A videira (Vitis spp.) é uma das frutíferas mais cultivadas no mundo, tendo grande importância sócio-econômica no Brasil, principalmente na Região Serrana do Rio Grande do Sul. Inúmeras doenças acometem a videira afetando a produção vitícola e gerando prejuízos econômicos nas regiões produtoras. Uma destas doenças é o amarelo da videira, que tem associação com fitoplasmas. Esses procariotos, desprovidos de parede celular habitam e se multiplicam nos vasos do floema das plantas e na hemolinfa dos insetos vetores. No Brasil, há relatos da presença de fitoplasmas infectando videiras nos estados de São Paulo e Paraná. No Rio Grande do Sul, já foi verificado infectando macieiras, bem como a presença de seus possíveis insetos vetores, cigarrinhas do grupo Cicadellidae como parte da entomofauna vitícola. Nos últimos ciclos de produção, videiras apresentando sintomas de fitoplasmose vem sendo observadas nos vinhedos da Serra Gaúcha. O objetivo do presente estudo foi confirmar a presença de fitoplasmas infectando videiras na Região Serrana do Rio Grande do Sul, bem como classificar os fitoplasmas encontrados quanto ao grupo e subgrupo ao qual pertencem. Foram coletados, nos anos de 2014 e 2015, ramos e raízes de plantas que apresentavam sintomas como avermelhamento ou clorose das folhas em videiras tintas e brancas, respectivamente, enrolamento dos bordos foliares, superbrotamento de ramos, encurtamento de entrenós, necrose de nervuras e definhamento. O DNA total foi extraído e utilizado para detecção de fitoplasmas por meio de Nested-PCR com os primers R16 mF2/R16 R1, P/P7 ou P1/Tint na primeira reação e R16 F2n /R16 R2 na segunda reação. Para identificação molecular os produtos da segunda reação, fragmentos correspondentes à região 16S rDNA, foram sequenciados e as sequências geradas foram alinhadas entre si. Uma seqüência representativa dos fitoplasmas encontrados foi utilizada para análise de RFLP in silico, com 17 enzimas de restrição, e análise filogenética. Fitoplasmas foram verificados em quatro amostras oriundas de três videiras sintomáticas. As sequências alinhadas apresentavam 99% de similaridade com sequencias de fitoplasmas depositadas no GeneBank. A partir da avaliação dos perfis de restrição gerados pelo RFLP in silico e a análise filogenética, pode-se concluir que os fitoplasmas encontrados pertencem ao grupo 16SrIII, e ao subgrupo 16SrIII-J. Dessa forma, o presente estudo confirma a presença de fitoplasmas infectando videiras na Região Serrana do Rio Grande do Sul, indicando a ocorrência do amarelo da videira, doença até então não diagnosticada na região. / Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2016-02-22T12:41:30Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Ronize Rohr dos Santos.pdf: 2096147 bytes, checksum: 52d3fdc210d2e34e4fcc1976c0c4920e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-22T12:41:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Ronize Rohr dos Santos.pdf: 2096147 bytes, checksum: 52d3fdc210d2e34e4fcc1976c0c4920e (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico. / The grapevine is one of the most cultivated fruit trees in the world, having great socio-economic importance in Brazil, particularly in the highlands of Rio Grande do Sul. Numerous diseases affect grapevine worldwide, interfering in grape production and generating economic losses. One of these diseases is the grapevine yellow, whose etiologic agent is a phytoplasma. These wall-less prokaryotes live and multiply in phloem vessels of plants and hemolymph of insect vectors. In Brazil, there are reports of the presence of phytoplasma infecting grapevines in the states of São Paulo and Paraná. In Rio Grande do Sul has been found infecting apple trees, causing the apple rubbery wood disease, as well as the presence of their possible insect vectors in vineyards, leafhoppers of the Cicadellidae group. In recent cycles of production, grapevines showing typical symptoms of phytoplasma infection had been observed in the vineyards of the highlands of Rio Grande do Sul. This study aimed to confirm the presence of phytoplasma infecting grapevines in vineyards of the highlands of Rio Grande do Sul and rank the phytoplasmas on the group and subgroup to which they belong. Branches and roots of plants showing symptoms such as, reddening or yellowing of leaves on red or white cultivars respectively, leaf downwards rolling, proliferation of axillary buds resulting in a witches’ broom behavior, abnormal internodes elongation, phloem necrosis and stunting, were sampled during the years 2014 and 2015 vintage. Total DNA was extracted and used for phytoplasmas detection by nested PCR with primers mF2 R16/R16 R1, P1/P7 and P1/Tint in the first reaction and F2n R16/R16 R2 in the second reaction. For molecular identification the second reaction product, corresponding to the region 16S rDNA fragments were sequenced and generated sequences were aligned. A representative sequence of grapevine phytoplasma was used for RFLP analysis in silico, with 17 restriction enzymes, and phylogenetic analysis. Phytoplasmas were detected in four samples deriving from three symptomatic vines. The aligned sequences showed 99% similarity with phytoplasma sequences deposited in GeneBank. The RFLP patters and the phylogenetic analysis, allowed concluding that the phytoplasmas found belongs to the group16SrIII, and 16SrIII- J subgroup. Thus, this study confirms the presence of phytoplasma infecting grapevines in the highlands of Rio Grande do Sul, indicating the occurrence of grapevine yellow disease hitherto none diagnosed in the region.

