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Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-graduação em Ciências Animais, 2014. / Submitted by Larissa Stefane Vieira Rodrigues (larissarodrigues@bce.unb.br) on 2014-12-11T17:52:36Z No. of bitstreams: 1 2014_RodrigoDornelesTortorella.pdf: 1610273 bytes, checksum: 0355b3b368491a0843c4c35c7dc827f5 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2014-12-12T15:01:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_RodrigoDornelesTortorella.pdf: 1610273 bytes, checksum: 0355b3b368491a0843c4c35c7dc827f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-12T15:01:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_RodrigoDornelesTortorella.pdf: 1610273 bytes, checksum: 0355b3b368491a0843c4c35c7dc827f5 (MD5) / O Curraleiro Pé-Duro possui como características desejáveis, a resistência ao estresse climático, ectoparasitas e endoparasitas. Contudo, atualmente encontra-se ameaçado devido ao pequeno número de animais existentes. Uma das alternativas para expandir a criação é o uso de biotecnologias da reprodução, que podem ser adaptadas para esta raça após um maior conhecimento da fisiologia reprodutiva das fêmeas. O trabalho teve por objetivo caracterizar a dinâmica folicular durante o ciclo estral na raça Curraleiro Pé-Duro e conhecer as respostas reprodutivas frente à inseminação artificial em tempo fixo (IATF). No Capítulo 2, novilhas (n = 12) e vacas (n = 11) não lactantes e cíclicas foram monitoradas (avaliação ultrassonográfica) diariamente durante um ciclo estral completo. Não houve diferença na dinâmica folicular entre novilhas e vacas. Desta forma, os dados foram combinados de acordo com o número de ondas foliculares. As fêmeas apresentaram predominantemente dois padrões de ondas foliculares, duas (36,8%) e três (63,2%), não havendo diferença na duração do ciclo estral entre estes. Nos animais com três ondas, a taxa de crescimento e máximo diâmetro do folículo ovulatório (FO) foram maiores em relação aos com duas ondas. Independentemente do padrão de ondas, a duração do FO foi menor do que do folículo dominante (FD) não ovulatório das outras ondas. O desenvolvimento (duração e volume) do corpo lúteo (CL) não diferiu entre os animais com duas e três ondas. No Capítulo 3, as avaliações ultrassonográficas foram realizadas a cada 8 horas até 5 dias após a ovulação, em novilhas (n = 11) e vacas (n = 11) não lactantes e cíclicas, para caracterizar com maior precisão a emergência e divergência folicular. Entre vacas e novilhas houve diferença apenas no tempo entre a ovulação e emergência (11,6 ± 3,3 h versus 20,3 ± 2,5 h, P ≤ 0,05) e a ovulação e divergência (52,4 ± 5,2 h versus 71,8 ± 4,1 h, P ≤ 0,05), respectivamente. Após a emergência folicular, a divergência ocorreu em torno de 45 horas e o tamanho do FD (8,1 ± 1 mm) foi similar ao maior folículo subordinado (FS, 7,6 ± 0,9 mm). A taxa de crescimento do FD e FS não diferiu até a divergência, sendo que após a taxa no FD manteve-se positiva enquanto que o FS regrediu. No Capítulo 4, foram verificadas as respostas foliculares e luteais de vacas cíclicas (n = 12), não lactantes e pluríparas frente à aplicação do benzoato de estradiol (BE) ou cipionato de estradiol (CE) como indutores da ovulação (Experimento 1), e a aplicação da gonadotrofina coriônica equina (eCG, Experimento 2) em protocolo de IATF. No Experimento 1, houve diferença apenas no momento da ovulação, sendo mais precoce e menos disperso nos animais que receberam o BE. No Experimento 2, o eCG não teve efeito benéfico sobre o crescimento folicular e luteal. Os dados obtidos no trabalho servirão de base para a manipulação do ciclo reprodutivo objetivando melhores resultados em programas de IATF e múltipla ovulação e transferência de embriões, ajudando assim na preservação e disseminação da raça. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Curraleiro Pé-Duro cattle have desirable adaptative traits as tolerance to climatic stresses and resistence to parasites. However, nowadays this breed is in dangerous due to the low number of animals. The use of reproductive biotechnologies could be an alternative to stimulate the spread of Curraleiro Pé-Duro. Although satisfactory results will just be achieved after knowledgement of female reproductive physiology. Thus, the aim of the present study was to characterize ovarian follicular dynamics during estrous cycle and reproductive responses after a fixed-time artificial insemination (FTAI). In Chapter 2, cyclic heifers (n = 12) and non-lactating, multiparous cows (n = 11) were examined daily by ultrasonography for two consecutive ovulations (an estrous cycle). Follicular and luteal characteristics were not different between heifers and cows. Consequently, data on cows and heifers were combined according to the number of follicular waves. Follicular dynamics was characterized by the predominance of two (36.8%) and three (63.2%) follicular waves. No difference in estrous cycle length between these follicular wave patterns was observed. The ovulatory follicle (OF) growth rate and maximum diameter were greater (P ≤ 0.05) in females showing three waves. The ovulatory wave was shorter (P ≤ 0.05) than the preceding waves regardless of the wave pattern. No