A major challenge in nanotechnology is the controlled transport of cargo on the nanometer scale. A promising approach to this problem is the use of molecular motors of the cellular cytoskeleton. The aim of this work was to develop a method to characterize the behavior of filamentous nanoshuttles – specifically of motor protein-driven microtubules – in three dimensions (3-D). The main requirements to meet were low impact on the nanotransport system, high spatial and temporal resolution, and versatility. Furthermore, this method was intended to be used to address open questions in the field of nanotransport. In particular, it was firstly attempted to characterize cargo transport in a system currently favored by most studies in the field, where nanoshuttles are powered by the microtubule motor best understood so far – the plus-end-directed kinesin-1. Secondly, the goal was to further the understanding of potential counter-players of kinesin-1 in nanotransport applications - the much less well understood microtubule minus-end-directed motor proteins 22S dynein and the kinesin-14 non-claret disjunctional (ncd). A novel method to study the linear forward motion as well as the axial motion of filamentous nanoshuttles, which are driven by motors of the cell cytoskeleton, has been introduced. The method uses fluorescence interference-based 3-D nanometer tracking of quantum dots as optical probes that are attached to the nanoshuttles. While other recently reported 3-D tracking techniques based on dual-focus imaging offer similar sensitivity, the method here can be easily performed on any standard epi-fluorescence microscope, even with arc lamp illumination, and additionally holds the potential to retrieve absolute height values. It is strongly suggested that the ease of use might help to spread this valuable and versatile tool for a variety of applications, including studies of interactions between single molecules or even intramolecular changes. Specifically, 3-D tracking has been used to visualize and analyze the rotation of microtubules around their longitudinal axis when they are propelled on a motor protein-coated surface. This geometry called gliding assay is currently favored for most proof-of-principle studies that investigate the use of biomolecular motors for transport of nanoscale cargo with the goal to assemble and manipulate nanostructures. The suitability of the method has been proven for kinesin-1 gliding assays, where knowledge of properties of both, microtubules and kinesin-1, allowed a very precise prediction of microtubule rotation, which was matching the actual measured values very well. The microtubule rotation in kinesin-1 gliding assays has turned out to be robust against the attachment of small cargo in the shape of quantum dots (diameter ∼20 nm), but also against the reduction of electrostatic interactions between microtubules and kinesin-1 by cleavage of the tubulin E-hook. The situation was dramatically different when large cargo (beads with diameter of ∼3 µm) was attached to microtubules. In this case, filament rotation was stopped, but otherwise the impact on motility was surprisingly low. In particular, the velocity of the gliding microtubules only decreased to a negligible degree. This shows that in principle microtubules driven by processive motors like kinesin-1 can make flexible, responsive and effective molecular shuttles for nanotransport applications. In addition, the results might indicate that in vivo kinesin-1 molecules, which transport cargo along microtubules, can likewise flexibly respond to an axial force by deviating from their path