O Brasil é o segundo maior produtor mundial de soja. Novas tecnologias que possibilitem um aumento na produção desse grão, sem causar impactos no ecossistema, são de grande interesse ambiental, social e econômico. Com objetivo de desenvolver um pacote biotecnológico foram realizados quatro grupos de estudos. Em ensaios in vitro e in vivo foram selecionados, um rizóbio (Ensifer fredii) e duas bactérias promotoras de crescimento vegetal (Pseudomonas fluorescens e Paenibacillus edaphicus) para serem co-inoculadas em sementes de soja. Por meio de estudos em casa-de-vegetação foram desenvolvidas duas tecnologias aplicadas ao inoculante contendo o rizóbio ( fatores Nod e cobamamida), que foram avaliados em conjunto (pacote biotecnológico) em campo de cultivo de soja, que mostrou-se capaz de aumentar a nodulação, o desenvolvimento da planta e rendimento dos grãos dessa leguminosa. / Brazil is the worlds second largest producer of soybean. New technologies that increase the production of this grain, without causing environmental impacts, they are of great enviromental, social and economic importance. In order to develop a biotechnological package it was conducted four study groups. Using in vitro and in vivo assays were selected, one rhizobium (Ensifer fredii) and two plant growth promoters bacterias (Pseudomonas fluorescens e Paenibacillus edaphicus) to b eco-inoculated in soybean seeds. Through studies in greenhouses, two technologies applied to agricultural inoculant have been developed (Nod factors and cobamamide), which were evaluated together (biotecnhological package) in soybean crop field, wich proved capable to increase nodulation, plant growth and yield grain of this legume.

A expansão agrícola tem provocado modificações expressivas na dinâmica de nitrogênio (N) em sistemas tropicais. No Brasil, a expansão dos cultivos de soja é uma realidade e, portanto, investigações a cerca dos processos que controlam o ciclo de nitrogênio nestes sistemas são fundamentais. A fixação biológica de nitrogênio (FBN) por leguminosas pode promover aportes significativos de N nos sistemas agrícolas em solos tropicais, no entanto, o destino destes aportes e o balanço entre entradas e saídas de N não é completamente entendido. Este trabalho teve como objetivo investigar comparativamente a dinâmica de nitrogênio em cultivos de soja e floresta no estado de Mato Grosso, sudeste da Amazônia. Foram determinados o \'delta\'15N e %N do solo e da vegetação, estoques de N e C, N-NO3-, N-NH4+, bem como outras propriedades químicas e físicas do solo em áreas de floresta e em áreas submetidas a cultivos de soja ao longo de uma cronosequência (1, 2, 5 e 6 anos de cultivo). Foram realizadas estimativas de FBN (Fixação Biológica de Nitrogênio) em cultivos de soja utilizando a abundância natural de 15N sob condições de campo. A conversão das áreas de cultivo partiu de pastagem, sendo esta área utilizada como referência inicial quanto aos estoques de N e ao \'delta\'15N do solo. Foi observado um aumento significativo nos estoques de nitrogênio do solo (0 a 10cm) ao longo dos anos de cultivo de soja, estes no entanto, foram menores que os estoques encontrados na floresta. Os estoques de N no solo (0-10cm) variaram de 1230 kg N ha-1 na pastagem a 1370 kg N ha-1 nos cultivos mais antigos. O acúmulo anual de N pela soja foi de 158,6 kg N ha-1 nos cultivos mais antigos, do qual 79% foi derivado da FBN. Não foram encontradas diferenças significativas nas taxas de mineralização e nitrificação líquida entre as áreas, no entanto, altos valores de N-NO3- foram encontrados nas camadas mais profundas de solo em cultivos de soja. Apesar de não serem observadas diferenças significativas no \'delta\'15N do solo entre os cultivos, estes, no entanto, apresentaram valores de \'delta\'15N intermediários entre a pastagem e a floresta. Os resultados indicaram um padrão de acúmulo de nitrogênio ao longo da cronosequência de cultivos de soja, indicando um possível retorno gradual dos estoques de N e do sinal isotópico do solo que ocorriam na floresta antes da conversão para pastagem e cultivo de soja, este retorno, no entanto, não parece acontecer a médio-prazo / Agricultural expansion has greatly changed the nitrogen (N) dynamics in tropical systems. The expanding soybean frontier in Brazil is a reality, and investigations of the processes driving N dynamics in these systems are needed to minimize environmental impacts and to promote the sustainability of agricultural systems. Biological nitrogen fixation (BNF) by legumes can provide significant N inputs to crop systems on highly weathered tropical soils, although the fate of these inputs in the environment and the balance between inputs and outputs of N in these systems is poorly understood. This work investigated N dynamics in a chronosequence of soybean fields (1, 2, 5 and 6 years of cultivation) and mature forest in the Brazilian state of Mato Grosso, which is at the southern limit of the Amazon forest. We measured soil N and C stocks, N-NO3-, N-NH4+ concentration and soil \'delta\'15N as well as biological nitrogen fixation (BNF) inputs by soybean, which were assessed using the 15N natural abundance technique under field conditions. Additional measurements of physical and chemical properties of soils were also provided. The land-use-conversion started from pasture, so this site was used as an initial reference for soil N stocks and soil \'delta\'15N. Mature forest stands on the ranch were also used as an additional reference. Soil N stocks (top 10cm) ranged from 1230 kg N ha-1 in the pasture to 1370 kg N ha-1 in the oldest soybean fields. The trend of increasing N stocks with field age was statistically significant. The annual N accumulation by soybean plant biomass was 158,6 kg N ha-1 in the oldest soy fields, of which 79% was estimated to be derived by BNF, based on the natural abundance technique. There was no statistically significant trend in the mineralization and nitrification rates among the areas. However, extracts of soil profiles showed significant increases in deep soil nitrate concentrations in soybean soils compared to forest soils. There was no statistically significant trend in the soil \'delta\'15N within the chronosequence of soybean fields, although the values were intermediate between the soil \'delta\'15N values found in the pasture and the forest. These results showed a pattern of nitrogen accumulation in the soil along the chronosequence of soybean fields, indicating a possible gradual return to soil N stocks and isotopic signatures occurring in the forest soil before the conversion to pasture and soybean, although this may not happen in the near future