difference was found in corpus luteum (CL) development (volume and life-span) between females with two and three follicular wave patterns. In Chapter 3, cyclic heifers (n = 11) and non-lactating, multiparous cows (n = 11) were examined every 8 hours by ultrasonography until five days after ovulation (D 0) to characterize ovarian follicular emergence and deviation. The interval from ovulation to emergence (11.6 ± 3.3 h versus 20.3 ± 2.5 h, P ≤ 0.05) and ovulation to deviation (52.4 ± 5.2 h versus 71.8 ± 4.1 h, P ≤ 0.05) was shorter in cows than in heifers, respectively. No other difference was observed between cows and heifers. DF diameter (8.1 ± 1 mm) did not differ (P = 0.09) from the largest subordinate follicle (SF) diameter (7.6 ± 0.9 mm) at the moment of deviation (around 45 hours after emergence). DF and SF growth rates were similar until deviation, at this moment SF growth rate decreased while DF growth rate remained constant. In Chapter 4, the aim was to evaluate the effects of estradiol benzoate (EB) and estradiol cypionate (CE) as ovulatory inducers (Experiment 1) and equine chorionic gonadotropin (eCG, Experiment 2) on follicular and luteal dynamics in a FTAI protocol. In Experiment 1, interval from P4 removal to ovulation was shorter and less variable in EB group (P ≤ 0.05). In Experiment 2, eCG did not to improve (P > 0.05) follicular and luteal growth. Data from this study will be useful to a better estrous cycle manipulation to achieve good results in artificial insemination, FTAI and multiple ovulation and embryo transfer programs aiming breed conservation and spread.

A grande maioria das espécies de anfíbios anuros apresenta um padrão de reprodução sazonal, caracterizado nos machos por um pico de andrógenos que desencadeia maturação testicular, bem como manutenção do comportamento sexual. No entanto, os altos níveis de andrógenos podem apresentar um efeito imunossupressor, podendo também aumentar a probabilidade de infecções parasitárias. A Caatinga brasileira é caracterizada por altas temperaturas e chuvas sazonais e imprevisíveis que determinam o padrão reprodutivo e de atividade dos anuros dessa região, algumas espécies como P. diplolister apresentam comportamento de estivação durante a seca, já Rhinella Jimi e R. granulosa permanecem ativos quanto ao forrageamento durante este período. As drásticas variações deste ambiente poderiam acentuar os ajustes fisiológicos apresentados por essas espécies, principalmente para a espécie estivadora. Foram estudadas as inter-relações entre caracteres morfológicos, fisiológicos e parasitológicos dessas três espécies de anuros, em três períodos distintos, (A) durante a temporada reprodutiva, em um período entre dois surtos reprodutivos (período entre chuvas); (B) durante um surto reprodutivo que acompanhou um evento de chuvas e (C) no período da seca. As duas espécies de Rhinella apresentaram evidências de modulações imunológicas de acordo com período, e correlações entre caracteres imunológicos, fisiológicos e número de parasitas. Pleurodema diplolister apresentou padrões imunológicos coerentes com o processo de economia energética durante a estivação, como redução do número de leucócitos totais, com concomitante aumento na contagem de eosinófilos e relação positiva entre intensidade parasitária e contagem total de leucócitos. As três espécies estudadas apresentaram depleção das reservas energéticas durante o período reprodutivo, possivelmente associada à alta demanda energética do comportamento vocal. Também apresentaram padrões similares de maturação testicular, evidenciando que as espécies estudadas possuem um padrão de reprodução oportunista, típico de espécies que ocupam ambientes áridos. As três espécies também apresentaram relação entre parâmetros imunológicos e carga parasitária, no entanto, para esclarecer as relações causais entre esses fatores, são necessários testes adicionais de desafio imunológico, bem como infecção experimental por parasitas / Most part of anurans show a seasonal pattern of reproduction, when males display high levels of androgens associated with testicular development and sexual behavior maintenance. However, high androgens levels also can shows an immunosuppressive effect resulting in increased parasitological disease. The semi-arid Caatinga is an environment characterized by high temperatures and unpredictable seasonal rains that determine the breeding season of anurans. During the dry season, Pleurodema diplolister aestivate borrowed, Rhinella granulose and R. jimi remain foraging. Drastic variation in this environment could increase the physiological adjustments displayed by these species, mainly by P. diplolister. The inter-relation between morphological, physiological and parasitological characters was studied in these three anuran species, in three different periods: (A) dry season, (B) during the rainfall, when males are calling, and (C) in the interval between rainfalls, when males are foraging within the reproductive season. The Rhinella species presented evidences of immunological modulations according to the period and correlations between immunological, physiological parameters and number of parasites. Pleurodema diplolister presented immunological patters