parallel to the protofilament axes. Two microtubule minus-end-directed motors that might be employed to counteract kinesin-1 in engineered nanotransport systems are dynein and ncd. Both motors have been found to be capable of generating torque causing short-pitched microtubule rotation in gliding motility assays. The results for 22S dynein helped to resolve controversial findings of earlier reports about the ability of 22S dynein to generate torque. However, it turned out difficult to establish conditions where the movement of the dynein-driven nanoshuttles was homogeneous and reproducible. In contrast, motility in ncd gliding assays looks much more promising. The obtained results supported previous reports of torque generation by ncd. Moreover, a strong dependence of rotational pitches of gliding microtubules on ATP concentration was found. The reason could be that ncd motors in the nucleotide-free microtubule-bound state impede the forward movement of gliding microtubules stronger than the axial motion. To fully understand the nature of this effect, further research is required. Most likely, this will substantially contribute to the understanding of ncd function in vivo. Furthermore, the possibility of tuning the rotation of microtubules acting as nanoshuttles might provide a means to increase control of processes like cargo-loading and unloading. / Eine große Herausforderung auf dem Gebiet der Nanotechnologie ist der kontrollierte und präzise Transport von nanoskaligen Objekten. Der Einsatz von molekularen Motoren des zellulären Zytoskeletts hat sich dabei als vielversprechender Ansatz erwiesen. Ziel der hier vorgelegten Arbeit war die Entwicklung einer Methode, um das Verhalten von filamentartigen Nanotransportern - speziell von Mikrotubuli, die durch Motorproteine über Oberflächen bewegt werden - in drei Dimensionen (3-D) zu charakterisieren. Die Hauptkriterien waren dabei eine geringe Störung des zu untersuchenden Systems, hohe räumliche und zeitliche Auflösungen sowie die generelle Anwendbarkeit für Einzelmolekülstudien. Ein weiteres Ziel war es, die entwickelte Methode zur Beantwortung offener Fragen bezüglich des Nanotransports mittels Zytoskelett-basierter Motoren einzusetzen. Insbesondere sollte das System aus Mikrotubuli und dem Motorprotein Kinesin-1, welches für die meisten aktuellen Studien zum Thema Nanotransport herangezogen wird, untersucht werden. Schließlich sollten neue Erkenntnisse über weniger gut erforschte Motorproteine, speziell über 22S Dynein und das Kinesin-14 „Non-claret disjunctional“ (Ncd), gewonnen werden. Beide Motoren könnten in Nanotransportsystemen als Gegenspieler von Kinesin-1 agieren. In der vorliegenden Arbeit wird eine neuartige, auf Fluoreszenz-Interferenz basierende 3-D Nanometertrackingmethode beschrieben. Auf deren Grundlage wird es möglich, die Bewegung von einzelnen fluoreszenten Partikeln nahe einer reflektierenden Oberfläche mit einer Genauigkeit im Nanometerbereich zu verfolgen. Im Vergleich zu anderen kürzlich vorgestellten 3-D Techniken, welche auf bifokaler optischer Mikroskopie basieren und ähnliche Genauigkeiten zulassen, ist die hier vorgestellte Methode mit deutlich geringerem Aufwand auf der Basis eines herkömmlichen Epi-Fluoreszenzmikroskops umsetzbar. Dabei kann die Fluoreszenzanregung wahlweise mit einer Bogenlampe oder einem Laser erfolgen. Weiterhin besteht die Möglichkeit, nicht nur Differenzwerte (wie bei bifokaler Mikroskopie), sondern absolute Werte in der Höhendimension zu messen. Im Ergebnis wurde ein mit geringem Aufwand umsetzbares, gleichwohl hochgradig genaues und vielseitig einsetzbares Werkzeug