A espécie de cianobactéria Cylindrospermopsis raciborskii pertence a ordem Nostocales e tem a capacidade de realizar a fixação biológica do N2 atmosférico, sintetizar cianotoxinas e também de proliferar em águas doces formando florações de cianobactérias nocivas. A população de C. raciborskii encontrada no Brasil é conhecida por produzir derivados de saxitoxina (STX), enquanto cilindrospermopsinas (CYN), as quais são detectadas em isolados de outros países, não têm sido detectada em isolados brasileiros. Neste estudo, a produção de CYN por dois isolados brasileiros de C. raciborskii, CENA302 e CENA303, submetidos a diferentes condições nutricionais, foi avaliada usando o teste imunológico ELISA específico para detecção de CYN. Em seguida, genes evolvidos na biossíntese de CYN foram buscados no genoma dessas duas linhagens usando amplificações por PCR com iniciadores específicos e posterior sequenciamento Sanger, bem como sequenciamento genômico na plataforma HiScan SQ. Além disso, foram realizadas buscas nos dois genomas obtidos pela plataforma HiScan SQ de genes envolvidos com a síntese de algumas outras moléculas já descritas em cianobactérias, bem como aqueles relacionados com a fixação biológica de N2 e diferenciação do heterócito. Apesar da utilização de diferentes condições nutricionais, não foi detectada a produção de CYN no ensaio de ELISA em ambos os isolados de cianobactérias. No sequenciamento Sanger, dos nove genes sintetases de CYN buscados, quatro foram amplificados e sequenciados na linhagem C. raciborskii CENA302 e três na linhagem CENA303. Estas sequências de nucletídeos foram traduzidas em aminoácidos, e as funções das proteínas e os domínios preditos confirmaram a sua identidade como genes sintetase de CYN. O sequenciamento dos genomas completos das duas linhagens apresentou altos valores de qualidade de bases e elevada cobertura genômica. A busca por genes sintetase de CYN nos dois genomas foi realizada pelo mapeamento por referência das leituras, mostrando que algumas porções do agrupamento estavam contempladas no genoma, representando aproximadamente 10% do agrupamento de CYN. A anotação das regiões entre os genes descritos como flanqueadores do agrupamento CYN mostrou uma inversão gênica indicando a ocorrência de eventos que podem ter levado a perda ou dispersão no genoma deste agrupamento. Os genes anotados relacionados com fixação biológica de N2 e diferenciação do heterócito nas linhagens CENA302 e CENA303 apresentaram altas identidades com genes homólogos descritos em C. raciborskii. A ausência de alguns nucleotídeos no gene hetP envolvido na formação do heterócito possivelmente levou a perda de sua função na C. raciborskii CENA303, impedindo a diferenciação das células vegetativas em heterócitos, uma vez que não foi observado a presença dessa célula diferenciada em nenhuma das condições nutricionais avaliadas. Todos os genes de moléculas bioativas conhecidas de cianobactérias buscados pelo mapeamento por referência das leituras não foram encontrados nos genomas das linhagens C. raciborskii CENA302 e CENA303. Os resultados obtidos neste estudo revelaram a possibilidade de estar ocorrendo eventos evolutivos que estão causando a perda dos genes responsáveis pela síntese de CYN nos isolados brasileiros de C. raciborskii, demonstrando divergência alopátrica. / The cyanobacterial species Cylindrospermopsis raciborskii belongs to the order Nostocales and has the ability to perform biological nitrogen fixation, synthesize cyanotoxins and also to proliferate in freshwaters to form harmful cyanobacterial blooms. The C. raciborskii population from Brazil is known to produces saxitoxin derivatives (STX), while cylindrospermopsin (CYN), which is commonly detected in isolates from other countries, has thus far not been detected in Brazilian strains. In this study, the production of CYN by two Brazilian isolates of C. raciborskii CENA302 and CENA303, under different nutritional conditions, was evaluated using ELISA immunoassay specific for the detection of CYN. Then, genes involved in the biosynthesis of CYN were searched in the genome of these two strains using PCR amplification with specific primers and subsequent Sanger sequencing, as well as genomic sequencing on the platform HiScan SQ. Furthermore, searches were performed in the two genomes obtained by the platform HiScan SQ of genes involved in the synthesis of several other molecules already described in cyanobacteria, as well as those related to the biological N2 fixation and heterocyte differentiation. Despite the use of different nutritional conditions, no CYN production was detected by the ELISA assay for both cyanobacterial isolates. In the Sanger sequencing, of the nine CYN synthetase gene searched, four were amplified and sequenced in the C. raciborskii strain CENA302 and three in the strain CENA303. These nucleotide sequences were translated into amino acids, and the predicted protein functions and domains confirmed their identity as CYN synthetase genes. The complete genome sequencing of the two strains showed high values of bases quality and high genomic coverage. The search for CYN synthetase genes in the two genomes was performed by mapping reads to reference, showing that some portions of the cluster were contemplated in the genome, representing approximately 10% of CYN cluster. The annotation of regions between the genes described as flanking the CYN cluster showed a gene inversion indicating the occurrence of events that may have caused the loss or dispersion in the genome of this cluster. The annotated genes related to biological N2 fixation and heterocyte differentiation in the CENA302 and CENA303 strains showed high identities with homologous genes from other strains of C. raciborskii. The absence of a few nucleotides in the hetP gene involved in the heterocyte formation perhaps led to the loss of its function in the C. raciborskii CENA303, preventing the differentiation of vegetative cells into heterocyte, since it was not observed the presence of this differentiated cell in any of the nutritional conditions evaluated. All genes of known cyanobacterial molecules searched by mapping reads to reference were not found in the genomes of the C. raciborskii strains CENA302 and CENA303. The results of this study revealed the possibility of being occurring evolutionary events that are leading to loss of the genes responsible for the synthesis of CYN in the C. raciborskii Brazilian isolates, demonstrating allopatric divergence.