A videira (Vitis spp.) é uma das frutíferas mais cultivadas no mundo, tendo grande importância sócio-econômica no Brasil, principalmente na Região Serrana do Rio Grande do Sul. Inúmeras doenças acometem a videira afetando a produção vitícola e gerando prejuízos econômicos nas regiões produtoras. Uma destas doenças é o amarelo da videira, que tem associação com fitoplasmas. Esses procariotos, desprovidos de parede celular habitam e se multiplicam nos vasos do floema das plantas e na hemolinfa dos insetos vetores. No Brasil, há relatos da presença de fitoplasmas infectando videiras nos estados de São Paulo e Paraná. No Rio Grande do Sul, já foi verificado infectando macieiras, bem como a presença de seus possíveis insetos vetores, cigarrinhas do grupo Cicadellidae como parte da entomofauna vitícola. Nos últimos ciclos de produção, videiras apresentando sintomas de fitoplasmose vem sendo observadas nos vinhedos da Serra Gaúcha. O objetivo do presente estudo foi confirmar a presença de fitoplasmas infectando videiras na Região Serrana do Rio Grande do Sul, bem como classificar os fitoplasmas encontrados quanto ao grupo e subgrupo ao qual pertencem. Foram coletados, nos anos de 2014 e 2015, ramos e raízes de plantas que apresentavam sintomas como avermelhamento ou clorose das folhas em videiras tintas e brancas, respectivamente, enrolamento dos bordos foliares, superbrotamento de ramos, encurtamento de entrenós, necrose de nervuras e definhamento. O DNA total foi extraído e utilizado para detecção de fitoplasmas por meio de Nested-PCR com os primers R16 mF2/R16 R1, P/P7 ou P1/Tint na primeira reação e R16 F2n /R16 R2 na segunda reação. Para identificação molecular os produtos da segunda reação, fragmentos correspondentes à região 16S rDNA, foram sequenciados e as sequências geradas foram alinhadas entre si. Uma seqüência representativa dos fitoplasmas encontrados foi utilizada para análise de RFLP in silico, com 17 enzimas de restrição, e análise filogenética. Fitoplasmas foram verificados em quatro amostras oriundas de três videiras sintomáticas. As sequências alinhadas apresentavam 99% de similaridade com sequencias de fitoplasmas depositadas no GeneBank. A partir da avaliação dos perfis de restrição gerados pelo RFLP in silico e a análise filogenética, pode-se concluir que os fitoplasmas encontrados pertencem ao grupo 16SrIII, e ao subgrupo 16SrIII-J. Dessa forma, o presente estudo confirma a presença de fitoplasmas infectando videiras na Região Serrana do Rio Grande do Sul, indicando a ocorrência do amarelo da videira, doença até então não diagnosticada na região. / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico. / The grapevine is one of the most cultivated fruit trees in the world, having great socio-economic importance in Brazil, particularly in the highlands of Rio Grande do Sul. Numerous diseases affect grapevine worldwide, interfering in grape production and generating economic losses. One of these diseases is the grapevine yellow, whose etiologic agent is a phytoplasma. These wall-less prokaryotes live and multiply in phloem vessels of plants and hemolymph of insect vectors. In Brazil, there are reports of the presence of phytoplasma infecting grapevines in the states of São Paulo and Paraná. In Rio Grande do Sul has been found infecting apple trees, causing the apple rubbery wood disease, as well as the presence of their possible insect vectors in vineyards, leafhoppers of the Cicadellidae group. In recent cycles of production, grapevines showing typical symptoms of phytoplasma infection had been observed in the vineyards of the highlands of Rio Grande do Sul. This study aimed to confirm the presence of phytoplasma infecting grapevines in vineyards of the highlands of Rio Grande do Sul and rank the phytoplasmas on the group and subgroup to which they belong. Branches and roots of plants showing symptoms such as, reddening or yellowing of leaves on red or white cultivars respectively, leaf downwards rolling, proliferation of axillary buds resulting in a witches’ broom behavior, abnormal internodes elongation, phloem necrosis and stunting, were sampled during the years 2014 and 2015 vintage. Total DNA was extracted and used for phytoplasmas detection by nested PCR with primers mF2 R16/R16 R1, P1/P7 and P1/Tint in the first reaction and F2n R16/R16 R2 in the second reaction. For molecular identification the second reaction product, corresponding to the region 16S rDNA fragments were sequenced and generated sequences were aligned. A representative sequence of grapevine phytoplasma was used for RFLP analysis in silico, with 17 restriction enzymes, and phylogenetic analysis. Phytoplasmas were detected in four samples deriving from three symptomatic vines. The aligned sequences showed 99% similarity with phytoplasma sequences deposited in GeneBank. The RFLP patters and the phylogenetic analysis, allowed concluding that the phytoplasmas found belongs to the group16SrIII, and 16SrIII- J subgroup. Thus, this study confirms the presence of phytoplasma infecting grapevines in the highlands of Rio Grande do Sul, indicating the occurrence of grapevine yellow disease hitherto none diagnosed in the region.