consistent with the process of energy economy during aestivation, including total leukocyte reduction, along with eosinophil increase and positive relation between total leukocyte and parasite intensity. The three species presented depletion in energy reserves during the breeding season, possibly associated with the high energy demand of vocal behavior. They also presented a similar pattern of testicular development, indicating that these species present opportunistic reproduction pattern, typical of species that occupy arid environments. The studied species also showed correlations between immunological parameters and parasite load, however, to clarify the causal relation between these parameters, additional immunological challenges and experimental parasite infection are necessary

A reprodução em peixes é controlada pelo eixo hipotálamo-hipófise-gônadas e os fatores que alteram o funcionamento adequado deste eixo são chamados de disruptores endócrinos. Muitos metais têm o papel de disruptores endócrinos e dentre eles destaca-se o alumínio que, além de afetar o sistema endócrino de algumas espécies de peixes, pode alterar a deposição e/ou mobilização de substratos energéticos nestes animais. Sabe-se que o pH pode modular em muitos casos as respostas fisiológicas decorrentes da exposição de peixes a alguns metais, como é o caso do alumínio. Desta forma, o presente trabalho objetiva avaliar as possíveis alterações na fisiologia reprodutiva de duas espécies de peixes teleósteos continentais quando os mesmos são expostos às altas concentrações de alumínio e em pH ácido. Para avaliar estes efeitos foram conduzidos 2 tipos de experimentos: um crônico, realizado com fêmeas de uma espécie de desova total (sincrônica em grupo), Astyanax fasciatus (lambari), durante a sua fase reprodutiva, pelo período de 14 dias; e outro agudo, pelo período de 96 horas, com fêmeas de Oreochromis niloticus (tilápia), espécie de desova parcelada (assincrônica) também em fase reprodutiva. Foram determinadas as concentrações plasmáticas de hormônios esteróides como o cortisol, o estradiol e a 17 α OHP utilizando-se kits de elisaimunoensaio; substratos energéticos, como proteínas e lipídios, no fígado, plasma e gônadas, assim como os principais íons plasmáticos (cálcio, potássio, cloro, magnésio e sódio) também foram analisados. Análises histológicas das gônadas, fígado e brânquias foram conduzidas com a finalidade de avaliar o efeito do alumínio e do pH ácido nestes tecidos. Os resultados do presente trabalho evidenciam que o alumínio e o pH ácido afetam a fisiologia reprodutiva de peixes teleósteos, mas o efeito deste metal está relacionado à estratégia reprodutiva dos animais. Os dados mostram que em peixes de desova total, como o lambari, os efeitos do alumínio são mais evidentes na fase de vitelogênese, alterando a ação dos estrógenos e os processos de mobilização de lipídios e proteínas em uma fase anterior à maturação final. Já na tilápia, os efeitos do alumínio e do pH ácido são mais evidentes na fase de maturação final e ovulação, uma vez que alterações foram observadas na concentração do progestágeno 17 α OHP, precursor do MIS em peixes teleósteos. / Fish reproduction is controlled by the hypothalamic-pituitary-gonad axis and factors that alter the normal function of this axis are known as endocrine disrupters. Many metals act as endocrine disrupters, including aluminium, a metal that affects endocrine and metabolic parameters in fish. It is also known that the pH can alter the endocrine disruptor effect of metals such as aluminium in fish. Considering that, this work aims to analyze the alterations in the reproductive physiology of two freshwater teleosts exposed to high aluminium concentrations in an acidic pH environment. To evaluate these effects, two experiments were conducted: the first experiment was designed to evaluate chronic effects by using mature Astyanax fasciatus females, a group synchronic species over a 14 day period; the second experiment was aimed to assess acute effects over a 96 hour period using Oreochromis niloticus mature females, an asynchronous species. The plasma profile of the steroids hormones, cortisol, estradiol and 17 α OHP were analyzed using EIA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) kits. Metabolic substrates as protein and lipids were analyzed in liver, gonads and plasma and the main plasmatic ions (potassium, sodium, chloride, magnesium and calcium) were also determined. Histological analyses were performed in liver, gonads and gills to evaluate the influence of aluminium on these organs. The results showed that aluminium as well as the acidic pH affects the reproductive physiology of the analyzed species, but the effects were different, according to the reproductive strategy of the respective species. Group synchronic species suffer from the aluminium effects in vitellogenic events, such as estradiol, lipid and protein concentrations in a period prior to final maturation. In contrast, the effects of aluminium and pH in tilapia were more evident in final maturation/ovulation processes than in vitellogenesis, as a result of alteration in the 17 α OHP concentration, the MIS (maturation induction steroid) precursor in teleosts.