O desenvolvimento de tecnologias alternativas que visem aumentar a disponibilidade e eficiência do uso dos recursos minerais para as plantas aparecem como importante medida para se alcançar um crescimento sustentável da agricultura. Neste contexto, o suprimento de nitrogênio por meios biológicos, utilizando micro-organismos diazotróficos, dos quais os mais estudados são os rizóbios associados simbioticamente às leguminosas, é uma importante alternativa. Porém o sucesso atingido com essa simbiose em leguminosas ainda não foi alcançado em outras famílias de plantas, principalmente por limitações associadas à otimização das combinações planta-bactéria. Em gramíneas, diazotróficos endofíticos têm sido usados como inoculante, com resultados controversos. No entanto, é possível que micro-organismos diazotróficos epifíticos possam apresentar maior vantagem adaptativa devido à menor especificidade em sua relação com a planta, e serem mais eficientes em plantas não-leguminosas. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito de um inoculante produzido a partir de bactérias diazotróficas isoladas da filosfera no crescimento de milho e tomateiro. Ensaios foram realizados em condições de casa-de-vegetação, utilizando-se três diferentes isolados de bactérias diazotróficas encapsuladas em esferas de alginato sob diferentes níveis de adubação nitrogenada. A eficiência dos isolados em fixar nitrogênio foi avaliada através da atividade da nitrogenase. As populações de diazotróficos na rizosfera foram determinadas através da técnica do número mais provável (NMP) ao final do ensaio. Além disso, parâmetros como biomassa da parte aérea e das raízes foram analisados. Os dados foram submetidos à análise de variância, sendo as médias das variáveis comparadas pelo teste Duncan (p<0,05), utilizando-se o programa estatístico R. Plantas de milho, aos 60 dias após a inoculação com o isolado J8L, apresentaram matéria seca da raiz e atividade da nitrogenase 26 e 50 % superior ao controle não-inoculado, respectivamente. Plantas de tomateiro, 30 dias após a inoculação com o isolado E5L, apresentaram matéria seca da parte aérea e matéria seca da raiz 39 e 31 % superior ao controle não-inoculado, respectivamente. Parte dos efeitos observados no milho e tomateiro podem ser explicados pela atividade de fixação biológica de nitrogênio e produção de fitormônios, como auxina. A atividade da nitrogenase na rizosfera do milho, 60 dias após a inoculação foi maior no solo sem adição de N. O NMP não apresentou diferenças significativas e nos ensaios com milho e tomateiro, entre plantas inoculadas e não inoculadas, mostrando uma provável influência da comunidade diazotrófica nativa sobre a população final de diazotróficas analisada. De uma maneira geral, os isolados J8L e E5L proporcionaram ganhos significativos para as culturas do milho e tomateiro, mostrando potencial para uso como biofertilizantes. / The development of alternative technologies to increasing availability and use efficiency of mineral resources for plants is an important step for sustainable agricultural production. In this context, the supply of nitrogen by biological means, using diazotrophic microorganisms, of which the most studied are rhizobia symbiotically associated with legumes, is an important alternative. However, the efficiency of rhizobium-legume symbioses has not yet been achieved in other plant families, mainly due to limitations associated with the optimization of plant-bacterial combinations. In grasses, endophytic diazotrophs have been used as inoculant, with controversial results. However, it is possible that epiphytic diazotrophic microorganisms may have adaptive advantages over endophytes, due to the lower specificity in their associations with plants, and be more efficient in non-leguminous plants. The objective of the present work was to evaluate the effect of an inoculant produced with diazotrophic bacteria isolated from the phyllosphere on the growth of maize and tomato. Assays were carried out under greenhouse conditions using three isolates of diazotrophic bacteria encapsulated in alginate beads under different levels of nitrogen fertilization. The efficiency of the isolates in fixing nitrogen was evaluated determining nitrogenase activities. The populations of diazotrophic bacteria in the rhizosphere were determined by the most probable number (MPN) technique at the end of the experiment. In addition, parameters such as shoot and root biomass were analyzed. The data were submitted to the analysis of variance, and means were compared by the Duncan test (p<0.05), using the statistical program R. Maize plants at 60 days after inoculation with the J8L isolate presented root dry weight and nitrogenase activity in the rhizosphere 26 and 50% higher than the uninoculated control, respectively. Tomato plants, 30 days after inoculation with the E5L isolate, presented shoot and root dry weight 39 and 31% higher than the uninoculated control, respectively. Part of the effects observed in maize and tomato can be explained by the nitrogen fixation activity and auxin production. Nitrogenase activity in the maize rhizosphere, 60 days after inoculation was higher in the soil without N supply. The population of diazothrophic bacteria in the rhizosphere of inoculated and non-inoculated maize and tomato plants were not significantly different, showing a probable influence of the native diazotrophic community on the total diazotrophic population. In general, isolates J8L and E5L promoted growth of maize and tomato, showing potential for use as biofertilizers.