Sintomas típicos de infecção por fitoplasmas foram encontrados em plantas de gergelim cultivadas comercialmente. Estes sintomas se caracterizavam pela intensa proliferação de ramos, presença abundante de folhas levemente cloróticas e de tamanho menor que as normais, além de pétalas de coloração verde. A partir de plantas afetadas foi extraído o DNA total, o qual foi usado em reações de duplo PCR, visando detectar fitoplasmas nos tecidos vegetais. Fragmentos genômicos de 1,2 Kb da região do 16S rDNA foram amplificados demonstrando a constante associação entre fitoplasmas e plantas doentes. Através de duplo PCR usando primers específicos, foi identificado um fitoplasma pertencente ao grupo 16SrI em todas as amostras sintomáticas analisadas. Com base no sequenciamento desta região genômica e na digestão in sílico, as análises virtuais de RFLP revelaram que um dos fitoplasmas presentes nas amostras de gergelim era afiliado ao subgrupo 16SrI-B. No entanto, os padrões de restrição apresentados pelo outro fitoplasma mostraram que o mesmo era distinto dos demais representantes dos subgrupos que constituem o grupo 16SrI. Os valores calculados de coeficientes de similaridade e os mapas putativos de restrição confirmaram os resultados da análise de RFLP, indicando que este fitoplasma era representante de um novo subgrupo. A árvore filogenética, construída a partir das sequências nucleotídicas do 16S rDNA de diversos fitoplasmas evidenciou que este novo fitoplasma emergia de um ramo distinto, considerando as ramificações dentro do grupo 16SrI. A filodia do gergelim foi anteriormente relatada em vários países, sendo associada com fitoplasmas dos grupos 16SrI, 16SrII e 16SrVI. O presente trabalho revelou a ocorrência de dois fitoplasmas associados à filodia, sendo um deles pertencente ao subgrupo 16SrI-B e outro caracterizado como representante de um novo subgrupo, aqui denominado 16SrI-X. / Typical symptoms commonly induced by phytoplasmas were found in sesame plants grown in commercial fields. These symptoms were characterized by shoot proliferation, leaves of reduced size exhibiting light chlorosis, and green petals. Total DNA extracts were obtained from diseased plants and used as template in nested PCR, in order to detect phytoplasmas in the tissues of the hosts. Genomic fragments of 1.2 kb corresponding to the 16S rDNA region were amplified demonstrating the association of phytoplasmas and diseased plants. Using nested PCR with specific primers, a phytoplasma belonging to group 16SrI was identified in all symptomatic samples. Based on the sequencing of 16S rDNA and in silico digestion, the virtual RFLP analysis allowed identify the presence of a phytoplasma affiliated with the subgroup 16SrI-B. This analysis also revealed a second phytoplasma distinct of all representatives of the subgroups within the group 16SrI. Similarity coefficients values and analysis of putative restriction sites confirmed the results obtained from virtual RFLP analysis indicating that this phytoplasma was representative of a new subgroup. A phylogenetic tree generated by the 16S rDNA sequences belonging to diverse phytoplasmas evidenced that this new phytoplasma emerged from a distinct branch, within of the 16SrI group. The sesame phyllody was previously reported in various countries in association with phytoplasmas belonging to 16SrI, 16SrII, and 16SrVI groups. The present study revealed the association of the phyllody with a phytoplasma affiliated with 16SrI-B and a phytoplasma representative of a new subgroup here named 16SrI-X.

