Fitoplasmas são procariotos sem parede celular, pertencentes à classe dos Mollicutes, que habitam os vasos de floema e causam doenças de relevância econômica em uma ampla gama de espécies vegetais. A videira (Vitis sp) é a terceira fruteira mais cultivada no mundo e apresenta elevada importância econômica no Brasil. Aspectos fitossanitários se constituem em fatores limitantes da produção, com destaque para as doenças causadas por fitoplasmas, denominadas de amarelos. Essas doenças estão amplamente disseminadas nos continentes europeu e americano, ocorrendo em tradicionais países produtores. Plantas exibindo sintomas característicos da doença têm sido também observadas em cultivos comerciais localizados em algumas áreas do território brasileiro. Visando investigar este tipo de doença, plantas sintomáticas foram amostradas em parreirais comerciais dos Estados de São Paulo e Paraná e mantidas em casa de vegetação. O presente estudo visou demonstrar a associação entre fitoplasmas e os amarelos, identificar e analisar filogeneticamente os fitoplasmas detectados, demonstrar sua transmissão para plantas sadias e determinar o melhor estádio fenológico da planta para amostragem de tecidos, para confirmação da diagnose. Para isto, durante 45 meses, amostras foram coletadas de plantas doentes envasadas sendo usado o método de PCR, análise de RFLP, sequenciamento das bases nucleotídicas e enxertia de tecidos entre plantas de videira. Os produtos amplificados em PCR evidenciaram a presença de fitoplasmas em todas as plantas portadoras de amarelos. Estes fitoplasmas foram identificados como representantes dos grupos 16SrI-B e 16SrIII, os quais ocorreram em infecções simples ou mistas. Os fitoplasmas apareceram em todas as fases de desenvolvimento da planta, porém com maior freqüência nas amostras coletadas no estádio fenológico correspondente à brotação de ramos e aparecimento de folhas novas. Esta fase se mostrou a mais indicada para as amostragens, visando à detecção de fitoplasmas para fins de diagnose. A transmissão dos fitoplasmas por enxertia foi alta, demonstrando que estes são os agentes causais da doença e que inspeções devem ser adotadas como medida de controle para evitar sua disseminação via material de propagação vegetativa. / Phytoplasmas are wall-less prokaryotes, phloem-limited plant pathogens, belonging to Mollicute class. They are agents of diseases that cause serious damage to a diversity of cultivated especies. Grapevine (Vitis sp) is the third most cultivated fruit crop in the world and it has high economical impact in Brazil. Phytossanitary aspects are important production constraint factors, especially regarding diseases caused by phytoplasmas, which are generally known as grapevine yellows. These diseases are widely spread throughout main producer countries, located in Europe and North America. Plants exhibiting typical symptoms of the disease have also been observed in crops located in some areas of Brazilian territory. In order to investigate this kind of malady, symptomatic plants were sampled from commercial vineyards located in the States of São Paulo and Paraná, Brazil and kept in greenhouse conditions. The present study aimed to: demonstrate the association between phytoplasmas and yellows; identify and analyse phylogenetically the detected phytoplasmas; demonstrate their transmission to healthy plants and determinate optimal phenologycal stage for phytoplasma detection to diagnosis confirmation. Samples were collected from diseased plotted plants grown during 45 months. PCR method, RFLP analyses, sequencing of nucleotide bases from 16S rRNA, and grafting technique were used in this study. Amplified genomic fragments revealed the presence of phytoplasmas in all plants with symptoms of yellows. Those phytoplasmas were identified as representatives of the groups 16SrI-B and 16SrIII, occurring in simple and mixed infections. Phytoplasmas were detected in all phenological stages evaluated, but they occurred with high frequences in material collected during budburst. These stage may be considered as the most indicated for sampling to confirm diagnosis based on symptomatology. Phytoplasmas transmission by grafting of healthy scion grafts onto infected rootstocks was high, demonstrating that they are the disease agents and inspection is a control practice that must be adopted to prevent their dissemination through propagative material.

