊστοχημικής μεθόδου. Έγιναν συσχετίσεις με κλινικά δεδομένα των ασθενών (κρεατινίνη ορού και λεύκωμα ούρων 24ώρου), καθώς και δείκτες ιστολογικής βλάβης (σπειραματοσκλήρυνση, διάμεση ίνωση, σωληναριακή ατροφία και διάμεση φλεγμονή). Παρατηρήθηκε πολύ μεγάλη αύξηση της έκφρασης των pSmad2/3, Sp1 και p300 σε όλα τα σπειραματικά κύτταρα των ΣΝ σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Επίσης, αυξήθηκε η έκφραση του πυρηνικού Smad7 στις υπερπλαστικές κυρίως ΣΝ με ταυτόχρονη εξάλειψη της κυτταροπλασματικής έκφρασής του σε όλες τις ΣΝ και παράλληλη μείωση της έκφρασης του Ski. Όσον αφορά τα σωληνάρια, στα εγγύς παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης των pSmad2/3, Sp1 και p300 σε όλες τις ΣΝ και αύξηση του πυρηνικού Smad7 στις υπερπλαστικές, ενώ στα άπω και τα αθροιστικά παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης του pSmad2/3 και του πυρηνικού Smad7 με ταυτόχρονη μείωση του κυτταροπλασματικού Smad7. Το Ski παρουσίασε σημαντική μείωση της έκφρασής του στις ΣΝ σε όλους τους τύπους σωληναρίων. Η σπειραματική έκφραση των pSmad2/3, p300 και του πυρηνικού Smad7 ήταν αυξημένη στις υπερπλαστικές ΣΝ και κυρίως τις δευτεροπαθείς. Η σωληναριακή έκφραση των pSmad2/3 και Smad7 και η εγγύς σωληναριακή των p300, Sp1 και του κυτταροπλασματικού Smad7 ήταν επίσης αυξημένες στις υπερπλαστικές ΣΝ. Αντίθετα, το Ski δεν παρουσίασε διαφορές στην έκφραση μεταξύ των υπερπλαστικών και μη υπερπλαστικών ΣΝ. Ακόμη, ανιχνεύθηκαν σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ μεταξύ της έκφρσης των pSmad2/3, p300, Sp1 και Smad7 στο σπείραμα και τα εγγύς σωληνάρια. Η σπειραματική και εγγύς σωληναριακή έκφραση των pSmad2/3, Sp1 και η σπειραματική του πυρηνικού Smad7 έδειξαν να συσχετίζονται θετικά με τα επίπεδα της κρεατινίνης του ορού, ενώ η έκφραση αυτών και του p300 σε διαφόρους τύπους σωληναρίων εμφάνισαν θετική στσχέτιση με δείκτες ιστολογικής βλάβης. Τέλος η έκφραση όλων των μορίων (εκτός του Ski) ήταν συχνότατη στις στοιχειώδεις σπειραματικές βλάβες. Συμπερασματικά, το Smad σηματοδοτικό μονοπάτι φαίνεται να ενεργοποιείται στις ανθρώπινες ΣΝ. Μάλιστα, η ενεργοποίησή του αυτή πιθανώς συμβάλλει στην παθογένεση αλλά και την εξέλιξη της νεφρικής βλάβης. Μελλοντικές θεραπευτικές στρατηγικές που θα στοχεύουν στην αναστολή του μονοπατιού αυτού ίσως συμβάλλουν στην παρεμπόδιση της εξέλιξης και τη θεραπεία των ανθρωπίνων ΣΝ. / -

Epithelial sodium channels (ENaC) are located throughout the epithelial lining of the respiratory tract and play a crucial role in ion and fluid homeostasis of the lungs. Increasing ENaC activity through stimulation of β₂-adrenergic receptors has been shown to increase sodium and fluid reabsorption from the airspace to the interstitial space. In cystic fibrosis lung disease there is a hyperabsorption of sodium through ENaC which results in dehydration of the airway surface liquid. Previous work has identified a common functional genetic variant of SCNN1A, the gene encoding the ENaC alpha-subunit. This variant manifests as an alanine to threonine substitution at amino acid 663 (T663), with the T663 variant resulting in a more active channel due to a greater number of channels in the membrane. We sought to determine the influence of the T663 variant on exhaled ions, pulmonary function, and the diffusing capacity of the lungs in healthy subjects as well as in patients with cystic fibrosis. We used exercise, which can increase endogenous epinephrine by up to 1000 fold at peak exercise, and albuterol, an exogenous β₂-adrenergic agonist, to stimulate ENaC activity. In healthy individuals we hypothesized that the T663 variant would be beneficial for lung function due to a greater fluid removal, which could improve gas transfer in a healthy lung. In the CF patients