A reprodução em peixes é controlada pelo eixo hipotálamo-hipófise-gônadas e os fatores que alteram o funcionamento adequado deste eixo são chamados de disruptores endócrinos. Muitos metais têm o papel de disruptores endócrinos e dentre eles destaca-se o alumínio que, além de afetar o sistema endócrino de algumas espécies de peixes, pode alterar a deposição e/ou mobilização de substratos energéticos nestes animais. Sabe-se que o pH pode modular em muitos casos as respostas fisiológicas decorrentes da exposição de peixes a alguns metais, como é o caso do alumínio. Desta forma, o presente trabalho objetiva avaliar as possíveis alterações na fisiologia reprodutiva de duas espécies de peixes teleósteos continentais quando os mesmos são expostos às altas concentrações de alumínio e em pH ácido. Para avaliar estes efeitos foram conduzidos 2 tipos de experimentos: um crônico, realizado com fêmeas de uma espécie de desova total (sincrônica em grupo), Astyanax fasciatus (lambari), durante a sua fase reprodutiva, pelo período de 14 dias; e outro agudo, pelo período de 96 horas, com fêmeas de Oreochromis niloticus (tilápia), espécie de desova parcelada (assincrônica) também em fase reprodutiva. Foram determinadas as concentrações plasmáticas de hormônios esteróides como o cortisol, o estradiol e a 17 α OHP utilizando-se kits de elisaimunoensaio; substratos energéticos, como proteínas e lipídios, no fígado, plasma e gônadas, assim como os principais íons plasmáticos (cálcio, potássio, cloro, magnésio e sódio) também foram analisados. Análises histológicas das gônadas, fígado e brânquias foram conduzidas com a finalidade de avaliar o efeito do alumínio e do pH ácido nestes tecidos. Os resultados do presente trabalho evidenciam que o alumínio e o pH ácido afetam a fisiologia reprodutiva de peixes teleósteos, mas o efeito deste metal está relacionado à estratégia reprodutiva dos animais. Os dados mostram que em peixes de desova total, como o lambari, os efeitos do alumínio são mais evidentes na fase de vitelogênese, alterando a ação dos estrógenos e os processos de mobilização de lipídios e proteínas em uma fase anterior à maturação final. Já na tilápia, os efeitos do alumínio e do pH ácido são mais evidentes na fase de maturação final e ovulação, uma vez que alterações foram observadas na concentração do progestágeno 17 α OHP, precursor do MIS em peixes teleósteos. / Fish reproduction is controlled by the hypothalamic-pituitary-gonad axis and factors that alter the normal function of this axis are known as endocrine disrupters. Many metals act as endocrine disrupters, including aluminium, a metal that affects endocrine and metabolic parameters in fish. It is also known that the pH can alter the endocrine disruptor effect of metals such as aluminium in fish. Considering that, this work aims to analyze the alterations in the reproductive physiology of two freshwater teleosts exposed to high aluminium concentrations in an acidic pH environment. To evaluate these effects, two experiments were conducted: the first experiment was designed to evaluate chronic effects by using mature Astyanax fasciatus females, a group synchronic species over a 14 day period; the second experiment was aimed to assess acute effects over a 96 hour period using Oreochromis niloticus mature females, an asynchronous species. The plasma profile of the steroids hormones, cortisol, estradiol and 17 α OHP were analyzed using EIA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) kits. Metabolic substrates as protein and lipids were analyzed in liver, gonads and plasma and the main plasmatic ions (potassium, sodium, chloride, magnesium and calcium) were also determined. Histological analyses were performed in liver, gonads and gills to evaluate the influence of aluminium on these organs. The results showed that aluminium as well as the acidic pH affects the reproductive physiology of the analyzed species, but the effects were different, according to the reproductive strategy of the respective species. Group synchronic species suffer from the aluminium effects in vitellogenic events, such as estradiol, lipid and protein concentrations in a period prior to final maturation. In contrast, the effects of aluminium and pH in tilapia were more evident in final maturation/ovulation processes than in vitellogenesis, as a result of alteration in the 17 α OHP concentration, the MIS (maturation induction steroid) precursor in teleosts.