Fitoplasmas são procariotos sem parede celular e habitantes de floema, agentes de doenças que causam danos consideráveis em diversas culturas. O maracujazeiro é uma espécie tropical cultivada em diversas regiões brasileiras. As doenças estão entre os fatores que podem causar danos à cultura e o superbrotamento do maracujazeiro tem se revelado como sendo uma das mais importantes. Esta doença, associada com fitoplasma, foi reportada somente no Brasil, onde foi registrada nos estados do Rio de Janeiro e de Pernambuco, no início da década de oitenta. Embora alguns estudos sobre o assunto tenham sido feitos anteriormente, o presente estudo foi conduzido para: demonstrar a presença constante do agente em associação com plantas doentes; revelar a ocorrência do fitoplasma em algumas áreas pertencentes a alguns estados; identificar, classificar e estudar filogeneticamente o fitoplasma; e demonstrar a patogenicidade do fitoplasma do superbrotamento do maracujazeiro. Em 2005-2006, plantas sintomáticas suspeitas de estarem infectadas por fitoplasma foram amostradas em algumas áreas do estado de São Paulo e vários outros estados brasileiros. A detecção e identificação por PCR duplo foi conduzida com os pares de oligonucleotídeos universais para fitoplasmas R16mF2/mR1-R16 F2n/R2 e pelo par específico R16(III) F2/R1, repectivamente. Para as análises de RFLP foram usadas as enzimas de restrição AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e MboI. Análises filogenéticas foram baseadas nas seqüências de nucleotídeos do 16S rDNA de fitoplasmas pertencentes a grupos e subgrupos distintos. Os ensaios de patogenicidade foram feitos usando-se enxertia de tecido. Amplificações de fragmentos de DNA de 1,2kb usando-se os oligonuclotídeos universais revelaram a presença de fitoplasma nas plantas sintomáticas de todas as regiões amostradas. Amplificações de fragmentos de DNA de 0,8kb pelos oligonucleotídeos específicos indicaram que o fitoplasma detectado era afiliado ao grupo 16SrIII, enquanto as análises de RFLP confirmaram a identificação feita com base no PCR e mostraram que o fitoplasma pode ser classificado como um membro do subgrupo 16SrIII-B. Sequenciamento e análises filogenéticas revelaram que o fitoplasma do superbrotamento do maracujazeiro é um típico representante do grupo 16SRIII, quando comparado com fitoplasmas de outros grupos. A patogenicidade foi demonstrada através da observação de sintomas típicos da doença, seguida da detecção molecular do fitoplasma in plantas sadias enxertadas com ramos de plantas infectadas. Os resultados obtidos no presente estudo permitiram: confirmar a diagnose baseada na sintomatologia; revelar a associação constante entre planta doente e fitoplasma, confirmando investigações anteriores conduzidas com microscopia eletrônica; identificar o fitoplasma como um membro do grupo 16SrIII-B; demonstrar que o fitoplasma é o agente causal do superbrotamento do maracujazeiro; e mostrar a ocorrência atual do patógeno nos estados da Bahia, do Paraná, Rio de Janeiro, Sergipe e São Paulo. / Phytoplasmas are cell wall-less prokaryotes and phloem-inhabitants associated with diseases that affect several crops. Passion fruit plant is a tropical species cultivated in various Brazilian regions. Diseases are among factors that may cause damage to this crop and the passion fruit witches\' broom has been revealed as very important one. That disease, associated with phytoplasma, was reported only in Brazil, where it was registered in Rio de Janeiro and Pernambuco States in the beginning of eighty decade. Although some studies about that subject have been made previously, the present study was conducted in order to: demonstrate the constant presence of the agent in association with diseased plants; reveal the occurrence of fitoplasma in some areas belonging to some States; identify, classify and study phylogenetically the phytoplasma; and demonstrate the pathogenicity of passion fruit witches\' broom phytoplasma. In 2005-2006, symptomatic plants suspected of phytoplasma infection were sampled in some areas of São Paulo State and various other Brazilian States. The detection and identification by nested PCR were performed with the universal primer pair R16mF2/mR1-16F2n/R2 and specific pair R16(III)F2/R1, respectively. For RFLP analyses were used the restriction enzymes AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e MboI. Phylogenetic analyses were based on the nucleotide sequences of the 16S rDNA from phytoplasmas belonging to distinct groups and subgroups. Pathogenecity assays were made by using grafting of tissue. Amplifications of DNA fragments of 1.2kb by using universal primer pairs revealed the presence of phytoplasma in the symptomatic plants from all sampled regions. Amplifications of DNA fragments of 0,8kb by specific primer pair indicated that the detected phytoplasma is affiliated to the group 16SrIII, while RFLP analyses confirmed the identification based on PCR and showed that phytoplasma may be classify as a member of the subgroup 16SRIII-B. Sequencing and phylogenetic analysis revealed that the passion fruit witches\'broom phytoplasma is a typical representative of group 16SRIII, when compared with phytoplasmas from other groups. Pathogenicity was demonstrated through the observation of typical symptoms of the disease followed by molecular detection of the phytoplasma in healthy plants grafted with shoots from infected plants. The results obtained in the present study allowed: to confirm the diagnosis based on the symptomatology; to reveal the firm association between diseased plant and phytoplasma, confirming previous investigations conduced by electron microscopy; to identify the phytoplasma as a member of the group 16SRIII-B; to demonstrate that phytoplasma is the causal agent of passion fruit witches\' broom; and to show the present occurrence of the pathogen in the States of Bahia, Paraná, Rio de Janeiro, Sergipe, and São Paulo