geschaffen, welches ideal für Studien der Interaktionen von Einzelmolekülen oder auch intramolekularer Dynamik geeignet ist. Mit Hilfe der hier vorgestellten 3-D Trackingmethode wurden die Rotationen von Mikrotubuli um ihre Längsachse während des Gleitens auf mit Motorproteinen besetzten Oberflächen analysiert. Diese Geometrie wird derzeit bevorzugt in Studien eingesetzt, welche den Einsatz von biomolekularen Motoren für den Transport von nanoskaligen Objekten untersuchen und das Ziel verfolgen, Nanostrukturen zu erzeugen und zu manipulieren. Die Ergebnisse zu Rotationen von Mikrotubuli, welche über mit Kinesin-1 besetzte Oberflächen bewegt werden, sind konsistent mit (i) der Eigenschaft von Kinesin-1 sich entlang der Protofilamente von Mikrotubuli zu bewegen und (ii) der Superhelixstruktur von in vitro rekonstituierten Mikrotubuli. Dies belegt die Eignung der Methode für die Charakterisierung von Nanotransportsystemen. Die Rotation von Mikrotubuli, welche durch Kinesin-1 angetrieben werden, hat sich sowohl beim Transport von kleinen Objekten in Form von Quantum Dots (Durchmesser ca. 20 nm) als auch bei der Reduktion elektrostatischer Wechselwirkungen zwischen Kinesin-1 und Mikrotubuli durch Verdau der Tubulin-C-Termini als stabil erwiesen. Ein vollkommen anderes Bild ergab sich für den Transport von großen Objekten (Durchmesser ca. 3 µm). In diesem Fall wurde die Rotation der Filamente angehalten. Unerwarteterweise war jedoch die Vorwärtsbewegung der Mikrotubuli und insbesondere deren Geschwindigkeit kaum betroffen. Dies zeigt, daß Mikrotubuli, welche von prozessiven Motoren wie Kinesin-1 angetrieben werden, das Potential zu responsiven, flexiblen und effektiven molekularen Shuttles besitzen. Außerdem weisen die Ergebnisse darauf hin, daß Kinesin-1-Moleküle, welche in vivo Frachten entlang von Mikrotubuli transportieren, auf seitwärts gerichtete Kräfte reagieren können, indem sie von ihrem intrinsisch vorgegebenen Pfad parallel zur Protofilamentachse des Mikrotubulus abweichen. Zwei Motoren, die sich im Gegensatz zu Kinesin-1 in Richtung des Minus-Endes von Mikrotubuli bewegen, sind 22S Dynein und Ncd. Sie sind somit als Gegenspieler von Kinesin-1 in Nanotransportsystemen prädestiniert. Beide Motoren können, ebenso wie Kinesin-1, die Translokation von Mikrotubuli über Oberflächen sowie damit verbundene Rotationen von Mikrotubuli verursachen. Im Gegensatz zu Kinesin-1 tritt die Rotation unabhängig von einer Superhelixstruktur der Mikrotubuli auf. Die Ergebnisse für 22S Dynein lösen Widersprüche zwischen früheren Studien auf, indem sie belegen, daß dieser Motor Rotationen von Mikrotubuli erzeugen kann. Jedoch scheint es unter Verwendung von 22S Dynein nicht möglich zu sein, Bedingungen zu schaffen, unter welchen sich Mikrotubuli in geeigneter Weise als Nanoshuttles homogen und reproduzierbar bewegen. Der Einsatz von Ncd ist hier deutlich erfolgversprechender. Die in diesem Falle erlangten Erkenntnisse bezüglich der Erzeugung von Rotationen von Mikrotubuli decken sich mit früheren Studien. Ein bislang unbekannter, bemerkenswerter Effekt ist dabei ein Rückgang in der Länge der Rotationsperioden mit sinkender ATP-Konzentration. Die mit dem heutigen Wissensstand über den mechanochemischen Zyklus von Ncd konsistente Erklärung ist, daß Ncd-Motoren im nukleotidfrei an Mikrotubuli gebundenen Zustand die Vorwärtskomponente der Bewegung von gleitenden Mikrotubuli stärker hemmen als die Rotationskomponente. Möglicherweise kann die sich hieraus ergebende Möglichkeit der Regulierung der Rotation von Mikrotubuli dazu eingesetzt werden, das Be- und Entladen von Nanoshuttles zu steuern.

