Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Química, 2017. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-05-10T13:36:40Z No. of bitstreams: 1 2017_ThiagoOliveiraCarvalho.pdf: 2102905 bytes, checksum: bb4968e1ef7d246aaef5850ca690a955 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-05-30T14:54:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_ThiagoOliveiraCarvalho.pdf: 2102905 bytes, checksum: bb4968e1ef7d246aaef5850ca690a955 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-30T14:54:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_ThiagoOliveiraCarvalho.pdf: 2102905 bytes, checksum: bb4968e1ef7d246aaef5850ca690a955 (MD5) Previous issue date: 2017-05-30 / O desenvolvimento de pequenas moléculas fluorescentes que sejam capazes de atuar como sonda no acompanhamento e monitoramento de moléculas, biomoléculas e organelas, é um campo da Química estratégico e fundamental. A literatura recente respalda a emergente utilização de derivados da estrutura 2,1,3-benzotiadiazola (BTD) para essa aplicação. O presente trabalho apresenta um método versátil de síntese intracelular de derivados fluorescentes BTD a partir de sistemas desenvolvidos e definidos que possuem apenas capacidade pró-luminescente. Partindo de um sistema constituído por uma espécie BTD halogenada e um catalisador ionofílico de paládio solúvel em água, e portanto, em ambiente celular, é possível a síntese, por meio de reações e acoplamento-cruzado, de diferentes estruturas no citoplasma sem que haja prejuízo considerável na saúde celular. A tecnologia, inspirada na química bioortogonal, permitiu a obtenção de resultados que até o momento permitem concluir que a síntese intracelular é possível, com a formação de estruturas que possuem eficiência quântica satisfatória para ensaios de imageamento celular, comportamento seletivo. É notável que a tecnologia desenvolvida abrevia todas as etapas convencionais, estando à luz da química verde. / The development of small fluorescent molecules that are capable of acting as a probe in the accompaniment and monitoring of molecules, biomolecules and organelles, is a strategic and fundamental area of Chemistry. Recent literature supports the emergent application of 2,1,3-benzothiadiazole (BTD). This work presents a versatile method of intracellular synthesis of fluorescent BTD derivates from systems developed and defined that have only pro-luminescent capacity. Starting from a system consisting of a halogenated BTD species and a water soluble palladium ionophilic catalyst, therefore, soluble in a cellular environment, it is possible to synthesize, by cross-coupling reactions, different structures into cytoplasm without any considerable damage to cellular health. The technology, inspired on bioorthogonal chemistry, has allowed data to conclude that intracellular synthesis is possible, with formation of structures that constitute a satisfactory probe for cell imaging and selective behavior. It is remarkable that the developed technology shortens the steps of conventional methods, being in the light of green chemistry.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, 2013. / Submitted by Gomes Neide (neide@bce.unb.br) on 2014-07-18T19:04:07Z No. of bitstreams: 1 2013_GabrielaGennarideSouza.pdf: 3743623 bytes, checksum: 9efb8e99e1ab35592ac2ece463ebaca0 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-07-22T11:20:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_GabrielaGennarideSouza.pdf: 3743623 bytes, checksum: 9efb8e99e1ab35592ac2ece463ebaca0 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-22T11:20:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_GabrielaGennarideSouza.pdf: 3743623 bytes, checksum: 9efb8e99e1ab35592ac2ece463ebaca0 (MD5) / A calibração de segunda ordem é aplicada a dados trilineares, que possuem três dimensões. Os dados espectrofluorimétricos possuem essa característica e têm sido analisados por modelos de segunda ordem, como UPLS e PARAFAC, por exemplo. O uso de ferramentas quimiométricas associadas a técnicas mais simples vem sendo uma alternativa perante técnicas mais sofisticadas e matrizes complexas, quando geralmente usa-se cromatografia. O uso de espectrofluorimetria na determinação de fármacos que apresentam fluorescência natural, como o triantereno e a amilorida, parece simples à primeira vista, mas torna-se complicado em fluídos biológicos, pois esses também possuem fluorescência natural. O uso de quimiometria possibilita essa determinação sem exaustivas etapas de extração