Os fitoplasmas são procariotos sem parede celular pertencentes à classe Mollicutes. Um grande número de doenças de plantas cultivadas estão associadas aos fitoplasmas, incluindo tanto aquelas que afetam grandes culturas como aquelas ocorrentes em diversas espécies de ornamentais. Em cana-de-açúcar, uma doença conhecida como síndrome do amarelecimento foliar ou amarelinho causou danos expressivos à cultura e provocou a substituição de uma cultivar muito produtiva e extensivamente plantada no estado de São Paulo. A doença também foi registrada em outros países e investigações sobre a etiologia evidenciaram a ocorrência de vírus e fitoplasma como agentes. Em primavera (Bougainvillea spectabilis), uma espécie de origem brasileira bastante apreciada como ornamental, foram observados sintomas de clorose foliar, superbrotamento de ramos, deformações foliares e florais e declínio, sintomas característicos de infecção causada por fitoplasmas. O presente trabalho teve como finalidade investigar a etiologia desta nova doença encontrada em primavera, denominada de superbrotamento, e identificar molecularmente o fitoplasma envolvido com a síndrome do amarelecimento foliar da cana-de-açúcar. Para isso, amostras de plantas sintomática e assintomáticas de cana-de-açúcar e primavera foram submetidas à extração do DNA total. A partir deste DNA, a detecção molecular foi conduzida com PCR duplo usando-se os iniciadores P1/Tint na primeira reação e R16 F2n/R2 na segunda reação. Posteriormente à detecção, foi realizada a identificação através de PCR duplo com iniciadores específicos e análises de RFLP com as enzimas de restrição AluI, RsaI, KpnI, MseI, HhaI, HpaII, e MboI. Análises filogenéticas foram baseadas nas sequências nucleotídicas do 16S rDNA dos fitoplasmas detectados na cana e na primavera, bem como nas sequências de outros fitoplasmas disponíveis em banco de dados. O teste de transmissão usou plantas infectadas de primavera e plantas sadias de vinca, interligados por filamentos de cuscuta. Os resultados mostraram que fragmentos genômicos de aproximadamente 1.2kb foram amplificados em 33% e 60% das amostras de DNA extraído de plantas sintomáticas de cana-de-açúcar e de primavera, respectivamente. O uso de iniciadores específicos demonstrou a presença de fitoplasmas dos grupos 16SrI e 16SrIII associados ao superbrotamento da primavera e de um fitoplasma do grupo 16SrI associado à síndrome do amarelecimento foliar. Análises de RFLP, confirmaram a ocorrência de fitoplasmas membros dos grupos 16SrI e 16SrIII em plantas de primavera, e revelaram que estes fitoplasmas poderiam ser classificados nos subgrupos 16SrI-B e 16SrIII-B. A identificação evidenciou que o fitoplasma encontrado em cana-de-açúcar é um representante do grupo 16SrI, sub-grupo B. Análises filogenéticas e de mapas de sítios putativos de restrição, confirmaram os resultados obtidos com os testes de PCR e com as análises de RFLP para os fitoplasmas relacionados às duas doenças estudadas. A transmissão dos fitoplasmas presentes em primavera para plantas de vinca através da cuscuta demonstrou, biologicamente, que ambos são agentes causais do superbrotamento. Em quase todas as amostras de cana-de-açúcar positivas para fitoplasma também foi detectada a presença de um luteovírus, através do uso de RT-PCR, demonstrando que o amarelecimento foliar da cana-de-açúcar no estado de São Paulo está associado a um complexo formado por fitoplasma e vírus. No caso da primavera, este trabalho se constituiu no primeiro relato da ocorrência de fitoplasmas como agente de doença nessa espécie. / Phytoplasmas are wall-less prokaryote belonging to class Mollicutes. Several hundred plant species, including food crops and ornamental species have been reported as hosts of phytoplasmas, which are associated with important diseases. In sugarcane, a disease known as yellow leaf syndrome caused serious damage and led to replacement of a cultivar with high yield and widely distributed in the São Paulo State. The syndrome has also been described in other countries and studies about etiology evidenced the occurrence of virus and phytoplasmas as causal agents. In bougainvillea (Bougainvillea spectabilis), a native specie from Brazilian territory, were observed typical symptoms of phytoplasmas, characterized by leaf chorosis, proliferation of branches, deformation of leaves and flowers, decline, and death. The aim of this study was to investigate the etiology of the disease observed in bougainvillea and to identify molecularly the phytoplasma associated with sugarcane yellow leaf. Thus, DNA was extracted from samples collected of naturally symptomatic plants of sugarcane and bougainvillea. Nested PCR primed by P1/Tint-R16F2n/R2 was used for detection, while specific primers were used for identification. RFLP with restriction enzymes AluI, RsaI, KpnI, MseI, HhaI, HpaII, MboI and phylogenetic analysis based on nucleotide sequences of 16S rDNA were also used to identify the phytoplasmas detected in sugarcane and boungainvillea. Transmission of phytoplasmas from bougainvillea to periwinkle by dodder was conducted to demonstrate the pathogenecity of this agents. Results showed that genomic fragments of 1.2kb were amplified, evidencing the presence of phytoplasmas in 33% and 60% of symptomatic sugarcane and bougainvillea plants, respectively. PCR with specific primer pairs demonstrated that phytoplasmas affiliated to groups 16SrI and 16SrIII were associated with bougainvillea proliferation, while a phytoplasma belonging to group 16SrI was present in sugarcane plants exhibiting symptoms of yellow leaf. RFLP and phylogenetic analysis revealed that phytoplasmas found in bougainvillea could be classified within subgroups 16SrI-B and 16SrIII-B, and that phytoplasma detected in sugarcane is a representative of subgroup 16SrI-B. Almost the totality of symptomatic sugarcane plants showed the presence of virus, by using RT-PCR, indicating that a coinfection of virus and phytoplasma could be responsible by inducing the disease. Positive results for transmission revealed that both phytoplasmas found in boungainvillea are causal agents of the disease. This is the first report of phytoplasma as agent of disease in that species.