O desenvolvimento de tecnologias alternativas que visem aumentar a disponibilidade e eficiência do uso dos recursos minerais para as plantas aparecem como importante medida para se alcançar um crescimento sustentável da agricultura. Neste contexto, o suprimento de nitrogênio por meios biológicos, utilizando micro-organismos diazotróficos, dos quais os mais estudados são os rizóbios associados simbioticamente às leguminosas, é uma importante alternativa. Porém o sucesso atingido com essa simbiose em leguminosas ainda não foi alcançado em outras famílias de plantas, principalmente por limitações associadas à otimização das combinações planta-bactéria. Em gramíneas, diazotróficos endofíticos têm sido usados como inoculante, com resultados controversos. No entanto, é possível que micro-organismos diazotróficos epifíticos possam apresentar maior vantagem adaptativa devido à menor especificidade em sua relação com a planta, e serem mais eficientes em plantas não-leguminosas. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito de um inoculante produzido a partir de bactérias diazotróficas isoladas da filosfera no crescimento de milho e tomateiro. Ensaios foram realizados em condições de casa-de-vegetação, utilizando-se três diferentes isolados de bactérias diazotróficas encapsuladas em esferas de alginato sob diferentes níveis de adubação nitrogenada. A eficiência dos isolados em fixar nitrogênio foi avaliada através da atividade da nitrogenase. As populações de diazotróficos na rizosfera foram determinadas através da técnica do número mais provável (NMP) ao final do ensaio. Além disso, parâmetros como biomassa da parte aérea e das raízes foram analisados. Os dados foram submetidos à análise de variância, sendo as médias das variáveis comparadas pelo teste Duncan (p<0,05), utilizando-se o programa estatístico R. Plantas de milho, aos 60 dias após a inoculação com o isolado J8L, apresentaram matéria seca da raiz e atividade da nitrogenase 26 e 50 % superior ao controle não-inoculado, respectivamente. Plantas de tomateiro, 30 dias após a inoculação com o isolado E5L, apresentaram matéria seca da parte aérea e matéria seca da raiz 39 e 31 % superior ao controle não-inoculado, respectivamente. Parte dos efeitos observados no milho e tomateiro podem ser explicados pela atividade de fixação biológica de nitrogênio e produção de fitormônios, como auxina. A atividade da nitrogenase na rizosfera do milho, 60 dias após a inoculação foi maior no solo sem adição de N. O NMP não apresentou diferenças significativas e nos ensaios com milho e tomateiro, entre plantas inoculadas e não inoculadas, mostrando uma provável influência da comunidade diazotrófica nativa sobre a população final de diazotróficas analisada. De uma maneira geral, os isolados J8L e E5L proporcionaram ganhos significativos para as culturas do milho e tomateiro, mostrando potencial para uso como biofertilizantes. / The development of alternative technologies to increasing availability and use efficiency of mineral resources for plants is an important step for sustainable agricultural production. In this context, the supply of nitrogen by biological means, using diazotrophic microorganisms, of which the most studied are rhizobia symbiotically associated with legumes, is an important alternative. However, the efficiency of rhizobium-legume symbioses has not yet been achieved in other plant families, mainly due to limitations associated with the optimization of plant-bacterial combinations. In grasses, endophytic diazotrophs have been used as inoculant, with controversial results. However, it is possible that epiphytic diazotrophic microorganisms may have adaptive advantages over endophytes, due to the lower specificity in their associations with plants, and be more efficient in non-leguminous plants. The objective of the present work was to evaluate the effect of an inoculant produced with diazotrophic bacteria isolated from the phyllosphere on the growth of maize and tomato. Assays were carried out under greenhouse conditions using three isolates of diazotrophic bacteria encapsulated in alginate beads under different levels of nitrogen fertilization. The efficiency of the isolates in fixing nitrogen was evaluated determining nitrogenase activities. The populations of diazotrophic bacteria in the rhizosphere were determined by the most probable number (MPN) technique at the end of the experiment. In addition, parameters such as shoot and root biomass were analyzed. The data were submitted to the analysis of variance, and means were compared by the Duncan test (p<0.05), using the statistical program R. Maize plants at 60 days after inoculation with the J8L isolate presented root dry weight and nitrogenase activity in the rhizosphere 26 and 50% higher than the uninoculated control, respectively. Tomato plants, 30 days after inoculation with the E5L isolate, presented shoot and root dry weight 39 and 31% higher than the uninoculated control, respectively. Part of the effects observed in maize and tomato can be explained by the nitrogen fixation activity and auxin production. Nitrogenase activity in the maize rhizosphere, 60 days after inoculation was higher in the soil without N supply. The population of diazothrophic bacteria in the rhizosphere of inoculated and non-inoculated maize and tomato plants were not significantly different, showing a probable influence of the native diazotrophic community on the total diazotrophic population. In general, isolates J8L and E5L promoted growth of maize and tomato, showing potential for use as biofertilizers.