A espécie Escherichia coli constitui um grupo de bactérias tipicamente não patogênicas e que fazem parte do trato intestinal de humanos e animais. As amostras são sorotipadas com base em seus antígenos de superfície O (somático), H (flagelar) e K (capsular). O antígeno flagelar correspondente ao filamento é formado pela polimerização da flagelina, codificada pelo gene fliC. O presente trabalho empregou a técnica de PCR-RFLP para analisar os padrões de antígenos flagelares de 112 amostras de EPEC e STEC. Quatorze amostras não amplificaram o gene fliC, 17 tiveram seu antígeno flagelar determinado apenas por PCR-RFLP e 75 amostras tiveram seus antígenos flagelares confirmados por esta técnica. Três antígenos H com padrões irregulares foram clonados e sequenciados. Após o sequenciamento, inserções e remoções de nucleotídeos foram encontradas. Até o momento, poucos estudos utilizam um número abrangente de amostras de STEC e EPEC provenientes de diferentes animais para a determinação do antígeno H empregando a técnica de PCR-RFLP do gene fliC. De acordo com os resultados encontrados neste estudo, podemos concluir que a técnica de PCR-RFLP do gene fliC é mais rápida, menos trabalhosa e mais eficiente que a metodologia de sorotipagem clássica. / The Escherichia coli species consists of a group of typically non-pathogenic bacteria present in the intestinal tract of humans and animals. Strains are serotyped according to their O (somatic), H (flagellar) and K (capsular) surface antigens, in order to distinguish these microorganisms from the non-pathogenic members of the intestinal microbiota. The flagellar antigen corresponding to the filament is formed by the polymerization of the flagellin, codified by the fliC gene. This study employed the PCR-RFLP technique to analyze flagellar antigen patterns from 112 EPEC and STEC strains. Fourteen strains have not amplified the fliC gene, 17 had their flagellar antigen determined only by the PCR-RFLP and 75 strains had their flagellar antigen confirmed by this technique. Three H antigens with irregular patterns were cloned and sequenced. After sequencing, insertions and deletions of nucleotides were discovered. So far, few studies used a significant number of STEC and EPEC strains originated from different animals to determine H antigens employing the PCR-RFLP technique of the fliC gene. According to the findings of this study, we assumed that PCR-RFLP of the fliC gene is faster, less laborious and more efficient than classic serotyping methodology.

A major challenge in nanotechnology is the controlled transport of cargo on the nanometer scale. A promising approach to this problem is the use of molecular motors of the cellular cytoskeleton. The aim of this work was to develop a method to characterize the behavior of filamentous nanoshuttles – specifically of motor protein-driven microtubules – in three dimensions (3-D). The main requirements to meet were low impact on the nanotransport system, high spatial and temporal resolution, and versatility. Furthermore, this method was intended to be used to address open questions in the field of nanotransport. In particular, it was firstly attempted to characterize cargo transport in a system currently favored by most studies in the field, where nanoshuttles are powered by the microtubule motor best understood so far – the plus-end-directed kinesin-1. Secondly, the goal was to further the understanding of potential counter-players of kinesin-1 in nanotransport applications - the much less well understood microtubule minus-end-directed motor proteins 22S dynein and the kinesin-14 non-claret disjunctional (ncd). A novel method to study the linear forward motion as well as the axial motion of filamentous nanoshuttles, which are driven by motors of the cell cytoskeleton, has been introduced. The method uses fluorescence interference-based 3-D nanometer tracking of quantum dots as optical probes that are attached to the nanoshuttles. While other recently reported 3-D tracking techniques based on dual-focus imaging offer similar sensitivity, the method here can be easily performed on any standard epi-fluorescence microscope, even with arc lamp illumination, and additionally holds the potential to retrieve absolute height values. It is strongly suggested that the ease of use might help to spread this valuable and versatile tool for a variety of applications, including studies of interactions between single molecules or even