we predicted that the T663 variant would be detrimental to lung function due to an exaggerated absorption of sodium and drying/thickening of the mucus layer in the airways. Measurements of exhaled sodium were made in the healthy subjects at baseline, 30, 60, and 90 minutes post-albuterol administration. Subjects with the A663 variant had higher baseline exhaled sodium and a significant decrease in exhaled sodium by 90 minutes after β₂-adrenergic stimulation with albuterol, suggesting a removal of sodium from the airways. No changes in exhaled sodium were seen in the T663 variant in response to albuterol. In response to exercise the A663 variant had a greater increase in the diffusing capacity of the lung than the T663 variant, possibly due to differences in alveolar sodium and therefore fluid handling. Taken together, these results suggest that healthy humans with the A663 variant can increase ENaC activity in response to β₂-adrenergic stimulation, whereas individuals with the T663 variant have a diminished capacity for increasing ENaC activity in response to β₂-adrenergic stimulation. In CF patients, the T663 variant had significantly lower baseline pulmonary function, weight, and body mass index. In response to exercise, patients with the T663 variant had a greater increase in the diffusing capacity of the lungs, possibly due to purinergic inhibition of ENaC. Finally, we recruited additional CF patients to confirm our pulmonary function findings. Individuals with at least one allele resulting in the T663 variant had significantly lower body mass index, and tended to have lower exhaled chloride and pulmonary function. These results suggest greater dehydration of the lung in CF patients with the T663 variant. Overall, these results may suggest that the T663 variant modifies disease severity in CF, although more work is certainly warranted to confirm this result.

Cystic fibrosis (CF) is an inborn, hereditary disease, due to mutations in the gene for a cAMP-activated chloride (Cl-) channel, the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR). As a result of impaired ion and water transport,the airway mucus is abnormally viscous, which leads to bacterial colonization.Recurrent infections and inflammation result in obstructive pulmonary disease.Similar changes in the pancreas lead to pancreatic insufficiency.Several compounds have been tested to improve transepithelial ion transport in CF patients, either via activation of the mutant CFTR, or via stimulation of alternative chloride channels. The main purpose of this thesis was to find substances that might correct the defective ion transport in epithelial cells in CFand could be useful for the pharmacological treatment of CF patients. Long-term treatment with the macrolide antibiotic azithromycin (AZM)improved clinical parameters and lung function in CF patients and increased Cl- transport in CF bronchial epithelial cells (CFBE) (Paper I); although mRNA expression of the CFTR gene remained unchanged.In contrast, pre-exposure to the mucolytic antioxidant N-acetylcysteine (NAC) increased CFTR protein expression and was associated with increased Cl- efflux from CFBE cells (Paper II). Clinical trials of this substance might be warranted. Duramycin has been the subject of clinical trials that finished in June2009. Up till now, no results from this study are available. The effect of this substance on Cl- efflux from three CF and three non-CF cell lines (Paper III) was disappointing. An effect was found only in CFBE cells, the effect was minimal, occurred in a narrow concentration range, and was not associated with an increase in the intracellular calcium concentration [Ca2+]i. The fact that NO-donors stimulated Cl- efflux from CFBE cells (but