Manguezais são ecossistemas de transição entre ambientes terrestres e marinhos encontrados em regiões tropicais e subtropicais. A ampla faixa de variações de salinidade e teor oxigênio, típica desses ambientes, está entre os principais fatores condicionantes da colonização e desenvolvimento da biota. Apesar disso, são ambientes com elevada produção primária. Entre os nutrientes, o nitrogênio é um dos principais fatores limitantes que afetam o desenvolvimento da vegetação do manguezal e somente baixa disponibilidade de formas reduzidas está presente. Portanto, há a necessidade de determinar os micro-organismos fixadores de nitrogênio que colonizam os ecossistemas de manguezais. Dentre esses, existem as cianobactérias, um grupo bem conhecido de micro-organismos fotossintéticos oxigênicos e fixadores de nitrogênio. Neste estudo, 50 linhagens de cianobactérias foram isoladas de amostras ambientais de solos, água e material perifítico, coletadas nos ecossistemas de manguezais da Ilha do Cardoso e Bertioga, São Paulo. Essas linhagens foram isoladas usando meios específicos de crescimento e análises morfológicas identificaram representantes das ordens Chroococcales (35 linhagens, 70%), Oscillatoriales (9 linhagens, 18%) e Nostocales (6 linhagens, 12%). Dezesseis linhagens distribuídas entre as ordens Chroococcales e Nostocales foram selecionadas para os estudos de filogenia usando o gene rpoC1. A maioria das sequências de rpoC1 geradas pela amplificação por PCR usando o conjunto específico de primer rpoC1-1/rpoC1-T mostraram baixas similaridades (menor que 90%) com seqüências disponíveis no GenBank, indicando que estas linhagens de cianobactérias são únicas. As exceções foram somente duas linhagens (Synechococcus sp. CENA177 and Cyanothece sp. CENA169) que apresentaram altas similaridades com sequências de cianobactérias isoladas de ambientes de água doce do Brasil. A análise filogenética Neighbor-Joining mostrou que várias das novas linhagens cianobactérias dos manguezais se agruparam, sem relação com a descrição taxonômica baseada na caracterização morfotípica. Uma busca pelo gene funcional nifH, o qual codifica para a redutase da nitrogenase, em 27 isolados dos manguezais, revelou a sua presença em 21 linhagens (77%) dispersas entre as ordens Chroococcales, Oscillatoriales e Nostocales. Os 21 fragmentos do gene nifH amplificados foram clonados e seqüenciados e todas as sequências também mostram baixas similaridades (menor que 95%) com seqüências de cianobactérias disponíveis no GenBank. A análise filogenética do gene nifH posicionou as novas linhagens de cianobactérias dos manguezais em vários agrupamentos distribuídos ao longo da árvore, e como também observado para o gene rpoC1, sem correlação com a descrição taxonômica baseada na caracterização morfotípica. Atividade da nitrogenase, avaliada pela técnica de redução de acetileno, foi encontrada em cinco linhagens pertencentes à ordem Nostocales e em uma linhagem pertencente à ordem Chroococcales. A estimativa da fixação biológica de nitrogênio por essas linhagens variaram de 327,01 a 1.954,15 pmol N2.g-1 de biomassa seca.dia-1. / Mangroves are transitional ecosystems between terrestrial and marine environments found in tropical and subtropical regions. The broad range of variations of salinity and oxygen content, typical of these environments, is among the main constraint factors for the establishment and development of biota. Nevertheless, mangroves have high primary production. Among the nutrients, nitrogen is one of the most important limiting factors affecting the development of mangrove vegetation and only low availability of reduced forms is present. Therefore, there is a need to determine the nitrogen fixing microorganisms that colonize mangrove ecosystems. Among those, there are the cyanobacteria, a well known group of oxygenic photosynthetic and nitrogen fixing microorganisms. In this study, 50 cyanobacterial strains were isolated from environmental samples of soil, water and periphytic material collected in the Cardoso Island and Bertioga mangrove ecosystems, São Paulo. These strains were isolated using specific growth media and morphological analyses identified representatives of the orders Chroococcales (35 strains, 70%), Oscillatoriales (9 strains, 18%) and Nostocales (6 strains, 12%). Sixteen strains belong to the orders Chroococcales and Nostocales were selected for phylogeny studies using the gene rpoC1. The majority of rpoC1 sequences generated by PCR amplification using the specific set primer rpoC1-1/rpoC1-T showed low similarities (below 90%) with sequences available in the GenBank, indicating that these cyanobacterial strains are unique. The exceptions were only two strains (Synechococcus sp. CENA177 and Cyanothece sp. CENA169) that had high similarities with cyanobacterial sequences isolated from Brazilian freshwater environments. The Neighbor-Joining phylogenetic analysis showed that several of the new mangrove cyanobacterial strains clustered together, with no relationship with the taxonomical description based on morphotypic characterization. A search for the functional nifH gene, which coding for nitrogenase reductase, on 27 mangrove isolates revealed its presence in 21 strains (77%) dispersed among the orders Chroococcales, Oscillatoriales and Nostocales. The 21 amplified fragments of nifH were cloned and sequenced, and all the sequences also showed low similarities (below 95%) with cyanobacterial sequences available in the GenBank. The phylogenetic analysis of nifH gene positioned the new mangrove cyanobacterial strains in several clusters distributed along the tree, and as also observed for rpoC1 gene, with no correlation with the taxonomical description based on morphotypic characterization. Nitrogenase activity, measured by the acetylene reduction technique, was found in five strains belonging to the order Nostocales and one strain belonging to the order Chroococcales. The estimation of biological nitrogen fixation by these strains ranged from 327.01 to 1954.15 pmol N2.g-1 dry biomass.day-1.

Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2016-08-29T13:19:29Z No. of bitstreams: 1 PDF - Maria Idaline Pessoa Cavalcanti.pdf: 3126151 bytes, checksum: 7cc5f06fc9b1c13fe29f35bf6febb0b7 (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2016-08-29T17:03:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Maria Idaline Pessoa Cavalcanti.pdf: 3126151 bytes, checksum: 7cc5f06fc9b1c13fe29f35bf6febb0b7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-29T17:03:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Maria Idaline Pessoa Cavalcanti.pdf: 3126151 bytes, checksum: 7cc5f06fc9b1c13fe29f35bf6febb0b7 (MD5) Previous issue date: 2016-04-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Little information have now been raised about the diversity and biotechnological potential of soil microorganisms in the semiarid region, especially those associated with grasses The biological nitrogen fixation process (BNF) is the main form of nitrogen input (N) natural ecosystems and is brokered by diazotrophic symbiotic microorganisms or living free the aim of this study was to isolate and characterize, through biochemical and genetic methods, a collection of bacteria associated with maize (Zea mays) present in semi-arid soils using three different methodological approaches: (i) directly semisolid medium, (ii) directly on solid medium and (iii) using a leguminous plant as bait for obtaining the rhizobia associated with corn. 405 bacterial isolates were obtained which were characterized morphologically and genotypically. With respect to the biotechnological potential 92% of the isolates produced indole-3-acetic acid (IAA), 30% solubilized calcium phosphate and 19% siderophores produced. It was confirmed antagonist activity to the fungus Fusarium oxysporum in the three methods studied. The restriction analysis (ARDRA) showed that the place of origin of the isolates was a determining factor for the group of bacteria. A total of 79 isolates were selected for growth promotion test vessels. The DBG10 and PBG82 isolated provide greater benefits to plants when inoculated in corn seeds tested in experimental vessels, being more efficient with respect to FBN, to cultivate corn BRS Gorutuba. / Poucas informações foram até hoje levantadas a respeito da diversidade e do potencial biotecnológico dos micro-organismos do solo no Semiárido, principalmente daqueles associados a gramíneas O processo de fixação biológica de nitrogênio (FBN) é a principal forma de entrada de nitrogênio (N) em ecossistemas naturais e é interme diado por micro-organismos diazotróficos simbióticos ou de vida livre O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar, por meio de métodos bioquímicos e genéticos, uma coleção de bactérias associadas ao milho (Zea mays) presentes em solos do Semiárido, utilizando três diferentes abordagens metodológicas: (i) diretamente em meio semissólido,(ii) diretamente em meio sólido e (iii) utilizando uma leguminosa como planta isca para a obtenção dos rizóbios associados ao milho. Foram obtidos 405 isolados bacterianos os quais foram caracterizados morfológica e genótipicamente. Com relação ao potencial biotecnológico, 92% dos isolados produziram ácido indol-3-acético (AIA), 30% solubilizaram fosfato de cálcio e 19% produziram sideróforos. Foi confirmada atividade antagonista ao fungo Fusarium oxysporum nas três metodologias estudadas. A análise de restrição (ARDRA) mostrou que o local de origem dos isolados foi fator determinante para o agrupamento das bactérias. Um total de 79 isolados foram selecionados para os ensaio de promoção de crescimento em vasos. Os isolados DBG10 e PBG82 proporcionam maiores benefícios às plantas quando inoculados nas sementes de milho testadas em experimento de vasos, sendo mais eficiente com relação a FBN, para a cultivar de milho BRS Gorutuba.