intramolecular changes. Specifically, 3-D tracking has been used to visualize and analyze the rotation of microtubules around their longitudinal axis when they are propelled on a motor protein-coated surface. This geometry called gliding assay is currently favored for most proof-of-principle studies that investigate the use of biomolecular motors for transport of nanoscale cargo with the goal to assemble and manipulate nanostructures. The suitability of the method has been proven for kinesin-1 gliding assays, where knowledge of properties of both, microtubules and kinesin-1, allowed a very precise prediction of microtubule rotation, which was matching the actual measured values very well. The microtubule rotation in kinesin-1 gliding assays has turned out to be robust against the attachment of small cargo in the shape of quantum dots (diameter ∼20 nm), but also against the reduction of electrostatic interactions between microtubules and kinesin-1 by cleavage of the tubulin E-hook. The situation was dramatically different when large cargo (beads with diameter of ∼3 µm) was attached to microtubules. In this case, filament rotation was stopped, but otherwise the impact on motility was surprisingly low. In particular, the velocity of the gliding microtubules only decreased to a negligible degree. This shows that in principle microtubules driven by processive motors like kinesin-1 can make flexible, responsive and effective molecular shuttles for nanotransport applications. In addition, the results might indicate that in vivo kinesin-1 molecules, which transport cargo along microtubules, can likewise flexibly respond to an axial force by deviating from their path parallel to the protofilament axes. Two microtubule minus-end-directed motors that might be employed to counteract kinesin-1 in engineered nanotransport systems are dynein and ncd. Both motors have been found to be capable of generating torque causing short-pitched microtubule rotation in gliding motility assays. The results for 22S dynein helped to resolve controversial findings of earlier reports about the ability of 22S dynein to generate torque. However, it turned out difficult to establish conditions where the movement of the dynein-driven nanoshuttles was homogeneous and reproducible. In contrast, motility in ncd gliding assays looks much more promising. The obtained results supported previous reports of torque generation by ncd. Moreover, a strong dependence of rotational pitches of gliding microtubules on ATP concentration was found. The reason could be that ncd motors in the nucleotide-free microtubule-bound state impede the forward movement of gliding microtubules stronger than the axial motion. To fully understand the nature of this effect, further research is required. Most likely, this will substantially contribute to the understanding of ncd function in vivo. Furthermore, the possibility of tuning the rotation of microtubules acting as nanoshuttles might provide a means to increase control of processes like cargo-loading and unloading. / Eine große Herausforderung auf dem Gebiet der Nanotechnologie ist der kontrollierte und präzise Transport von nanoskaligen Objekten. Der Einsatz von molekularen Motoren des zellulären Zytoskeletts hat sich dabei als vielversprechender Ansatz erwiesen. Ziel der hier vorgelegten Arbeit war die Entwicklung einer Methode, um das Verhalten von filamentartigen Nanotransportern - speziell von Mikrotubuli, die durch Motorproteine über Oberflächen bewegt werden - in drei Dimensionen (3-D) zu charakterisieren. Die Hauptkriterien waren dabei eine geringe Störung des zu untersuchenden Systems, hohe räumliche und zeitliche Auflösungen sowie die generelle Anwendbarkeit für Einzelmolekülstudien. Ein weiteres Ziel war es, die entwickelte Methode zur Beantwortung offener Fragen bezüglich des Nanotransports mittels Zytoskelett-basierter Motoren einzusetzen. Insbesondere sollte das System aus Mikrotubuli und dem Motorprotein Kinesin-1, welches für die meisten aktuellen Studien zum Thema Nanotransport herangezogen wird, untersucht werden. Schließlich sollten neue Erkenntnisse über weniger gut erforschte Motorproteine, speziell über 22S Dynein und das Kinesin-14 „Non-claret disjunctional“ (Ncd), gewonnen werden. Beide Motoren könnten in Nanotransportsystemen als Gegenspieler von Kinesin-1 agieren. In der vorliegenden Arbeit wird eine neuartige, auf Fluoreszenz-Interferenz basierende 3-D Nanometertrackingmethode