ou pré-concentração do analito. A importância de se determinar fármacos diuréticos em amostras biológicas abrangem análises de doping, estudos clínicos e farmacocinéticos. Os analitos de interesse apresentam baixa faixa terapêutica, e por esse motivo geralmente são determinados por métodos cromatográficos. O presente estudo propõe uma precipitação das proteínas plasmáticas com acetonitrila, o que reduz significativamente a intensidade de fluorescência do plasma sanguíneo, mas não a elimina. Por esse motivo, a regressão univariada não é capaz de estimar bons resultados. O método da adição de padrão é usada a fim de diminuir o efeito de matriz, mas não é suficiente para estimar bons resultados na regressão univariada. Visando determinar amilorida e triantereno em plasma sanguíneo por espectrofluorimetria, dois modelos de segunda ordem são otimizados, o PARAFAC e o UPLS, sendo obtidas boas estimativas com a calibração de segunda ordem. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The second order calibration is applied to trilinear data, which have three dimensions. The espectrofluorimetrics data have this characteristic and has been analyzed by second order models as UPLS and PARAFAC, for example. The use of chemometrics tools associated with simplest techniques is an alternative before more sophisticated techniques and complex matrices, when chromatography is usually used. The use of spectrofluorimetry for the determination of drugs that fluoresce naturally, as triamterene and amiloride, seems simple at first glance, but becomes complicated in biological fluids, as these also have natural fluorescence. The use of chemometrics enables this determination without exhaustive extraction steps or preconcentration of the analyte. The importance of determining diuretic drugs in biological samples include doping analyzes, clinical and pharmacokinetic studies. The analytes of interest have low therapeutic range, and for that reason are usually determined by chromatographic methods. This study proposes a plasma protein precipitation with acetonitrile, which significantly reduces the fluorescence intensity of blood plasma, but does not eliminate it. For this reason, univariate regression is not able to estimate good results. The standard addition method is used to reduce the matrix effect, but it isn’t sufficient to estimate good results in univariate regression. To determine amiloride and triamterene in blood plasma by spectrofluorimetry, two second order models are optimized, PARAFAC and UPLS, being obtained good estimates with second-order calibration.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-12-05T19:53:58Z No. of bitstreams: 1 2017_LorenaPereiradeAndrade.pdf: 1424019 bytes, checksum: d72d0cdae4788595afe7126188d2f9a4 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-01-31T19:32:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_LorenaPereiradeAndrade.pdf: 1424019 bytes, checksum: d72d0cdae4788595afe7126188d2f9a4 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-31T19:32:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_LorenaPereiradeAndrade.pdf: 1424019 bytes, checksum: d72d0cdae4788595afe7126188d2f9a4 (MD5) Previous issue date: 2018-01-31 / Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP-DF); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). / Marcadores fluorescentes são amplamente empregados para a análise da biologia celular, permitindo investigar e monitorar biomoléculas e organelas durante os processos metabólicos relacionados à vida e a morte das células. Em particular a marcação de lipídios vem se tornando cada vez mais empregada, devido à importância destas moléculas na homeostase das células e dos organismos. Existem diversos marcadores comerciais disponíveis para atender esta demanda, no entanto esses marcadores apresentam uma série de desvantagens que tornam seu uso uma alternativa pouco atrativa. Nosso grupo de pesquisa tem buscado desenvolver novas moléculas fluorescentes visando seu emprego no imageamento celular, contornando as limitações impostas pelos agentes fluorescentes comerciais de referência atualmente empregados. Neste contexto, nosso grupo vem trabalhando com moléculas que apresentam o núcleo 2,1,3- benzotiadiazola (BTD) que possui um conjunto de características químicas desejáveis para o seu emprego na síntese de compostos fluorescentes. Este trabalho apresenta três moléculas inéditas derivadas do núcleo BTD (BJL16#unb1, BJL16#unb2 e BJL16#unb3), idealizadas para ter alta afinidade