Made available in DSpace on 2017-07-10T17:37:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Juliane_Mendes_Lemos.pdf: 814932 bytes, checksum: d5552cb87a1e9440a5ef0c02727bb9e4 (MD5) Previous issue date: 2011-03-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Wheat is an important crop for human consumption. With the intensification of agriculture and agribusiness in Brazil. Therefore, the demand for nitrogen fertilizers has increased substantially. The use of nitrogen fertilizers increases the production cost and the final price of this cereal. Diazotrophs can assist in various mechanisms of nitrogen nutrition in crops. Besides fixing nitrogen, they may promote growth of these plants. The aims of this study were to evaluate the agronomic efficiency of nitrogen fixing bacteria (Azospirillum brasiliense), compared and associated to nitrogen fertilization in wheat (Triticum aestivum), and set among commercial cultivars of wheat, which shows better performance in association with these bacteria. The experiment was conducted in greenhouses in the period from May to September 2010in the Station of Horticulture and Crop Protected "Prof. Dr. Mario Cesar Lopes" in Marechal Candido Rondon - PR. It was used a five wheat cultivars (CD 104, CD 108, CD 119, CD 120 and CD 150). The treatments were: inoculated with A. brasiliense (AbV5); application of nitrogen associated with inoculation of A. brasiliense (AbV5); application of nitrogen and a treatment without inoculation and nitrogen application. I was used a randomized design with four replications. It was made two assessments, the first assessment, made in the flowering stage, was evaluated the root dry weight and total nitrogen content. In the second assessment, made at the end of the cycle, was evaluated the following yield components: grain yield and protein content in grains. It was observed difference in response between wheat cultivars when inoculated with A. brasiliense (AbV5), and/or treatment associated with nitrogen. The CD 150 cultivar presented the highest content of nitrogen in shoots, mass of 1.000 grains and NH4+ in roots inoculated with bacteria in combination with nitrogen fertilization, the increase was about 22,4%, 10,5% and 116,8%, respectively, compared to nitrogen fertilization. These results showed a positive interaction of nitrogen fixing bacteria and nitrogen fertilization with the wheat cultivar CD 150 / O trigo é uma cultura de grande importância para a alimentação humana. Com a intensificação da agricultura e do agronegócio no Brasil, a demanda por fertilizantes nitrogenados tem aumentado substancialmente. A utilização de fertilizantes nitrogenados aumenta o custo de produção e, portanto, o preço final deste cereal. As bactérias diazotróficas podem auxiliar em diversos mecanismos de nutrição nitrogenada em culturas. Além de fixar nitrogênio, esses organismos podem promover o crescimento dessas plantas. Os objetivos desse trabalho foram avaliar a eficiência agronômica da bactéria fixadora de nitrogênio (Azospirillum brasilense), comparada e associada à adubação nitrogenada na cultura do trigo (Triticum aestivum) e definir, dentre cultivares comerciais, qual apresenta melhor desempenho em associação com as bactérias. O experimento foi conduzido sob cultivo protegido no período de maio a setembro de 2010 na Estação de Horticultura e Cultivo Protegido Prof. Dr. Mário César Lopes em Marechal Cândido Rondon PR. Foram utilizados cinco cultivares de trigo brasileiros e cultivados na região (CD 104, CD 108, CD 119, CD 120 e CD 150). Os tratamentos foram: inoculação com A. brasilense (AbV5); adubação nitrogenada em cobertura; inoculação com A. brasilense (AbV5) associado à aplicação de nitrogênio em cobertura e um tratamento sem inoculação e aplicação de nitrogênio, designado como testemunha. O experimento foi feito em delineamento inteiramente casualizado, com quatro repetições. As avaliações foram realizadas no estádio de início da antese. Foram avaliadas a massa seca de raízes, o teor de nitrogênio total na parte aérea e teor de amônio nas raízes. No final do ciclo da cultura avaliou-se os seguintes componentes da produção: rendimento de grãos e o teor de proteínas nos grãos. Foram observadas diferenças de resposta entre as cultivares de trigo quando inoculadas com A. brasilense (AbV5) e ou tratamento associado a adubação nitrogenada. A cultivar CD 150 apresentou os maiores teores de nitrogênio na parte aérea, massa de 1000 grãos e teor de amônio nas raízes, quando inoculadas com a bactéria em associação a adubação nitrogenada, cerca de 22,4%, 10,5% e 116,8% de incremento, respectivamente, em relação à adubação nitrogenada. Esses resultados mostram uma interação positiva da bactéria fixadora de nitrogênio e a adubação nitrogenada com a cultivar de trigo CD 150

A espécie de cianobactéria Cylindrospermopsis raciborskii pertence a ordem Nostocales e tem a capacidade de realizar a fixação biológica do N2 atmosférico, sintetizar cianotoxinas e também de proliferar em águas doces formando florações de cianobactérias nocivas. A população de C. raciborskii encontrada no Brasil é conhecida por produzir derivados de saxitoxina (STX), enquanto cilindrospermopsinas (CYN), as quais são detectadas em isolados de outros países, não têm sido detectada em isolados brasileiros. Neste estudo, a produção de CYN por dois isolados brasileiros de C. raciborskii, CENA302 e CENA303, submetidos a diferentes condições nutricionais, foi avaliada usando o teste imunológico ELISA específico para detecção de CYN. Em seguida, genes evolvidos na biossíntese de CYN foram buscados no genoma dessas duas linhagens usando amplificações