beschrieben. Auf deren Grundlage wird es möglich, die Bewegung von einzelnen fluoreszenten Partikeln nahe einer reflektierenden Oberfläche mit einer Genauigkeit im Nanometerbereich zu verfolgen. Im Vergleich zu anderen kürzlich vorgestellten 3-D Techniken, welche auf bifokaler optischer Mikroskopie basieren und ähnliche Genauigkeiten zulassen, ist die hier vorgestellte Methode mit deutlich geringerem Aufwand auf der Basis eines herkömmlichen Epi-Fluoreszenzmikroskops umsetzbar. Dabei kann die Fluoreszenzanregung wahlweise mit einer Bogenlampe oder einem Laser erfolgen. Weiterhin besteht die Möglichkeit, nicht nur Differenzwerte (wie bei bifokaler Mikroskopie), sondern absolute Werte in der Höhendimension zu messen. Im Ergebnis wurde ein mit geringem Aufwand umsetzbares, gleichwohl hochgradig genaues und vielseitig einsetzbares Werkzeug geschaffen, welches ideal für Studien der Interaktionen von Einzelmolekülen oder auch intramolekularer Dynamik geeignet ist. Mit Hilfe der hier vorgestellten 3-D Trackingmethode wurden die Rotationen von Mikrotubuli um ihre Längsachse während des Gleitens auf mit Motorproteinen besetzten Oberflächen analysiert. Diese Geometrie wird derzeit bevorzugt in Studien eingesetzt, welche den Einsatz von biomolekularen Motoren für den Transport von nanoskaligen Objekten untersuchen und das Ziel verfolgen, Nanostrukturen zu erzeugen und zu manipulieren. Die Ergebnisse zu Rotationen von Mikrotubuli, welche über mit Kinesin-1 besetzte Oberflächen bewegt werden, sind konsistent mit (i) der Eigenschaft von Kinesin-1 sich entlang der Protofilamente von Mikrotubuli zu bewegen und (ii) der Superhelixstruktur von in vitro rekonstituierten Mikrotubuli. Dies belegt die Eignung der Methode für die Charakterisierung von Nanotransportsystemen. Die Rotation von Mikrotubuli, welche durch Kinesin-1 angetrieben werden, hat sich sowohl beim Transport von kleinen Objekten in Form von Quantum Dots (Durchmesser ca. 20 nm) als auch bei der Reduktion elektrostatischer Wechselwirkungen zwischen Kinesin-1 und Mikrotubuli durch Verdau der Tubulin-C-Termini als stabil erwiesen. Ein vollkommen anderes Bild ergab sich für den Transport von großen Objekten (Durchmesser ca. 3 µm). In diesem Fall wurde die Rotation der Filamente angehalten. Unerwarteterweise war jedoch die Vorwärtsbewegung der Mikrotubuli und insbesondere deren Geschwindigkeit kaum betroffen. Dies zeigt, daß Mikrotubuli, welche von prozessiven Motoren wie Kinesin-1 angetrieben werden, das Potential zu responsiven, flexiblen und effektiven molekularen Shuttles besitzen. Außerdem weisen die Ergebnisse darauf hin, daß Kinesin-1-Moleküle, welche in vivo Frachten entlang von Mikrotubuli transportieren, auf seitwärts gerichtete Kräfte reagieren können, indem sie von ihrem intrinsisch vorgegebenen Pfad parallel zur Protofilamentachse des Mikrotubulus abweichen. Zwei Motoren, die sich im Gegensatz zu Kinesin-1 in Richtung des Minus-Endes von Mikrotubuli bewegen, sind 22S Dynein und Ncd. Sie sind somit als Gegenspieler von Kinesin-1 in Nanotransportsystemen prädestiniert. Beide Motoren können, ebenso wie Kinesin-1, die Translokation von Mikrotubuli über Oberflächen sowie damit verbundene Rotationen von Mikrotubuli verursachen. Im Gegensatz zu Kinesin-1 tritt die Rotation unabhängig von einer Superhelixstruktur der Mikrotubuli auf. Die Ergebnisse für 22S Dynein lösen Widersprüche zwischen früheren Studien auf, indem sie belegen, daß dieser Motor Rotationen von Mikrotubuli erzeugen kann. Jedoch scheint es unter Verwendung von 22S Dynein nicht möglich zu sein, Bedingungen zu schaffen, unter welchen sich Mikrotubuli in geeigneter Weise als Nanoshuttles homogen und reproduzierbar bewegen. Der Einsatz von Ncd ist hier deutlich erfolgversprechender. Die in diesem Falle erlangten Erkenntnisse bezüglich der Erzeugung von Rotationen von Mikrotubuli decken sich mit früheren Studien. Ein bislang unbekannter, bemerkenswerter Effekt ist dabei ein Rückgang in der Länge der Rotationsperioden mit sinkender ATP-Konzentration. Die mit dem heutigen Wissensstand über den mechanochemischen Zyklus von Ncd konsistente Erklärung ist, daß Ncd-Motoren im nukleotidfrei an Mikrotubuli gebundenen Zustand die Vorwärtskomponente der Bewegung von gleitenden Mikrotubuli stärker hemmen als die Rotationskomponente. Möglicherweise kann die sich hieraus ergebende Möglichkeit der Regulierung der Rotation von Mikrotubuli dazu eingesetzt werden, das Be- und Entladen von Nanoshuttles zu steuern.