Plantas apresentando folhas com deformações do tipo bolhas, menor quantidade de vagens de tamanho reduzido e contendo menor número de sementes, vagens que não completaram a maturação e coloração verde da parte aérea no final do ciclo foram observadas em campos de produção. As plantas foram analisadas visando à detecção de fitoplasmas e a sua identificação molecular. Para isto, o DNA total das plantas amostradas foi submetido ao teste de duplo PCR conduzido com primers específicos para a região do 16S rDNA de fitoplasmas. As amplificações evidenciaram que fitoplasmas estavam presentes em tecidos de plantas sintomáticas. O duplo PCR realizado com primers grupo-específicos revelou a ocorrência de fitoplasmas afiliados aos grupos 16SrI e 16SrIII. As análises virtuais de RFLP, baseadas no sequenciamento da referida região genômica, permitiram identificar um dos fitoplasmas como pertencente ao subgrupo 16SrI-B. Os valores de coeficientes de similaridade, calculados com base nos padrões de restrição gerados in silico por 17 enzimas, confirmaram a identidade deste fitoplasma. Ainda, mapas de restrição mostraram que o fitoplasma encontrado em plantas de soja apresentava sítios putativos de restrição idênticos a um fitoplasma típico do grupo 16SrI-B. A análise filogenética, envolvendo o fitoplasma alvo deste estudo e fitoplasmas representantes de alguns grupos e subgrupos relatados no Brasil, mostrou que o fitoplasma da soja estava estritamente relacionado com aqueles componentes do grupo 16SrI. O fitoplasma em estudo emergiu do mesmo ramo da árvore filogenética também compartilhado por fitoplasmas do grupo 16SrI, confirmando os resultados dos demais testes moleculares. Os resultados gerados neste trabalho evidenciaram que a soja pode ser considerada como mais um hospedeiro de fitoplasmas pertencentes aos grupos 16SrI e 16SrIII, os quais tem sido relatados em associação com diversas doenças de plantas que ocorrem no Brasil. Este estudo também gera informações que podem contribuir para aumentar os conhecimentos sobre este emergente grupo de agentes causais de doença. / Plants exhibiting leaf deformation type bubbles, low quantities of pods of reduced size containing few seeds, pods not mature, and green color of stem and leaves in the end of crop growth were observed in commercial fields. The plants were tested for the detection of phytoplasmas and their molecular identification. For this, the total DNA of plants sampled was submitted to nested PCR assays conducted with universal primers for amplification of a fragment corresponding to the 16S rDNA of phytoplasmas. The amplifications revealed the presence of phytoplasmas in tissues of symptomatic plants. For identification, nested PCR performed with group-specific primers demonstrated the occurrence of phytoplasmas affiliated to the groups 16SrI and 16SrIII. The virtual RFLP analysis, based on the sequencing of DNA fragments generated from nested PCR with universal primers, allowed the identification of a phytoplasma belonging to the subgroup 16SrI-B. The values of similarity coefficients, calculated on the basis of restriction patterns generated in silico for 17 enzymes, confirmed the identity of this phytoplasma. Furthermore, restriction maps showed that the phytoplasma found in soybean plants had putative restriction sites identical to those phytoplasma of the group 16SI-B. Phylogenetic analysis, involving the phytoplasma identified in the present study and representatives of some groups and subgroups previously reported in Brazil, showed that the soybean phytoplasma was closely related to phytoplasmas belonging to group 16SrI. The studied phytoplasma and phytoplasmas belonging to group 16SrI emerged from the same branch, confirming the results obtained by PCR and RFLP analysis. Also, based on the results, soybean could be considered as a host for phytoplasmas belonging to the group 16SrI and 16SrIII, which has been reported in association with various diseases that occur in Brazil. The present study may contribute to improve the knowledge about this emerging group of causal agents of disease.

Fitoplasmas são agentes causais de diversas doenças em numerosas espécies botânicas cultivadas, daninhas e silvestres. São procariotos que não apresentam parede celular, parasitas intracelulares obrigatórios, habitantes do floema e da hemolinfa, sendo transmitidos naturalmente por insetos vetores do tipo cigarrinhas. Plantas de oliveira apresentando sintomas tipicamente induzidos por fitoplasmas, caracterizados por desenvolvimento lento e superbrotamento de ramos com folhas de tamanho reduzido, foram observadas na cidade de Extrema (MG). A anomalia provoca danos significativos, pois retarda o início de produção e reduz o rendimento da cultura. Sintomas semelhantes foram relatados em olivais implantados em outros países, onde a doença foi associada aos fitoplasmas. O objetivo deste trabalho foi demonstrar a associação de fitoplasma com as plantas afetadas e identificar o fitoplasma presente nas árvores doentes. Para isto foram utilizadas as técnicas moleculares de PCR e RFLP, além de análise filogenética. Os resultados revelaram a presença de fitoplasmas em 73% das árvores sintomáticas analisadas, evidenciando que os sintomas observados no campo eram induzidos por fitoplasma. A doença foi denominada de vassoura-de-bruxa da oliveira. A identificação molecular permitiu classificar o fitoplasma como um representante do grupo 16SrVII-B. Este é o primeiro relato da ocorrência de fitoplasma em plantas de oliveira no Brasil. Em termos mais amplos, é o primeiro relato da associação de um fitoplasma do grupo 16SrVII com a doença vassoura-de-bruxa da oliveira, a qual, em outros países, está associada a fitoplasmas distintos do fitoplasma identificado no presente trabalho. / Phytoplasmas are causal agents of diverse diseases occurring in numerous botanical species, among them cultivated, weeds and wild plants. They are wall-less prokaryotes, obligate intracellular parasites, inhabitants of phoem vessels and hemolymph, and naturally transmitted by insect vectors belonging to the group of the leafhoppers. Olive trees exhibiting symptoms typically induced by phytoplasmas, characterized by slow growth and shoot proliferation with small leaves, were observed in the municipality of Extrema (MG). The anomaly provokes significant damage due to the delay in the beginning of the production and yield reduction of the crop. Similar symptoms have been reported in olive orchards cultivated in other countries, where the disease was associated with phytoplasmas. The objective of the present investigation was to demonstrate the association of phytoplasma with affected plants and identify the phytoplasma present in diseased trees. PCR assays, RFLP analysis and phylogenetic analysis were used to molecular characterization of the phytoplasma. The results revealed the presence of phytoplasma in 73% of the symptomatic trees, evidencing that the symptoms observed in field were induced by phytoplasma. The disease was designated by olive witches\" broom. The molecular identification allowed classify the phytoplasma as a representative of the 16SrVII-B group. This is the first report of the occurrence of phytoplasma in olive plants in Brazil. Moreover, this is also the first report of the association of a group 16SrVII phytoplasma with olive whitches\" broom disease, which has been described in other countries in association with phytoplasmas different from the phytoplasma identified in the present study.