por PCR com iniciadores específicos e posterior sequenciamento Sanger, bem como sequenciamento genômico na plataforma HiScan SQ. Além disso, foram realizadas buscas nos dois genomas obtidos pela plataforma HiScan SQ de genes envolvidos com a síntese de algumas outras moléculas já descritas em cianobactérias, bem como aqueles relacionados com a fixação biológica de N2 e diferenciação do heterócito. Apesar da utilização de diferentes condições nutricionais, não foi detectada a produção de CYN no ensaio de ELISA em ambos os isolados de cianobactérias. No sequenciamento Sanger, dos nove genes sintetases de CYN buscados, quatro foram amplificados e sequenciados na linhagem C. raciborskii CENA302 e três na linhagem CENA303. Estas sequências de nucletídeos foram traduzidas em aminoácidos, e as funções das proteínas e os domínios preditos confirmaram a sua identidade como genes sintetase de CYN. O sequenciamento dos genomas completos das duas linhagens apresentou altos valores de qualidade de bases e elevada cobertura genômica. A busca por genes sintetase de CYN nos dois genomas foi realizada pelo mapeamento por referência das leituras, mostrando que algumas porções do agrupamento estavam contempladas no genoma, representando aproximadamente 10% do agrupamento de CYN. A anotação das regiões entre os genes descritos como flanqueadores do agrupamento CYN mostrou uma inversão gênica indicando a ocorrência de eventos que podem ter levado a perda ou dispersão no genoma deste agrupamento. Os genes anotados relacionados com fixação biológica de N2 e diferenciação do heterócito nas linhagens CENA302 e CENA303 apresentaram altas identidades com genes homólogos descritos em C. raciborskii. A ausência de alguns nucleotídeos no gene hetP envolvido na formação do heterócito possivelmente levou a perda de sua função na C. raciborskii CENA303, impedindo a diferenciação das células vegetativas em heterócitos, uma vez que não foi observado a presença dessa célula diferenciada em nenhuma das condições nutricionais avaliadas. Todos os genes de moléculas bioativas conhecidas de cianobactérias buscados pelo mapeamento por referência das leituras não foram encontrados nos genomas das linhagens C. raciborskii CENA302 e CENA303. Os resultados obtidos neste estudo revelaram a possibilidade de estar ocorrendo eventos evolutivos que estão causando a perda dos genes responsáveis pela síntese de CYN nos isolados brasileiros de C. raciborskii, demonstrando divergência alopátrica. / The cyanobacterial species Cylindrospermopsis raciborskii belongs to the order Nostocales and has the ability to perform biological nitrogen fixation, synthesize cyanotoxins and also to proliferate in freshwaters to form harmful cyanobacterial blooms. The C. raciborskii population from Brazil is known to produces saxitoxin derivatives (STX), while cylindrospermopsin (CYN), which is commonly detected in isolates from other countries, has thus far not been detected in Brazilian strains. In this study, the production of CYN by two Brazilian isolates of C. raciborskii CENA302 and CENA303, under different nutritional conditions, was evaluated using ELISA immunoassay specific for the detection of CYN. Then, genes involved in the biosynthesis of CYN were searched in the genome of these two strains using PCR amplification with specific primers and subsequent Sanger sequencing, as well as genomic sequencing on the platform HiScan SQ. Furthermore, searches were performed in the two genomes obtained by the platform HiScan SQ of genes involved in the synthesis of several other molecules already described in cyanobacteria, as well as those related to the biological N2 fixation and heterocyte differentiation. Despite the use of different nutritional conditions, no CYN production was detected by the ELISA assay for both cyanobacterial isolates. In the Sanger sequencing, of the nine CYN synthetase gene searched, four were amplified and sequenced in the C. raciborskii strain CENA302 and three in the strain CENA303. These nucleotide sequences were translated into amino acids, and the predicted protein functions and domains confirmed their identity as CYN synthetase genes. The complete genome sequencing of the two strains showed high values of bases quality and high genomic coverage. The search for CYN synthetase genes in the two genomes was performed by mapping reads to reference, showing that some portions of the cluster were contemplated in the genome, representing approximately 10% of CYN cluster. The annotation of regions between the genes described as flanking the CYN cluster showed a gene inversion indicating the occurrence of events that may have caused the loss or dispersion in the genome of this cluster. The annotated genes related to biological N2 fixation and heterocyte differentiation in the CENA302 and CENA303 strains showed high identities with homologous genes from other strains of C. raciborskii. The absence of a few nucleotides in the hetP gene involved in the heterocyte formation perhaps led to the loss of its function in the C. raciborskii CENA303, preventing the differentiation of vegetative cells into heterocyte, since it was not observed the presence of this differentiated cell in any of the nutritional conditions evaluated. All genes of known cyanobacterial molecules searched by mapping reads to reference were not found in the genomes of the C. raciborskii strains CENA302 and CENA303. The results of this study revealed the possibility of being occurring evolutionary events that are leading to loss of the genes responsible for the synthesis of CYN in the C. raciborskii Brazilian isolates, demonstrating allopatric divergence.