Plantas apresentando folhas com deformações do tipo bolhas, menor quantidade de vagens de tamanho reduzido e contendo menor número de sementes, vagens que não completaram a maturação e coloração verde da parte aérea no final do ciclo foram observadas em campos de produção. As plantas foram analisadas visando à detecção de fitoplasmas e a sua identificação molecular. Para isto, o DNA total das plantas amostradas foi submetido ao teste de duplo PCR conduzido com primers específicos para a região do 16S rDNA de fitoplasmas. As amplificações evidenciaram que fitoplasmas estavam presentes em tecidos de plantas sintomáticas. O duplo PCR realizado com primers grupo-específicos revelou a ocorrência de fitoplasmas afiliados aos grupos 16SrI e 16SrIII. As análises virtuais de RFLP, baseadas no sequenciamento da referida região genômica, permitiram identificar um dos fitoplasmas como pertencente ao subgrupo 16SrI-B. Os valores de coeficientes de similaridade, calculados com base nos padrões de restrição gerados in silico por 17 enzimas, confirmaram a identidade deste fitoplasma. Ainda, mapas de restrição mostraram que o fitoplasma encontrado em plantas de soja apresentava sítios putativos de restrição idênticos a um fitoplasma típico do grupo 16SrI-B. A análise filogenética, envolvendo o fitoplasma alvo deste estudo e fitoplasmas representantes de alguns grupos e subgrupos relatados no Brasil, mostrou que o fitoplasma da soja estava estritamente relacionado com aqueles componentes do grupo 16SrI. O fitoplasma em estudo emergiu do mesmo ramo da árvore filogenética também compartilhado por fitoplasmas do grupo 16SrI, confirmando os resultados dos demais testes moleculares. Os resultados gerados neste trabalho evidenciaram que a soja pode ser considerada como mais um hospedeiro de fitoplasmas pertencentes aos grupos 16SrI e 16SrIII, os quais tem sido relatados em associação com diversas doenças de plantas que ocorrem no Brasil. Este estudo também gera informações que podem contribuir para aumentar os conhecimentos sobre este emergente grupo de agentes causais de doença. / Plants exhibiting leaf deformation type bubbles, low quantities of pods of reduced size containing few seeds, pods not mature, and green color of stem and leaves in the end of crop growth were observed in commercial fields. The plants were tested for the detection of phytoplasmas and their molecular identification. For this, the total DNA of plants sampled was submitted to nested PCR assays conducted with universal primers for amplification of a fragment corresponding to the 16S rDNA of phytoplasmas. The amplifications revealed the presence of phytoplasmas in tissues of symptomatic plants. For identification, nested PCR performed with group-specific primers demonstrated the occurrence of phytoplasmas affiliated to the groups 16SrI and 16SrIII. The virtual RFLP analysis, based on the sequencing of DNA fragments generated from nested PCR with universal primers, allowed the identification of a phytoplasma belonging to the subgroup 16SrI-B. The values of similarity coefficients, calculated on the basis of restriction patterns generated in silico for 17 enzymes, confirmed the identity of this phytoplasma. Furthermore, restriction maps showed that the phytoplasma found in soybean plants had putative restriction sites identical to those phytoplasma of the group 16SI-B. Phylogenetic analysis, involving the phytoplasma identified in the present study and representatives of some groups and subgroups previously reported in Brazil, showed that the soybean phytoplasma was closely related to phytoplasmas belonging to group 16SrI. The studied phytoplasma and phytoplasmas belonging to group 16SrI emerged from the same branch, confirming the results obtained by PCR and RFLP analysis. Also, based on the results, soybean could be considered as a host for phytoplasmas belonging to the group 16SrI and 16SrIII, which has been reported in association with various diseases that occur in Brazil. The present study may contribute to improve the knowledge about this emerging group of causal agents of disease.

Fitoplasmas são agentes causais de diversas doenças em numerosas espécies botânicas cultivadas, daninhas e silvestres. São procariotos que não apresentam parede celular, parasitas intracelulares obrigatórios, habitantes do floema e da hemolinfa, sendo transmitidos naturalmente por insetos vetores do tipo cigarrinhas. Plantas de oliveira apresentando sintomas tipicamente induzidos por fitoplasmas, caracterizados por desenvolvimento lento e superbrotamento de ramos com folhas de tamanho reduzido, foram observadas na cidade de Extrema (MG). A anomalia provoca danos significativos, pois retarda o início de produção e reduz o rendimento da cultura. Sintomas semelhantes foram relatados em olivais implantados em outros países, onde a doença foi associada aos fitoplasmas. O objetivo deste trabalho foi demonstrar a associação de fitoplasma com as plantas afetadas e identificar o fitoplasma presente nas árvores doentes. Para isto foram utilizadas as técnicas moleculares de PCR e RFLP, além de análise filogenética. Os resultados revelaram a presença de fitoplasmas em 73% das árvores sintomáticas analisadas, evidenciando que os sintomas observados no campo eram induzidos por fitoplasma. A doença foi denominada de vassoura-de-bruxa da oliveira. A identificação molecular permitiu classificar o fitoplasma como um representante do grupo 16SrVII-B. Este é o primeiro relato da ocorrência de fitoplasma em plantas de oliveira no Brasil. Em termos mais amplos, é o primeiro relato da associação de um fitoplasma do grupo 16SrVII com a doença vassoura-de-bruxa da oliveira, a qual, em outros países, está associada a fitoplasmas distintos do fitoplasma identificado no presente trabalho. / Phytoplasmas are causal agents of diverse diseases occurring in numerous botanical species, among them cultivated, weeds and wild plants. They are wall-less prokaryotes, obligate intracellular parasites, inhabitants of phoem vessels and hemolymph, and naturally transmitted by insect vectors belonging to the group of the leafhoppers. Olive trees exhibiting symptoms typically induced by phytoplasmas, characterized by slow growth and shoot proliferation with small leaves, were observed in the municipality of Extrema (MG). The anomaly provokes significant damage due to the delay in the beginning of the production and yield reduction of the crop. Similar symptoms have been reported in olive orchards cultivated in other countries, where the disease was associated with phytoplasmas. The objective of the present investigation was to demonstrate the association of phytoplasma with affected plants and identify the phytoplasma present in diseased trees. PCR assays, RFLP analysis and phylogenetic analysis were used to molecular characterization of the phytoplasma. The results revealed the presence of phytoplasma in 73% of the symptomatic trees, evidencing that the symptoms observed in field were induced by phytoplasma. The disease was designated by olive witches\" broom. The molecular identification allowed classify the phytoplasma as a representative of the 16SrVII-B group. This is the first report of the occurrence of phytoplasma in olive plants in Brazil. Moreover, this is also the first report of the association of a group 16SrVII phytoplasma with olive whitches\" broom disease, which has been described in other countries in association with phytoplasmas different from the phytoplasma identified in the present study.