por lipídios sem perder sua propriedade de solubilidade em solução aquosa. Estas moléculas possuem estrutura molecular com características únicas e este trabalho procurou demonstrar a ótima relação entre a arquitetura molecular, sua solubilidade e seletividade ao alvo celular predito através de ensaios de imageamento celular in vitro e no modelo C. elegans N2 selvagem. Os resultados demonstraram a alta afinidade dos compostos por vesículas de lipídios, emitem um ótimo sinal fluorescente, no entanto apresentaram taxas de solubilidade variada. O composto BJL16#unb1 apesar de ser o de menor intensidade de fluorescência dentre os três compostos testados, foi o mais solúvel, com melhor desempenho de permeabilidade no ensaio com o modelo C. elegans. Comparados ao Bodipy® que é o marcador comercial de lipídios de referência, os compostos apresentaram melhor solubilidade, intensidade de fluorescência similar, sendo que o compostoBJL16#unb3 apresentou maior intensidade e marcação mais ampla, uma vez que marcou estruturas não marcadas pelo Bodipy®. Além disso, foi demonstrado para os compostos testados, ausência de citotoxicidade, estabilidade durante armazenamento e fotoestabilidade durante o uso, características também superiores às do Bodipy®. / Fluorescent probes are widely used to cellular biology analysis, allowing the investigation and monitoring of biomolecules and organelles during metabolic processes related to life and death of cells. In particular the lipid probes have becoming increasingly employed because of the importance of these molecules in the homeostasis of cells and organisms. There are many commercial probes available to meet this demand; however these probes have a number of disadvantages that make its use an unattractive choice. Our research group has sought to develop new enhanced fluorescent molecules targeting its use in cellular imaging, bypassing the limitations imposed by commercial fluorescent agents currently employed as reference probes. In this context, our group has been working with molecules that have the core 2,1,3 benzotiadiazola (BTD) that has a set of chemical characteristics desirable for its use in the synthesis of fluorescent compounds. In this work, was evaluated three new molecules derived from BTD core (BJL16 # unb1, BJL16 # unb2 and BJL16 # unb3), idealized to have high affinity for lipids without losing their solubility properties in aqueous solution. These molecules have molecular structure with unique characteristics and this work will seek to show the relationship between the molecular architecture, its solubility and selectivity to the predicted target cell organelles through cell imaging assays in vitro and in C. elegans model. The results show that the compounds have high affinity for lipid vesicles, and an intense fluorescent signal. However, the solubility rates were not constant to all compounds. The BJL16 # unb1 molecule shows the lowest intensity of fluorescent signal from the three tested compounds, but also was the most soluble among them, with the better permeability performance in the C. elegans model test as compared with the Bodipy® which is the commercial reference probe to lipids staining. Furthermore, the three compounds had shown better solubility, a similar fluorescence intensity, but the BJL16unb#3 exhibited a better solubility and wider staining profile to those obtained with Bodipy® which failed to staining lots of lipids structures. Finally, it was shown that the tested compounds, lack of cytotoxicity, was stable in stock solution and shows high photostability during its use, all these characteristics also were higher than those found in Bodipy®.

The nucleic acid determination in biological samples has been essential in the last decades for many analytical processes, such as polymerase chain reaction (PCR), genotyping, clinical diagnosis, genetically modified organism determination in food ingredients, fetal DNA maternal blood test, forensic applications and others. Absorbance measurements in the UV-vis region are frequently employed for nucleic acid quantifications. Nevertheless, the results are often approximated and measurement accuracy is limited. Thus, this work presents a low-cost and simple method for DNA and/or RNA determination employing Thioflavin T (TT) by molecular fluorescence. The reaction mechanism consists of the interaction of TT and DNA or RNA. This mechanism is based on the off-on concept in which the free TT in solution shows low fluorescence but when interacts