Sintomas típicos de infecção por fitoplasmas foram encontrados em plantas de gergelim cultivadas comercialmente. Estes sintomas se caracterizavam pela intensa proliferação de ramos, presença abundante de folhas levemente cloróticas e de tamanho menor que as normais, além de pétalas de coloração verde. A partir de plantas afetadas foi extraído o DNA total, o qual foi usado em reações de duplo PCR, visando detectar fitoplasmas nos tecidos vegetais. Fragmentos genômicos de 1,2 Kb da região do 16S rDNA foram amplificados demonstrando a constante associação entre fitoplasmas e plantas doentes. Através de duplo PCR usando primers específicos, foi identificado um fitoplasma pertencente ao grupo 16SrI em todas as amostras sintomáticas analisadas. Com base no sequenciamento desta região genômica e na digestão in sílico, as análises virtuais de RFLP revelaram que um dos fitoplasmas presentes nas amostras de gergelim era afiliado ao subgrupo 16SrI-B. No entanto, os padrões de restrição apresentados pelo outro fitoplasma mostraram que o mesmo era distinto dos demais representantes dos subgrupos que constituem o grupo 16SrI. Os valores calculados de coeficientes de similaridade e os mapas putativos de restrição confirmaram os resultados da análise de RFLP, indicando que este fitoplasma era representante de um novo subgrupo. A árvore filogenética, construída a partir das sequências nucleotídicas do 16S rDNA de diversos fitoplasmas evidenciou que este novo fitoplasma emergia de um ramo distinto, considerando as ramificações dentro do grupo 16SrI. A filodia do gergelim foi anteriormente relatada em vários países, sendo associada com fitoplasmas dos grupos 16SrI, 16SrII e 16SrVI. O presente trabalho revelou a ocorrência de dois fitoplasmas associados à filodia, sendo um deles pertencente ao subgrupo 16SrI-B e outro caracterizado como representante de um novo subgrupo, aqui denominado 16SrI-X. / Typical symptoms commonly induced by phytoplasmas were found in sesame plants grown in commercial fields. These symptoms were characterized by shoot proliferation, leaves of reduced size exhibiting light chlorosis, and green petals. Total DNA extracts were obtained from diseased plants and used as template in nested PCR, in order to detect phytoplasmas in the tissues of the hosts. Genomic fragments of 1.2 kb corresponding to the 16S rDNA region were amplified demonstrating the association of phytoplasmas and diseased plants. Using nested PCR with specific primers, a phytoplasma belonging to group 16SrI was identified in all symptomatic samples. Based on the sequencing of 16S rDNA and in silico digestion, the virtual RFLP analysis allowed identify the presence of a phytoplasma affiliated with the subgroup 16SrI-B. This analysis also revealed a second phytoplasma distinct of all representatives of the subgroups within the group 16SrI. Similarity coefficients values and analysis of putative restriction sites confirmed the results obtained from virtual RFLP analysis indicating that this phytoplasma was representative of a new subgroup. A phylogenetic tree generated by the 16S rDNA sequences belonging to diverse phytoplasmas evidenced that this new phytoplasma emerged from a distinct branch, within of the 16SrI group. The sesame phyllody was previously reported in various countries in association with phytoplasmas belonging to 16SrI, 16SrII, and 16SrVI groups. The present study revealed the association of the phyllody with a phytoplasma affiliated with 16SrI-B and a phytoplasma representative of a new subgroup here named 16SrI-X.