Sintomas típicos de infecção por fitoplasmas foram encontrados em plantas de gergelim cultivadas comercialmente. Estes sintomas se caracterizavam pela intensa proliferação de ramos, presença abundante de folhas levemente cloróticas e de tamanho menor que as normais, além de pétalas de coloração verde. A partir de plantas afetadas foi extraído o DNA total, o qual foi usado em reações de duplo PCR, visando detectar fitoplasmas nos tecidos vegetais. Fragmentos genômicos de 1,2 Kb da região do 16S rDNA foram amplificados demonstrando a constante associação entre fitoplasmas e plantas doentes. Através de duplo PCR usando primers específicos, foi identificado um fitoplasma pertencente ao grupo 16SrI em todas as amostras sintomáticas analisadas. Com base no sequenciamento desta região genômica e na digestão in sílico, as análises virtuais de RFLP revelaram que um dos fitoplasmas presentes nas amostras de gergelim era afiliado ao subgrupo 16SrI-B. No entanto, os padrões de restrição apresentados pelo outro fitoplasma mostraram que o mesmo era distinto dos demais representantes dos subgrupos que constituem o grupo 16SrI. Os valores calculados de coeficientes de similaridade e os mapas putativos de restrição confirmaram os resultados da análise de RFLP, indicando que este fitoplasma era representante de um novo subgrupo. A árvore filogenética, construída a partir das sequências nucleotídicas do 16S rDNA de diversos fitoplasmas evidenciou que este novo fitoplasma emergia de um ramo distinto, considerando as ramificações dentro do grupo 16SrI. A filodia do gergelim foi anteriormente relatada em vários países, sendo associada com fitoplasmas dos grupos 16SrI, 16SrII e 16SrVI. O presente trabalho revelou a ocorrência de dois fitoplasmas associados à filodia, sendo um deles pertencente ao subgrupo 16SrI-B e outro caracterizado como representante de um novo subgrupo, aqui denominado 16SrI-X. / Typical symptoms commonly induced by phytoplasmas were found in sesame plants grown in commercial fields. These symptoms were characterized by shoot proliferation, leaves of reduced size exhibiting light chlorosis, and green petals. Total DNA extracts were obtained from diseased plants and used as template in nested PCR, in order to detect phytoplasmas in the tissues of the hosts. Genomic fragments of 1.2 kb corresponding to the 16S rDNA region were amplified demonstrating the association of phytoplasmas and diseased plants. Using nested PCR with specific primers, a phytoplasma belonging to group 16SrI was identified in all symptomatic samples. Based on the sequencing of 16S rDNA and in silico digestion, the virtual RFLP analysis allowed identify the presence of a phytoplasma affiliated with the subgroup 16SrI-B. This analysis also revealed a second phytoplasma distinct of all representatives of the subgroups within the group 16SrI. Similarity coefficients values and analysis of putative restriction sites confirmed the results obtained from virtual RFLP analysis indicating that this phytoplasma was representative of a new subgroup. A phylogenetic tree generated by the 16S rDNA sequences belonging to diverse phytoplasmas evidenced that this new phytoplasma emerged from a distinct branch, within of the 16SrI group. The sesame phyllody was previously reported in various countries in association with phytoplasmas belonging to 16SrI, 16SrII, and 16SrVI groups. The present study revealed the association of the phyllody with a phytoplasma affiliated with 16SrI-B and a phytoplasma representative of a new subgroup here named 16SrI-X.

Fitoplasmas são agentes causais de diversas doenças em numerosas espécies botânicas cultivadas, daninhas e silvestres. São procariotos que não apresentam parede celular, parasitas intracelulares obrigatórios, habitantes do floema e da hemolinfa, sendo transmitidos naturalmente por insetos vetores do tipo cigarrinhas. Plantas de oliveira apresentando sintomas tipicamente induzidos por fitoplasmas, caracterizados por desenvolvimento lento e superbrotamento de ramos com folhas de tamanho reduzido, foram observadas na cidade de Extrema (MG). A anomalia provoca danos significativos, pois retarda o início de produção e reduz o rendimento da cultura. Sintomas semelhantes foram relatados em olivais implantados em outros países, onde a doença foi associada aos fitoplasmas. O objetivo deste trabalho foi demonstrar a associação de fitoplasma com as plantas afetadas e identificar o fitoplasma presente nas árvores doentes. Para isto foram utilizadas as técnicas moleculares de PCR e RFLP, além de análise filogenética. Os resultados revelaram a presença de fitoplasmas em 73% das árvores sintomáticas analisadas, evidenciando que os sintomas observados no campo eram induzidos por fitoplasma. A doença foi denominada de vassoura-de-bruxa da oliveira. A identificação molecular permitiu classificar o fitoplasma como um representante do grupo 16SrVII-B. Este é o primeiro relato da ocorrência de fitoplasma em plantas de oliveira no Brasil. Em termos mais amplos, é o primeiro relato da associação de um fitoplasma do grupo 16SrVII com a doença vassoura-de-bruxa da oliveira, a qual, em outros países, está associada a fitoplasmas distintos do fitoplasma identificado no presente trabalho. / Phytoplasmas are causal agents of diverse diseases occurring in numerous botanical species, among them cultivated, weeds and wild plants. They are wall-less prokaryotes, obligate intracellular parasites, inhabitants of phoem vessels and hemolymph, and naturally transmitted by insect vectors belonging to the group of the leafhoppers. Olive trees exhibiting symptoms typically induced by phytoplasmas, characterized by slow growth and shoot proliferation with small leaves, were observed in the municipality of Extrema (MG). The anomaly provokes significant damage due to the delay in the beginning of the production and yield reduction of the crop. Similar symptoms have been reported in olive orchards cultivated in other countries, where the disease was associated with phytoplasmas. The objective of the present investigation was to demonstrate the association of phytoplasma with affected plants and identify the phytoplasma present in diseased trees. PCR assays, RFLP analysis and phylogenetic analysis were used to molecular characterization of the phytoplasma. The results revealed the presence of phytoplasma in 73% of the symptomatic trees, evidencing that the symptoms observed in field were induced by phytoplasma. The disease was designated by olive witches\" broom. The molecular identification allowed classify the phytoplasma as a representative of the 16SrVII-B group. This is the first report of the occurrence of phytoplasma in olive plants in Brazil. Moreover, this is also the first report of the association of a group 16SrVII phytoplasma with olive whitches\" broom disease, which has been described in other countries in association with phytoplasmas different from the phytoplasma identified in the present study.

