Stammzellen nehmen in der regenerativen Therapie von Herzkreislauferkrankungen einen hohen Stellenwert ein. Aufgrund der ethischen Kontroverse besitzen adulte Stammzellen mit einem Differenzierungspotential von embryonalen Stammzellen einen Vorteil gegenüber den humanen embryonalen Stammzellen. In dieser Arbeit konnten spermatogoniale Stammzellen aus einem transgenen Mausmodell (MHC-NEO/MHC-eGFP) isoliert und mittels lentiviraler Überexpression von OCT4 allein in den pluripotenten Zustand überführt werden. Die Pluripotenz dieser induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) wurde durch verschiedene charakteristische Analysen nachgewiesen. Für therapeutische Einsätze zur Myokardinfarktregeneration stellen kardiovaskuläre Vorläuferzellen, die die Fähigkeit aufweisen sowohl zu proliferieren als auch in Kardiomyozyten, glatte Muskelzellen und endotheliale Zellen zu differenzieren, eine geeignete Zellart dar. Diese Vorläuferzellen sind durch die Expression des Oberflächenrezeptors fetal liver kinase 1 (FLK1) gekennzeichnet. In dieser Arbeit wurden iPSCs generiert und in FLK1 positive Zellen durch Cokultivierung differenziert und mit Hilfe der fluorescence activated cell sorting (FACS)-Technik separiert. Es wurden 30% FLK1 positive Zellen gewonnen. Auch hESCs konnten durch Cokultivierung auf OP9 Zellen (30%) und über das mass culture Verfahren (50%) in kinase domain region (KDR) positive Zellen differenziert werden. Die Vitalität und Differenzierungsfähigkeit der FLK1 positiven Zellen nach der FACS-Separierung wurden bestätigt. Zur Analyse des therapeutischen Effekts dieser FLK1 positiven Zellen wurde ein Myokardinfarkt-Mausmodell etabliert. Die FLK1 positiven Zellen wurden allogen in Wildtypmäuse injiziert, die mit dem Immunsuppresivum Ciclosporin A (CsA) behandelt wurden. Nach Injektion dieser Vorläuferzellen wurde eine signifikante Steigerung der Ejektionsfraktion an Tag 56 nach Injektion nachgewiesen. Dieser funktionssteigernde Trend an Tag 56 durch die Zellinjektion wurde auch bei der Verkürzungsfraktion beobachtet. Die injizierten Zellen konnten zu den frühen Untersuchungszeitpunkten im Myokard durch Zellkernansammlungen nachgewiesen werden. Zu späteren Zeitpunkten war dies nicht mehr der Fall. Während der in vivo Studie wurde zu keinem Zeitpunkt eine Teratombildung beobachtet. Immunologische Untersuchungen zeigten, dass die FLK1 positiven Zellen eine Tumorigenität in immundefizienten Mäusen aufwiesen und somit in dieser Form nicht direkt für die regenerative Therapie eingesetzt werden können. Ebenfalls wurde gezeigt, dass das Immunsystem der Versuchstiere und die Behandlung mit dem Immunsuppressivum CsA Auswirkungen auf die Teratombildung in der in vivo Studie besitzen. Die injizierten Zellen führten zu einer Aktivierung der natürlichen Killer (NK)-Zellen der Versuchstiere, die hingegen zu einer Lyse der injizierten Zellen führen konnten. CsA inhibierte die Teratombildung, besaß jedoch keinen Einfluss auf die NK-Zellaktivität. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die injizierten Zellen vom Immunsystem der Mäuse abgestoßen worden sind und somit zu späteren Versuchszeiten nicht mehr nachgewiesen werden konnten. Trotz der eventuellen Abstoßung im späteren Versuchsverlauf führte die Injektion der FLK1 positiven Zellen zu einer signifikanten Steigerung der Herzleistung. Die Tumorigenität von Zellen spielt eine entscheidende Rolle in der stammzellbasierenden Therapie. Die virale Methode der Reprogrammierung in iPSCs hatte keinen Einfluss auf die Tumorigenität dieser Zellen. Bei Injektion von autologen viral iPSCs in entsprechende Akzeptormäuse wurden Teratombildungen beobachtet. Die NK-Zellaktivität wurde durch die Injektion jedoch nicht aktiviert. Es wurde somit gezeigt, dass die viral iPSCs vom Immunsystem der autologen Versuchstiere nicht abgestoßen wurden. Die Tumorigenität schien somit von zelllinienspezifischen Immunogenen beeinflusst. Für klinische Anwendungen könnten die hier untersuchten kardiovaskulären Vorläuferzellen, die ein regeneratives Potential aufwiesen, aufgrund ihrer Tumorigenität jedoch nicht eingesetzt werden. Zukünftig müssten die zu transplantierenden Zellen erneut selektiert werden, um eventuelle Unreinheit von undifferenzierten Zellen zu umgehen. Dies könnte durch Kultivierung der Population mit NK-Zellen erfolgen, da diese Arbeit gezeigt hat, dass eine NK-Zellaktivität gegen tumorigene Zellen vorliegt. Eine andere Möglichkeit wäre diese kardiovaskulären Vorläuferzellpopulation im Folgenden auch zur Herstellung von künstlichem Herzgewebe einzusetzen, um größere Bereiche von geschädigtem Myokard zu regenerieren.

The cardiovascular system is the first functional organ to develop during embryogenesis. As the embryo reaches above a certain size, passive diffusion of gases and nutrients is no longer compatible with efficient growth. During embryogenesis, endothelial progenitor cells (angioblasts) are recruited from the primitive streak mesoderm and instructed to express vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2). This thesis examines the roles played by VEGFR-2 in the events through which a subpopulation of embryonic stem (ES) cells differentiate into endothelial cells and form the vasculature. We show that ES cells gene targeted for VEGFR-2 (flk1-/-) develop immature endothelial cells (ECs), precursors, when differentiated in vitro as embryoid bodies (EBs). The flk1-/- ECs are unresponsive to VEGF-stimulation and consistently fail to form vessels. However, when co-cultured with wild type ES cells in chimeric EBs, flk1-/- endothelial precursors are guided by wild type ECs to form transient, chimeric vascular structures. Use of lentivirus in an add-back approach allowed reconstitution of VEGFR-2 expression in flk1-/- ES cells, and rescue of vasculogenesis and sprouting angiogenesis. We propose that recruitment to the endothelial lineage is not dependent on VEGFR-2, although this receptor tyrosine kinase appears indispensible for EC integrity, survival and for differentation of endothelial precursors into mature ECs formating a stable vasculature. Neuropilin-1 (NRP1) and heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) function as co-receptors for VEGFs. The co-receptors influence, qualitatively and quantitatively, the intracellular signal relayed by VEGFR-2 but it is unclear how. We examined the contribution of NRP1 to VEGFR-2 signaling in EB cultures, in zebrafish and in mice. Only NRP1-binding VEGFs were able to promote sprouting angiogenesis and formation of properly branched vascular tubes, supported by pericytes. Downstream of VEGFR-2/NRP1 activation, we identified recruitment of p38MAPK in signal transduction regulating sprouting angiogenesis.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第18177号 / 医博第3897号 / 新制||医||1004(附属図書館) / 31035 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 川口 義弥, 教授 中畑 龍俊, 教授 斎藤 通紀 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

No description available.

No description available.