Fitoplasmas são agentes causais de diversas doenças em numerosas espécies botânicas cultivadas, daninhas e silvestres. São procariotos que não apresentam parede celular, parasitas intracelulares obrigatórios, habitantes do floema e da hemolinfa, sendo transmitidos naturalmente por insetos vetores do tipo cigarrinhas. Plantas de oliveira apresentando sintomas tipicamente induzidos por fitoplasmas, caracterizados por desenvolvimento lento e superbrotamento de ramos com folhas de tamanho reduzido, foram observadas na cidade de Extrema (MG). A anomalia provoca danos significativos, pois retarda o início de produção e reduz o rendimento da cultura. Sintomas semelhantes foram relatados em olivais implantados em outros países, onde a doença foi associada aos fitoplasmas. O objetivo deste trabalho foi demonstrar a associação de fitoplasma com as plantas afetadas e identificar o fitoplasma presente nas árvores doentes. Para isto foram utilizadas as técnicas moleculares de PCR e RFLP, além de análise filogenética. Os resultados revelaram a presença de fitoplasmas em 73% das árvores sintomáticas analisadas, evidenciando que os sintomas observados no campo eram induzidos por fitoplasma. A doença foi denominada de vassoura-de-bruxa da oliveira. A identificação molecular permitiu classificar o fitoplasma como um representante do grupo 16SrVII-B. Este é o primeiro relato da ocorrência de fitoplasma em plantas de oliveira no Brasil. Em termos mais amplos, é o primeiro relato da associação de um fitoplasma do grupo 16SrVII com a doença vassoura-de-bruxa da oliveira, a qual, em outros países, está associada a fitoplasmas distintos do fitoplasma identificado no presente trabalho. / Phytoplasmas are causal agents of diverse diseases occurring in numerous botanical species, among them cultivated, weeds and wild plants. They are wall-less prokaryotes, obligate intracellular parasites, inhabitants of phoem vessels and hemolymph, and naturally transmitted by insect vectors belonging to the group of the leafhoppers. Olive trees exhibiting symptoms typically induced by phytoplasmas, characterized by slow growth and shoot proliferation with small leaves, were observed in the municipality of Extrema (MG). The anomaly provokes significant damage due to the delay in the beginning of the production and yield reduction of the crop. Similar symptoms have been reported in olive orchards cultivated in other countries, where the disease was associated with phytoplasmas. The objective of the present investigation was to demonstrate the association of phytoplasma with affected plants and identify the phytoplasma present in diseased trees. PCR assays, RFLP analysis and phylogenetic analysis were used to molecular characterization of the phytoplasma. The results revealed the presence of phytoplasma in 73% of the symptomatic trees, evidencing that the symptoms observed in field were induced by phytoplasma. The disease was designated by olive witches\" broom. The molecular identification allowed classify the phytoplasma as a representative of the 16SrVII-B group. This is the first report of the occurrence of phytoplasma in olive plants in Brazil. Moreover, this is also the first report of the association of a group 16SrVII phytoplasma with olive whitches\" broom disease, which has been described in other countries in association with phytoplasmas different from the phytoplasma identified in the present study.

Plantas apresentando folhas com deformações do tipo bolhas, menor quantidade de vagens de tamanho reduzido e contendo menor número de sementes, vagens que não completaram a maturação e coloração verde da parte aérea no final do ciclo foram observadas em campos de produção. As plantas foram analisadas visando à detecção de fitoplasmas e a sua identificação molecular. Para isto, o DNA total das plantas amostradas foi submetido ao teste de duplo PCR conduzido com primers específicos para a região do 16S rDNA de fitoplasmas. As amplificações evidenciaram que fitoplasmas estavam presentes em tecidos de plantas sintomáticas. O duplo PCR realizado com primers grupo-específicos revelou a ocorrência de fitoplasmas afiliados aos grupos 16SrI e 16SrIII. As análises virtuais de RFLP, baseadas no sequenciamento da referida região genômica, permitiram identificar um dos fitoplasmas como pertencente ao subgrupo 16SrI-B. Os valores de coeficientes de similaridade, calculados com base nos padrões de restrição gerados in silico por 17 enzimas, confirmaram a identidade deste fitoplasma. Ainda, mapas de restrição mostraram que o fitoplasma encontrado em plantas de soja apresentava sítios putativos de restrição idênticos a um fitoplasma típico do grupo 16SrI-B. A análise filogenética, envolvendo o fitoplasma alvo deste estudo e fitoplasmas representantes de alguns grupos e subgrupos relatados no Brasil, mostrou que o fitoplasma da soja estava estritamente relacionado com aqueles componentes do grupo 16SrI. O fitoplasma em estudo emergiu do mesmo ramo da árvore filogenética também compartilhado por fitoplasmas do grupo 16SrI, confirmando os resultados dos demais testes moleculares. Os resultados gerados neste trabalho evidenciaram que a soja pode ser considerada como mais um hospedeiro de fitoplasmas pertencentes aos grupos 16SrI e 16SrIII, os quais tem sido relatados em associação com diversas doenças de plantas que ocorrem no Brasil. Este estudo também gera informações que podem contribuir para aumentar os conhecimentos sobre este emergente grupo de agentes causais de doença. / Plants exhibiting leaf deformation type bubbles, low quantities of pods of reduced size containing few seeds, pods not mature, and green color of stem and leaves in the end of crop growth were observed in commercial fields. The plants were tested for the detection of phytoplasmas and their molecular identification. For this, the total DNA of plants sampled was submitted to nested PCR assays conducted with universal primers for amplification of a fragment corresponding to the 16S rDNA of phytoplasmas. The amplifications revealed the presence of phytoplasmas in tissues of symptomatic plants. For identification, nested PCR performed with group-specific primers demonstrated the occurrence of phytoplasmas affiliated to the groups 16SrI and 16SrIII. The virtual RFLP analysis, based on the sequencing of DNA fragments generated from nested PCR with universal primers, allowed the identification of a phytoplasma belonging to the subgroup 16SrI-B. The values of similarity coefficients, calculated on the basis of restriction patterns generated in silico for 17 enzymes, confirmed the identity of this phytoplasma. Furthermore, restriction maps showed that the phytoplasma found in soybean plants had putative restriction sites identical to those phytoplasma of the group 16SI-B. Phylogenetic analysis, involving the phytoplasma identified in the present study and representatives of some groups and subgroups previously reported in Brazil, showed that the soybean phytoplasma was closely related to phytoplasmas belonging to group 16SrI. The studied phytoplasma and phytoplasmas belonging to group 16SrI emerged from the same branch, confirming the results obtained by PCR and RFLP analysis. Also, based on the results, soybean could be considered as a host for phytoplasmas belonging to the group 16SrI and 16SrIII, which has been reported in association with various diseases that occur in Brazil. The present study may contribute to improve the knowledge about this emerging group of causal agents of disease.