Manguezais são ecossistemas de transição entre ambientes terrestres e marinhos encontrados em regiões tropicais e subtropicais. A ampla faixa de variações de salinidade e teor oxigênio, típica desses ambientes, está entre os principais fatores condicionantes da colonização e desenvolvimento da biota. Apesar disso, são ambientes com elevada produção primária. Entre os nutrientes, o nitrogênio é um dos principais fatores limitantes que afetam o desenvolvimento da vegetação do manguezal e somente baixa disponibilidade de formas reduzidas está presente. Portanto, há a necessidade de determinar os micro-organismos fixadores de nitrogênio que colonizam os ecossistemas de manguezais. Dentre esses, existem as cianobactérias, um grupo bem conhecido de micro-organismos fotossintéticos oxigênicos e fixadores de nitrogênio. Neste estudo, 50 linhagens de cianobactérias foram isoladas de amostras ambientais de solos, água e material perifítico, coletadas nos ecossistemas de manguezais da Ilha do Cardoso e Bertioga, São Paulo. Essas linhagens foram isoladas usando meios específicos de crescimento e análises morfológicas identificaram representantes das ordens Chroococcales (35 linhagens, 70%), Oscillatoriales (9 linhagens, 18%) e Nostocales (6 linhagens, 12%). Dezesseis linhagens distribuídas entre as ordens Chroococcales e Nostocales foram selecionadas para os estudos de filogenia usando o gene rpoC1. A maioria das sequências de rpoC1 geradas pela amplificação por PCR usando o conjunto específico de primer rpoC1-1/rpoC1-T mostraram baixas similaridades (menor que 90%) com seqüências disponíveis no GenBank, indicando que estas linhagens de cianobactérias são únicas. As exceções foram somente duas linhagens (Synechococcus sp. CENA177 and Cyanothece sp. CENA169) que apresentaram altas similaridades com sequências de cianobactérias isoladas de ambientes de água doce do Brasil. A análise filogenética Neighbor-Joining mostrou que várias das novas linhagens cianobactérias dos manguezais se agruparam, sem relação com a descrição taxonômica baseada na caracterização morfotípica. Uma busca pelo gene funcional nifH, o qual codifica para a redutase da nitrogenase, em 27 isolados dos manguezais, revelou a sua presença em 21 linhagens (77%) dispersas entre as ordens Chroococcales, Oscillatoriales e Nostocales. Os 21 fragmentos do gene nifH amplificados foram clonados e seqüenciados e todas as sequências também mostram baixas similaridades (menor que 95%) com seqüências de cianobactérias disponíveis no GenBank. A análise filogenética do gene nifH posicionou as novas linhagens de cianobactérias dos manguezais em vários agrupamentos distribuídos ao longo da árvore, e como também observado para o gene rpoC1, sem correlação com a descrição taxonômica baseada na caracterização morfotípica. Atividade da nitrogenase, avaliada pela técnica de redução de acetileno, foi encontrada em cinco linhagens pertencentes à ordem Nostocales e em uma linhagem pertencente à ordem Chroococcales. A estimativa da fixação biológica de nitrogênio por essas linhagens variaram de 327,01 a 1.954,15 pmol N2.g-1 de biomassa seca.dia-1. / Mangroves are transitional ecosystems between terrestrial and marine environments found in tropical and subtropical regions. The broad range of variations of salinity and oxygen content, typical of these environments, is among the main constraint factors for the establishment and development of biota. Nevertheless, mangroves have high primary production. Among the nutrients, nitrogen is one of the most important limiting factors affecting the development of mangrove vegetation and only low availability of reduced forms is present. Therefore, there is a need to determine the nitrogen fixing microorganisms that colonize mangrove ecosystems. Among those, there are the cyanobacteria, a well known group of oxygenic photosynthetic and nitrogen fixing microorganisms. In this study, 50 cyanobacterial strains were isolated from environmental samples of soil, water and periphytic material collected in the Cardoso Island and Bertioga mangrove ecosystems, São Paulo. These strains were isolated using specific growth media and morphological analyses identified representatives of the orders Chroococcales (35 strains, 70%), Oscillatoriales (9 strains, 18%) and Nostocales (6 strains, 12%). Sixteen strains belong to the orders Chroococcales and Nostocales were selected for phylogeny studies using the gene rpoC1. The majority of rpoC1 sequences generated by PCR amplification using the specific set primer rpoC1-1/rpoC1-T showed low similarities (below 90%) with sequences available in the GenBank, indicating that these cyanobacterial strains are unique. The exceptions were only two strains (Synechococcus sp. CENA177 and Cyanothece sp. CENA169) that had high similarities with cyanobacterial sequences isolated from Brazilian freshwater environments. The Neighbor-Joining phylogenetic analysis showed that several of the new mangrove cyanobacterial strains clustered together, with no relationship with the taxonomical description based on morphotypic characterization. A search for the functional nifH gene, which coding for nitrogenase reductase, on 27 mangrove isolates revealed its presence in 21 strains (77%) dispersed among the orders Chroococcales, Oscillatoriales and Nostocales. The 21 amplified fragments of nifH were cloned and sequenced, and all the sequences also showed low similarities (below 95%) with cyanobacterial sequences available in the GenBank. The phylogenetic analysis of nifH gene positioned the new mangrove cyanobacterial strains in several clusters distributed along the tree, and as also observed for rpoC1 gene, with no correlation with the taxonomical description based on morphotypic characterization. Nitrogenase activity, measured by the acetylene reduction technique, was found in five strains belonging to the order Nostocales and one strain belonging to the order Chroococcales. The estimation of biological nitrogen fixation by these strains ranged from 327.01 to 1954.15 pmol N2.g-1 dry biomass.day-1.