Plantas apresentando folhas com deformações do tipo bolhas, menor quantidade de vagens de tamanho reduzido e contendo menor número de sementes, vagens que não completaram a maturação e coloração verde da parte aérea no final do ciclo foram observadas em campos de produção. As plantas foram analisadas visando à detecção de fitoplasmas e a sua identificação molecular. Para isto, o DNA total das plantas amostradas foi submetido ao teste de duplo PCR conduzido com primers específicos para a região do 16S rDNA de fitoplasmas. As amplificações evidenciaram que fitoplasmas estavam presentes em tecidos de plantas sintomáticas. O duplo PCR realizado com primers grupo-específicos revelou a ocorrência de fitoplasmas afiliados aos grupos 16SrI e 16SrIII. As análises virtuais de RFLP, baseadas no sequenciamento da referida região genômica, permitiram identificar um dos fitoplasmas como pertencente ao subgrupo 16SrI-B. Os valores de coeficientes de similaridade, calculados com base nos padrões de restrição gerados in silico por 17 enzimas, confirmaram a identidade deste fitoplasma. Ainda, mapas de restrição mostraram que o fitoplasma encontrado em plantas de soja apresentava sítios putativos de restrição idênticos a um fitoplasma típico do grupo 16SrI-B. A análise filogenética, envolvendo o fitoplasma alvo deste estudo e fitoplasmas representantes de alguns grupos e subgrupos relatados no Brasil, mostrou que o fitoplasma da soja estava estritamente relacionado com aqueles componentes do grupo 16SrI. O fitoplasma em estudo emergiu do mesmo ramo da árvore filogenética também compartilhado por fitoplasmas do grupo 16SrI, confirmando os resultados dos demais testes moleculares. Os resultados gerados neste trabalho evidenciaram que a soja pode ser considerada como mais um hospedeiro de fitoplasmas pertencentes aos grupos 16SrI e 16SrIII, os quais tem sido relatados em associação com diversas doenças de plantas que ocorrem no Brasil. Este estudo também gera informações que podem contribuir para aumentar os conhecimentos sobre este emergente grupo de agentes causais de doença. / Plants exhibiting leaf deformation type bubbles, low quantities of pods of reduced size containing few seeds, pods not mature, and green color of stem and leaves in the end of crop growth were observed in commercial fields. The plants were tested for the detection of phytoplasmas and their molecular identification. For this, the total DNA of plants sampled was submitted to nested PCR assays conducted with universal primers for amplification of a fragment corresponding to the 16S rDNA of phytoplasmas. The amplifications revealed the presence of phytoplasmas in tissues of symptomatic plants. For identification, nested PCR performed with group-specific primers demonstrated the occurrence of phytoplasmas affiliated to the groups 16SrI and 16SrIII. The virtual RFLP analysis, based on the sequencing of DNA fragments generated from nested PCR with universal primers, allowed the identification of a phytoplasma belonging to the subgroup 16SrI-B. The values of similarity coefficients, calculated on the basis of restriction patterns generated in silico for 17 enzymes, confirmed the identity of this phytoplasma. Furthermore, restriction maps showed that the phytoplasma found in soybean plants had putative restriction sites identical to those phytoplasma of the group 16SI-B. Phylogenetic analysis, involving the phytoplasma identified in the present study and representatives of some groups and subgroups previously reported in Brazil, showed that the soybean phytoplasma was closely related to phytoplasmas belonging to group 16SrI. The studied phytoplasma and phytoplasmas belonging to group 16SrI emerged from the same branch, confirming the results obtained by PCR and RFLP analysis. Also, based on the results, soybean could be considered as a host for phytoplasmas belonging to the group 16SrI and 16SrIII, which has been reported in association with various diseases that occur in Brazil. The present study may contribute to improve the knowledge about this emerging group of causal agents of disease.