As brássicas compreendem diversas espécies de grande relevância comercial dentre as demais espécies olerícolas cultivadas no Brasil. A região localizada próxima à cidade de São Paulo (SP) tem se destacado no cultivo de brássicas, especialmente do repolho, da couve-flor e do brócolis. Em campos de cultivo destas espécies, tem sido observadas plantas exibindo redução de tamanho, inflorescências mal formadas, avermelhamento de folhas e necrose dos vasos condutores. Investigações tem mostrado que estas anormalidades estão associadas aos fitoplasmas e a doença tem sido denominada enfezamento. Ainda, estudos anteriores têm sugerido a ocorrência de algumas espécies de cigarrinhas potencialmente vetoras destes fitoplasmas. Considerando estas informações, o presente trabalho teve por objetivo identificar espécies transmissoras de fitoplasmas para plantas de brócolis, buscando aumentar os conhecimentos sobre os vetores de fitoplasmas envolvidos com o enfezamento desta cultura. Para isto, foram coletados insetos no interior e áreas marginais de campos cultivados. Estes insetos foram separados em grupos, identificados taxonomicamente e confinados em plantas sadias de brócolis. A avaliação da transmissão foi feita com base na detecção de fitoplasmas nos tecidos dos insetos e das plantas, usando-se a técnica de PCR duplo, com primers específicos para identificação de fitoplasmas do grupo 16SrIII. A sobrevivência dos insetos nas plantas de brócolis foi pouco duradoura, não excedendo 48 horas. A transmissão experimental foi constatada em 30% das plantas inoculadas. Dentre as 8 potenciais espécies de vetores que foram testadas, as espécies Atanus nitidus, Balclutha hebe, Agalliana sticticollis e Agallia albidula transmitiram fitoplasma para plantas de brócolis. Os resultados deste estudo confirmaram aqueles obtidos nas investigações anteriores, as quais sugeriam a ocorrência de potenciais espécies vetoras de fitoplasmas dentre aquelas presentes nos campos de cultivo. No entanto, o conhecimento de detalhes sobre a transmissão necessita de estudos com populações sadias e infectivas das espécies vetoras, sob condições controladas. Apesar desta necessidade, uma etapa importante foi cumprida no presente trabalho, o qual se constitui numa contribuição relevante tanto para o conhecimento de aspectos epidemiológicos relacionados à disseminação do agente causal do enfezamento do brócolis como para a área de conhecimento relacionada à transmissão de patógenos por insetos vetores, nas condições brasileiras. / Cole crops include several species of commercial importance among the vegetable crops cultivated in Brazil. The region located near the city of São Paulo (SP) has excelled in the cultivation of brassica, especially cabbage, cauliflower and broccoli. In cultivated fields with these species have been observed plants showing reduction of size, malformed inflorescences, reddening of leaves and necrosis of region of vessels. Previous investigations have shown that these abnormalities are associated with phytoplasmas and the disease has been called stunt. In addition, previous studies have suggested the occurrence of some species of leafhoppers potentially vectors of phytoplasmas. Considering this information, the present study aimed to identify species that transmit phytoplasmas to plants of broccoli, seeking to increase knowledge about vectors of phytoplasmas involved with this culture. Thus, insects were collected within and in marginal areas of cultivated fields. These insects were separated into groups, taxonomically identified and confined in healthy plants of broccoli. The evaluation of transmission was based on detection of phytoplasmas in the tissues of plants and insects using the technique of nested PCR with specific primers for identification of phytoplasmas group 16SrIII. The survival of insects on plants of broccoli was short-lived, not exceeding 48 hours. The experimental transmission was observed in 30% of inoculated plants. Among the 8 potential vector species that were tested, the species Atanus nitidus, Balclutha hebe, Agalliana sticticollis and Agallia albidula transmitted phytoplasma to plants of broccoli. The results of the present study confirmed those obtained in previous research, which suggested the occurrence of potential vector species of phytoplasmas among those present in crop fields. However, details about these species as vectors require the creation of healthy populations of these species and infective for broadcast demonstration in controlled conditions. Despite this need, an important step has been accomplished in this work, which constitutes a significant contribution both to the knowledge of epidemiological aspects related to the spread of causal agent of broccoli stunt and the area of knowledge related to the transmission of pathogens by insects vectors, the Brazilian conditions.