A platform for vaccine development has been developed at Georgia State University utilizing recombinant Salmonella typhimurium flagellin (FliC) fused to an antigen that can be overexpressed in Escherichia coli grown in a two-stage fermentation. The flagellin acts as an adjuvant to increase the immunopotency of the fused antigen. Flagellin is the ligand for Toll-like Receptor 5 (TLR5), a part of the innate immune system. Binding of the flagellin:antigen recombinant protein to TLR5 triggers a strong innate and adaptive immune response to the fused antigen leading to a potentially strong protective immunity to the antigen. Purification of the recombinant FliC fusion protein must meet rigorous criteria in order to be used as a vaccine. One of the major issues in purifying recombinant proteins expressed in a Gram-negative bacterium is the removal of endotoxin. Small amounts of endotoxin present in a vaccine can lead to serious complications, including death. Recombinant proteins are also expressed as either soluble or insoluble protein when over expressed in E. coli. Soluble proteins expressed by the bacterium are properly folded and biologically active, however removal of contaminants such as endotoxin, can be problematic. Insoluble protein is improperly folded and biologically inactive. The insoluble proteins aggregate into inclusion bodies with little or no contaminants associated with the protein, making purification easier. However, in order to restore the biological activity of the insoluble protein, it must first be solubilized and then refolded. This process is often expensive and time consuming, as there is currently no standardized method for protein refolding. In this study a purification method for the soluble protein of two FliC constructs, full-length FliC and FliC fused to a Marburg virus antigen, was evaluated for effectiveness in purification, removal of endotoxin and maintaining TLR5 activity. The proteins of interest were purified utilizing only the soluble protein containing the properly folded and biologically active recombinant protein. Utilizing methods for purification that take advantage of physical and chemical properties of the protein the recombinant proteins were purified and the level of endotoxin reduced to levels acceptable for use as a vaccine. The TLR5 activity of the soluble recombinant proteins was compared to recombinant protein that had been purified using a denaturing and refolding step. The soluble protein elicited a higher TLR5 response at a lower concentration of protein than the refolded protein. Purification of the soluble fraction also involved fewer step and less time than purification of both the soluble and insoluble protein.

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Pseudomonas syringae is a common foliar plant pathogenic bacterium that causes diseases on many crop plants. We hypothesized that today's highly virulent P. syringae crop pathogens with narrow host range might have evolved after the advent of agriculture from ancestral P. syringae strains with wide host range that were adapted to mixed plant communities. The model tomato and Arabidopsis pathogen P. syringae pv. tomato (Pto) DC3000 and its close relatives isolated from crop plants were thus selected to unravel basic principles of host range evolution by applying molecular evolutionary analysis and comparative genomics approaches. Phylogenetic analysis was combined with host range tests to reconstruct the host range of the most recent common ancestor of all analyzed strains isolated from crop plants. Even though reconstruction of host range of the most recent common ancestor of all analyzed strains was not conclusive, support for this hypothesis was found in some sub-groups of strains. The focus of my studies then turned to Pto T1, which was found to represent the most common P. syringae lineage causing bacterial speck disease on tomato world-wide. Five genomes were sequenced and compared to each other. Identical genotypes were found in North America and Europe suggesting frequent pathogen movement between these continents. Moreover, the type III-secreted effector gene hopM1 was found to be under strong selection for loss of function and non-synonymous mutations in the fliC gene allowed to identify a region that triggers plant immunity. Finally, Pto T1 was compared to closely related bacteria isolated from snow pack and surface water in the French Alps. Recombination between alpine strains and crop strains was inferred and virulence gene repertoires of alpine strains and crop strains were found to overlap. Alpine strains cause disease on tomato and have relatively wider host ranges than Pto T1. The conclusion from these studies is that Pto T1 and other crop pathogens may have evolved from ancestors similar to the characterized environmental strains isolated in the French Alps by adapting their effector repertoire to individual crops becoming more virulent on these crops but losing virulence on other plants. / Ph. D.