Fitoplasmas são procariotos sem parede celular e habitantes de floema, agentes de doenças que causam danos consideráveis em diversas culturas. O maracujazeiro é uma espécie tropical cultivada em diversas regiões brasileiras. As doenças estão entre os fatores que podem causar danos à cultura e o superbrotamento do maracujazeiro tem se revelado como sendo uma das mais importantes. Esta doença, associada com fitoplasma, foi reportada somente no Brasil, onde foi registrada nos estados do Rio de Janeiro e de Pernambuco, no início da década de oitenta. Embora alguns estudos sobre o assunto tenham sido feitos anteriormente, o presente estudo foi conduzido para: demonstrar a presença constante do agente em associação com plantas doentes; revelar a ocorrência do fitoplasma em algumas áreas pertencentes a alguns estados; identificar, classificar e estudar filogeneticamente o fitoplasma; e demonstrar a patogenicidade do fitoplasma do superbrotamento do maracujazeiro. Em 2005-2006, plantas sintomáticas suspeitas de estarem infectadas por fitoplasma foram amostradas em algumas áreas do estado de São Paulo e vários outros estados brasileiros. A detecção e identificação por PCR duplo foi conduzida com os pares de oligonucleotídeos universais para fitoplasmas R16mF2/mR1-R16 F2n/R2 e pelo par específico R16(III) F2/R1, repectivamente. Para as análises de RFLP foram usadas as enzimas de restrição AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e MboI. Análises filogenéticas foram baseadas nas seqüências de nucleotídeos do 16S rDNA de fitoplasmas pertencentes a grupos e subgrupos distintos. Os ensaios de patogenicidade foram feitos usando-se enxertia de tecido. Amplificações de fragmentos de DNA de 1,2kb usando-se os oligonuclotídeos universais revelaram a presença de fitoplasma nas plantas sintomáticas de todas as regiões amostradas. Amplificações de fragmentos de DNA de 0,8kb pelos oligonucleotídeos específicos indicaram que o fitoplasma detectado era afiliado ao grupo 16SrIII, enquanto as análises de RFLP confirmaram a identificação feita com base no PCR e mostraram que o fitoplasma pode ser classificado como um membro do subgrupo 16SrIII-B. Sequenciamento e análises filogenéticas revelaram que o fitoplasma do superbrotamento do maracujazeiro é um típico representante do grupo 16SRIII, quando comparado com fitoplasmas de outros grupos. A patogenicidade foi demonstrada através da observação de sintomas típicos da doença, seguida da detecção molecular do fitoplasma in plantas sadias enxertadas com ramos de plantas infectadas. Os resultados obtidos no presente estudo permitiram: confirmar a diagnose baseada na sintomatologia; revelar a associação constante entre planta doente e fitoplasma, confirmando investigações anteriores conduzidas com microscopia eletrônica; identificar o fitoplasma como um membro do grupo 16SrIII-B; demonstrar que o fitoplasma é o agente causal do superbrotamento do maracujazeiro; e mostrar a ocorrência atual do patógeno nos estados da Bahia, do Paraná, Rio de Janeiro, Sergipe e São Paulo. / Phytoplasmas are cell wall-less prokaryotes and phloem-inhabitants associated with diseases that affect several crops. Passion fruit plant is a tropical species cultivated in various Brazilian regions. Diseases are among factors that may cause damage to this crop and the passion fruit witches\' broom has been revealed as very important one. That disease, associated with phytoplasma, was reported only in Brazil, where it was registered in Rio de Janeiro and Pernambuco States in the beginning of eighty decade. Although some studies about that subject have been made previously, the present study was conducted in order to: demonstrate the constant presence of the agent in association with diseased plants; reveal the occurrence of fitoplasma in some areas belonging to some States; identify, classify and study phylogenetically the phytoplasma; and demonstrate the pathogenicity of passion fruit witches\' broom phytoplasma. In 2005-2006, symptomatic plants suspected of phytoplasma infection were sampled in some areas of São Paulo State and various other Brazilian States. The detection and identification by nested PCR were performed with the universal primer pair R16mF2/mR1-16F2n/R2 and specific pair R16(III)F2/R1, respectively. For RFLP analyses were used the restriction enzymes AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e MboI. Phylogenetic analyses were based on the nucleotide sequences of the 16S rDNA from phytoplasmas belonging to distinct groups and subgroups. Pathogenecity assays were made by using grafting of tissue. Amplifications of DNA fragments of 1.2kb by using universal primer pairs revealed the presence of phytoplasma in the symptomatic plants from all sampled regions. Amplifications of DNA fragments of 0,8kb by specific primer pair indicated that the detected phytoplasma is affiliated to the group 16SrIII, while RFLP analyses confirmed the identification based on PCR and showed that phytoplasma may be classify as a member of the subgroup 16SRIII-B. Sequencing and phylogenetic analysis revealed that the passion fruit witches\'broom phytoplasma is a typical representative of group 16SRIII, when compared with phytoplasmas from other groups. Pathogenicity was demonstrated through the observation of typical symptoms of the disease followed by molecular detection of the phytoplasma in healthy plants grafted with shoots from infected plants. The results obtained in the present study allowed: to confirm the diagnosis based on the symptomatology; to reveal the firm association between diseased plant and phytoplasma, confirming previous investigations conduced by electron microscopy; to identify the phytoplasma as a member of the group 16SRIII-B; to demonstrate that phytoplasma is the causal agent of passion fruit witches\' broom; and to show the present occurrence of the pathogen in the States of Bahia, Paraná, Rio de Janeiro, Sergipe, and São Paulo