Recentemente, um fitoplasma do grupo 16SrIX foi associado a plantas de citros com sintomas de huanglongbing (HLB) no Estado de São Paulo. No entanto, em razão da ampla diversidade de fitoplasmas que tem se observado em várias culturas no Brasil, seria possível que além do fitoplasma do grupo16SrIX, outros fitoplasmas também pudessem estar associados a plantas de citros no Estado de São Paulo. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi investigar se outros fitoplasmas, além daquele do grupo 16SrIX, estão associados a plantas de citros no Estado de São Paulo. Amostras foliares de plantas de citros, plantas daninhas e cicadelídeos foram coletados entre os meses de Junho a Outubro de 2010, em pomares localizados em quatro municípios: Araraquara, Bebedouro, Piracicaba e Taquarituba. Análises de nested PCR evidenciaram a presença de fitoplasmas associados a plantas de citros (sintoma: clorose foliar); a plantas daninhas: Bidens pilosa (sintomas: filodia e virescência), Leonorus sibiricus (sintoma: deformação foliar), Solanum americanus (sintoma: superbrotamento foliar), Erigeron bonariensis (sintomas: avermelhamento e superbrotamento foliar) e Euphorbia heterophylla (sintoma: deformação foliar); e a cicadelídeos da espécie Agallia albidula (Uhler, 1895) (subfamília Agalliinae). A confirmação da presença e caracterização molecular dos fitoplasmas foi realizada através de análises de RFLP e seqüenciamento da região 16S rDNA. Uma ampla diversidade de fitoplasmas foi identificada. Fitoplasmas dos grupos 16SrIII e 16SrIX foram associados a plantas de citros em Piracicaba, enquanto um fitoplasma do grupo 16SrVII foi associado a plantas de citros em Bebedouro. Fitoplasmas do grupo 16SrIII foram associados a plantas daninhas das espécies B. pilosa, L. sibiricus e S. americanus em Piracicaba e fitoplasmas do grupo 16SrVII foram associados a plantas de E. bonariensis e E. heterophylla em Piracicaba e Taquarituba, respectivamente. Um fitoplasma do grupo 16SrIII foi associado a A. albidula em Taquarituba, sugerindo ser este um potencial inseto vetor de fitoplasmas em pomares de citros. Com base na análise da região 16S rDNA, muitos dos fitoplasmas encontrados apresentaram-se distintos dos fitoplasmas já relatados. Em virtude disto, estes fitoplasmas foram propostos como representantes de novos subgrupos pertencentes aos grupos 16SrIII, 16SrVII e 16SrIX. Os resultados obtidos neste estudo não nos permite a associação dos fitoplasmas encontrados com o HLB ou qualquer outra doença já descrita, sendo, portanto, necessários mais estudos visando confirmar o papel destes fitoplasmas como patógenos de citros e plantas daninhas. / Recently a phytoplasma of the 16SrIX group was associated with citrus trees exhibiting symptoms of huanglongbing (HLB) in Sao Paulo state. However, due to the wide diversity of phytoplasmas that have been observed in several crops in Brazil, it is possible that in addition to the phytoplasma of group 16SrIX other phytoplasmas could also be associated with citrus trees. Therefore, the objective of this study was to investigate if others phytoplasmas besides that of the 16SrIX group are associated with citrus plants in the São Paulo state. Leaf samples from citrus trees, weeds and cicadellids were collected between June and October of 2010 from citrus orchards of four municipalities of the Sao Paulo state: Araraquara, Bebedouro, Piracicaba and Taquarituba. Nested PCR analysis revealed the presence of phytoplasmas associated with citrus trees (symptom: leaf chlorosis), weeds: Bidens pilosa (symptoms: phyllody and virescence), Leonorus sibiricus (symptom: leaf distortion), Solanum americanus (symptom: witches broom), Erigeron bonariensis (symptoms: redning and witches broom) e Euphorbia heterophylla (symptom: leaf distortion); and cicadellids of specie Agallia albidula (Uhler, 1895) (subfamily Agalliinae). The confirmation of the phytoplasma presence and molecular characterization was carried out by RFLP analysis and sequencing of the 16S rDNA region. A wide diversity of phytoplasmas was verified. Phytoplasmas of the 16SrIII and 16SrIX groups were associated with citrus trees in Piracicaba, while a phytoplasma of the 16SrVII group was associated with citrus trees in Bebedouro. Phytoplasmas of the 16SrIII group were associated with weeds belonging to the species B. pilosa, S. americanus and L. sibiricus in Piracicaba and a phytoplasma of the 16SrVII group was identified associated with plants of E. bonariensis and E. heterophylla in Piracicaba and Taquarituba, respectively. A phytoplasma of the 16SrIII group was associated with A. albidula in Taquarituba, suggesting that this cicadelid is a potential vector of phytoplasmas in citrus orchards. Based on the analysis of the 16S rDNA region, many of the found phytoplasmas are distinct from those already reported. Due to this distinction, these phytoplasmas were proposed as representatives of new subgroups of the groups 16SrIII, 16SrVII and 16SrIX. The results of this study dont allow us associate the found phytoplasmas with HLB or any other described disease. Thus, more studies are needed to identify the role of theses phytoplasmas as pathogens of citrus trees and weeds.