with the nucleic acid there is a rotation restriction in the TT molecule, becoming rigid, which allows the alignment of π orbitals and consequently increases its fluorescence intensity. After the addition of DNA, TT showed a redshift (bathochromic effect) in the molecular absorption spectra, indicating that there is interaction with the macromolecule. Experimental conditions were optimized applying salmon test DNA as experimental model for nucleic acids (stDNA) in pH = 5, MES buffer solution (10 mM) and TT concentration of 5 μM. For the ionic strength studies, it was observed that increasing NaCl concentration (0 – 150 mM) the TT-DNA interaction process is disfavored, indicating that the interaction mechanism occurs through electrostatic attractions. Moreover, binding mode assays with competitors (ethidium bromide and berenil) were performed, showing that the second type of interaction occurs preferentially by groove. In those conditions, the probe was able to respond immediately to different nucleic acids, with the signal stable for at least 120 min. The proposed method presents a 0.1 – 1.5 mg L-1 linear range in stDNA, with a LOD of 0.012 mg L-1 relative standard deviation lower than 3.7 %. Applying RNA as a standard, the method shows linear range of 0.25 – 3.0 mg L-1, LOD of 0.073 mg L-1 and RSD lower than 3.2 %. Fe(III) ion and albumin and lysozyme proteins were the main interference species to the method. At last, the concentration of nucleic acids in a DNA sample extracted from blood plasma was determined (stDNA – 57 mg L-1 and ctDNA – 48,5 mg L-1 standards), moreover, it was performed a recovery assay applying ctDNA and stDNA in saliva samples whose recoveries in the range of 67 – 89%. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A determinação de ácidos nucleicos em amostras biológicas tem sido imprescindível nas últimas décadas para muitos processos analíticos, como reação de polimerase em cadeia (PCR), genotipagem, diagnóstico clínico, determinação de organismos geneticamente modificados em ingredientes alimentares, testes para determinação de DNA fetal em sangue materno, aplicações forenses, entre outros. Medidas de absorvância no UV-vis são comumente usadas para quantificação de ácidos nucleicos. Entretanto, os resultados obtidos são aproximados e a exatidão das medidas é limitada. Dessa forma, este trabalho apresenta um método simples e rápido empregando a Tioflavina T (TT) como sonda sensível e seletiva para determinação de DNA e/ou RNA através de fluorescência molecular. O mecanismo da reação consiste na interação da TT com DNA ou RNA. Este mecanismo se baseia no conceito off-on em que a tioflavina livre em solução apresenta baixa fluorescência, mas ao interagir com o ácido nucleico, ocorre restrição de rotação na molécula de TT, tornando-a planar e possibilitando o alinhamento dos orbitais π, desta forma, provocando aumento na intensidade de fluorescência. Após a adição de DNA, a TT mostrou um desvio para o vermelho (efeito batocrômico) nos espectros de absorção molecular, indicando que ocorre interação com a macromolécula. As condições experimentais foram otimizadas empregando DNA de salmão como modelo experimental de ácido nucleico (stDNA) em pH = 5, tampão MES (10 mM) e a concentração de TT em 5 μM. No estudo da força iônica observou-se que o aumento da concentração de NaCl (0 - 150 mM) desfavorece o processo de interação TT-DNA, indicando que a interação se dá por meio de atrações eletrostáticas. Além disso, realizou-se o estudo do modo de ligação com os competidores como brometo de etídio e berenil evidenciando que um segundo tipo de interação ocorre preferencialmente via groove. Nestas condições, a sonda respondeu a diferentes ácidos nucleicos (DNA e RNA) de forma imediata, sendo o sinal estável pelo menos até 120 min. O método proposto apresentou faixa linear de concentração de 0,1-1,5 mg L-1 em stDNA com limite de detecção (LOD) de 0,012 mg L-1 e desvio padrão relativo (RSD) menor que 3,7%. Quando se utilizou RNA como padrão a faixa linear foi de 0,25-3,0 mg L-1 com LOD de 0,073 mg L-1 e RSD menor que 3,2 %. Os íons Fe(III) e as proteínas albumina e lisozima foram os principais interferentes do método. Por fim, determinou-se a concentração de ácidos nucleicos em uma amostra de DNA extraído de plasma sanguíneo (padrão stDNA – 57 mg L-1 e ctDNA – 48,5 mg L-1), além disso, também foi realizado o ensaio de recuperação empregando ctDNA e stDNA em amostras de saliva, no qual obteve-se recuperações na faixa de 67-89%.