Os fitoplasmas são procariotos sem parede celular pertencentes à classe Mollicutes. Um grande número de doenças de plantas cultivadas estão associadas aos fitoplasmas, incluindo tanto aquelas que afetam grandes culturas como aquelas ocorrentes em diversas espécies de ornamentais. Em cana-de-açúcar, uma doença conhecida como síndrome do amarelecimento foliar ou amarelinho causou danos expressivos à cultura e provocou a substituição de uma cultivar muito produtiva e extensivamente plantada no estado de São Paulo. A doença também foi registrada em outros países e investigações sobre a etiologia evidenciaram a ocorrência de vírus e fitoplasma como agentes. Em primavera (Bougainvillea spectabilis), uma espécie de origem brasileira bastante apreciada como ornamental, foram observados sintomas de clorose foliar, superbrotamento de ramos, deformações foliares e florais e declínio, sintomas característicos de infecção causada por fitoplasmas. O presente trabalho teve como finalidade investigar a etiologia desta nova doença encontrada em primavera, denominada de superbrotamento, e identificar molecularmente o fitoplasma envolvido com a síndrome do amarelecimento foliar da cana-de-açúcar. Para isso, amostras de plantas sintomática e assintomáticas de cana-de-açúcar e primavera foram submetidas à extração do DNA total. A partir deste DNA, a detecção molecular foi conduzida com PCR duplo usando-se os iniciadores P1/Tint na primeira reação e R16 F2n/R2 na segunda reação. Posteriormente à detecção, foi realizada a identificação através de PCR duplo com iniciadores específicos e análises de RFLP com as enzimas de restrição AluI, RsaI, KpnI, MseI, HhaI, HpaII, e MboI. Análises filogenéticas foram baseadas nas sequências nucleotídicas do 16S rDNA dos fitoplasmas detectados na cana e na primavera, bem como nas sequências de outros fitoplasmas disponíveis em banco de dados. O teste de transmissão usou plantas infectadas de primavera e plantas sadias de vinca, interligados por filamentos de cuscuta. Os resultados mostraram que fragmentos genômicos de aproximadamente 1.2kb foram amplificados em 33% e 60% das amostras de DNA extraído de plantas sintomáticas de cana-de-açúcar e de primavera, respectivamente. O uso de iniciadores específicos demonstrou a presença de fitoplasmas dos grupos 16SrI e 16SrIII associados ao superbrotamento da primavera e de um fitoplasma do grupo 16SrI associado à síndrome do amarelecimento foliar. Análises de RFLP, confirmaram a ocorrência de fitoplasmas membros dos grupos 16SrI e 16SrIII em plantas de primavera, e revelaram que estes fitoplasmas poderiam ser classificados nos subgrupos 16SrI-B e 16SrIII-B. A identificação evidenciou que o fitoplasma encontrado em cana-de-açúcar é um representante do grupo 16SrI, sub-grupo B. Análises filogenéticas e de mapas de sítios putativos de restrição, confirmaram os resultados obtidos com os testes de PCR e com as análises de RFLP para os fitoplasmas relacionados às duas doenças estudadas. A transmissão dos fitoplasmas presentes em primavera para plantas de vinca através da cuscuta demonstrou, biologicamente, que ambos são agentes causais do superbrotamento. Em quase todas as amostras de cana-de-açúcar positivas para fitoplasma também foi detectada a presença de um luteovírus, através do uso de RT-PCR, demonstrando que o amarelecimento foliar da cana-de-açúcar no estado de São Paulo está associado a um complexo formado por fitoplasma e vírus. No caso da primavera, este trabalho se constituiu no primeiro relato da ocorrência de fitoplasmas como agente de doença nessa espécie. / Phytoplasmas are wall-less prokaryote belonging to class Mollicutes. Several hundred plant species, including food crops and ornamental species have been reported as hosts of phytoplasmas, which are associated with important diseases. In sugarcane, a disease known as yellow leaf syndrome caused serious damage and led to replacement of a cultivar with high yield and widely distributed in the São Paulo State. The syndrome has also been described in other countries and studies about etiology evidenced the occurrence of virus and phytoplasmas as causal agents. In bougainvillea (Bougainvillea spectabilis), a native specie from Brazilian territory, were observed typical symptoms of phytoplasmas, characterized by leaf chorosis, proliferation of branches, deformation of leaves and flowers, decline, and death. The aim of this study was to investigate the etiology of the disease observed in bougainvillea and to identify molecularly the phytoplasma associated with sugarcane yellow leaf. Thus, DNA was extracted from samples collected of naturally symptomatic plants of sugarcane and bougainvillea. Nested PCR primed by P1/Tint-R16F2n/R2 was used for detection, while specific primers were used for identification. RFLP with restriction enzymes AluI, RsaI, KpnI, MseI, HhaI, HpaII, MboI and phylogenetic analysis based on nucleotide sequences of 16S rDNA were also used to identify the phytoplasmas detected in sugarcane and boungainvillea. Transmission of phytoplasmas from bougainvillea to periwinkle by dodder was conducted to demonstrate the pathogenecity of this agents. Results showed that genomic fragments of 1.2kb were amplified, evidencing the presence of phytoplasmas in 33% and 60% of symptomatic sugarcane and bougainvillea plants, respectively. PCR with specific primer pairs demonstrated that phytoplasmas affiliated to groups 16SrI and 16SrIII were associated with bougainvillea proliferation, while a phytoplasma belonging to group 16SrI was present in sugarcane plants exhibiting symptoms of yellow leaf. RFLP and phylogenetic analysis revealed that phytoplasmas found in bougainvillea could be classified within subgroups 16SrI-B and 16SrIII-B, and that phytoplasma detected in sugarcane is a representative of subgroup 16SrI-B. Almost the totality of symptomatic sugarcane plants showed the presence of virus, by using RT-PCR, indicating that a coinfection of virus and phytoplasma could be responsible by inducing the disease. Positive results for transmission revealed that both phytoplasmas found in boungainvillea are causal agents of the disease. This is the first report of phytoplasma as agent of disease in that species.