did notchange [Ca2+]i) after several hours of preincubation suggests that these substances may be a potentially interesting group of compounds for the treatment of CF (Paper IV). A model for the effect of NO-donors on Cl- efflux is presented. / Cystisk fibros (CF) är en medfödd, ärftlig, sjukdom, som förorsakas av en mutation i en gen som innehåller koden för en kloridkanal som aktiveras av cykliskt AMP (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR). Som en följd av otillräcklig transport av joner och vatten är slemmet i luftvägarna onormalt segt, vilket leder till att det koloniseras av bakterier. Upprepade infektioneroch inflammation av luftvägarna leder slutligen till obstruktiv lungsjukdom.Liknande förändringar i bukspottkörteln leder till att också detta organ inte fungerar. Flera kemiska ämnen har testats för sin förmåga att förbättra jontransporten över epitelet hos CF-patienter. Detta skulle kunna göras antingen genom aktivering av det muterade CFTR-proteinet, eller genom stimulering av alternativa kloridkanaler. Huvudsyftet med den forskning som beskrivs i denna avhandling var att hitta kemiska substanser som skulle kunna korrigera den defekta jontransporten i epitelceller hos CF-patienter, och därför vara nyttiga för behandlingen av patienterna. Behandling under längre tid med azithromycin (AZM), ett makrolidantibiotikum,förbättrade CF-patienternas kliniska status och lungfunktion,samt ökade kloridutflödet från CF bronkialepitelceller (CFBE-celler) (Arbete I).Däremot ändrades inte uttrycket av mRNA för CFTR-genen. I kontrast till detta ökade uttrycket av CFTR-proteinet om CFBE-cellerna utsattes för den slemlösande anti-oxidanten N-acetylcystein (NAC), vilket ledde till ökat kloridutflöde från denna cellinje (Arbete II). Det vore rimligt att utföra kliniska prövningar av detta ämne. Duramycin har testats i kliniska prov som slutade i juni 2009, men några resultatfrån dessa prov har inte offentliggjorts än. Effekten av detta ämne på kloridutflödet från tre CF-cellinjer och tre icke-CF cellinjer (Arbete III) var en besvikelse. Duramycin hade endast effekt på CFBE-celler, effekten var mycket liten, förekom endast i ett litet koncentrationsområde av duramycin, och var inte kopplad till en ökning av den intracellulära kalciumkoncentrationen [Ca2+]i. Att ämnen som avger kväveoxid (NO) stimulerade kloridutflödet från CFceller (men inte påverkade [Ca2+]i) efter några timmar, visar att denna grupp av ämnen kan vara potentiellt intressant för behandlingen av CF (arbete IV). En modell för effekten av NO på kloridtransporten i CF-celler presenteras.

No description available.

El problema que trae aparejado la falta de un diagnóstico certero y rápido de los patógenos respiratorios en pacientes fibroquísticos tiene un fuerte impacto en el tratamiento antimicrobiano, en el control de infecciones y principalmente en la calidad de vida y sobrevida de estos pacientes. En el caso particular de los organismos del complejo Burkholderia cepacia, que colonizan a estos pacientes, son ampliamente reconocidas las dificultades y limitaciones de los métodos bioquímicos tradicionales para su identificación. En los últimos años se han puesto muchos esfuerzos en desarrollar nuevos métodos de identificación rápidos, sencillos y de bajo costo que permitan la diferenciación e identificación inequívoca de bacilos no fermentadores, pertenecientes y no pertenecientes al complejo Burkholderia cepacia. Este trabajo de tesis fue concebido con la idea de avanzar en el conocimiento general sobre las técnicas de identificación, las características genotípicas y fenotípicas de organismos del complejo B. cepacia y a su vez resolver problemas de diagnóstico del sector hospitalario y epidemiológicos de nuestro país.