A grande maioria das espécies de anfíbios anuros apresenta um padrão de reprodução sazonal, caracterizado nos machos por um pico de andrógenos que desencadeia maturação testicular, bem como manutenção do comportamento sexual. No entanto, os altos níveis de andrógenos podem apresentar um efeito imunossupressor, podendo também aumentar a probabilidade de infecções parasitárias. A Caatinga brasileira é caracterizada por altas temperaturas e chuvas sazonais e imprevisíveis que determinam o padrão reprodutivo e de atividade dos anuros dessa região, algumas espécies como P. diplolister apresentam comportamento de estivação durante a seca, já Rhinella Jimi e R. granulosa permanecem ativos quanto ao forrageamento durante este período. As drásticas variações deste ambiente poderiam acentuar os ajustes fisiológicos apresentados por essas espécies, principalmente para a espécie estivadora. Foram estudadas as inter-relações entre caracteres morfológicos, fisiológicos e parasitológicos dessas três espécies de anuros, em três períodos distintos, (A) durante a temporada reprodutiva, em um período entre dois surtos reprodutivos (período entre chuvas); (B) durante um surto reprodutivo que acompanhou um evento de chuvas e (C) no período da seca. As duas espécies de Rhinella apresentaram evidências de modulações imunológicas de acordo com período, e correlações entre caracteres imunológicos, fisiológicos e número de parasitas. Pleurodema diplolister apresentou padrões imunológicos coerentes com o processo de economia energética durante a estivação, como redução do número de leucócitos totais, com concomitante aumento na contagem de eosinófilos e relação positiva entre intensidade parasitária e contagem total de leucócitos. As três espécies estudadas apresentaram depleção das reservas energéticas durante o período reprodutivo, possivelmente associada à alta demanda energética do comportamento vocal. Também apresentaram padrões similares de maturação testicular, evidenciando que as espécies estudadas possuem um padrão de reprodução oportunista, típico de espécies que ocupam ambientes áridos. As três espécies também apresentaram relação entre parâmetros imunológicos e carga parasitária, no entanto, para esclarecer as relações causais entre esses fatores, são necessários testes adicionais de desafio imunológico, bem como infecção experimental por parasitas / Most part of anurans show a seasonal pattern of reproduction, when males display high levels of androgens associated with testicular development and sexual behavior maintenance. However, high androgens levels also can shows an immunosuppressive effect resulting in increased parasitological disease. The semi-arid Caatinga is an environment characterized by high temperatures and unpredictable seasonal rains that determine the breeding season of anurans. During the dry season, Pleurodema diplolister aestivate borrowed, Rhinella granulose and R. jimi remain foraging. Drastic variation in this environment could increase the physiological adjustments displayed by these species, mainly by P. diplolister. The inter-relation between morphological, physiological and parasitological characters was studied in these three anuran species, in three different periods: (A) dry season, (B) during the rainfall, when males are calling, and (C) in the interval between rainfalls, when males are foraging within the reproductive season. The Rhinella species presented evidences of immunological modulations according to the period and correlations between immunological, physiological parameters and number of parasites. Pleurodema diplolister presented immunological patters consistent with the process of energy economy during aestivation, including total leukocyte reduction, along with eosinophil increase and positive relation between total leukocyte and parasite intensity. The three species presented depletion in energy reserves during the breeding season, possibly associated with the high energy demand of vocal behavior. They also presented a similar pattern of testicular development, indicating that these species present opportunistic reproduction pattern, typical of species that occupy arid environments. The studied species also showed correlations between immunological parameters and parasite load, however, to clarify the causal relation between these parameters, additional immunological challenges and experimental parasite infection are necessary