A toxoplasmose, protozoose disseminada de baixa morbidade, apresenta número significativo de doença ocular, congênita ou do sistema nervoso central. O diagnóstico é sorológico por diferentes testes, mas limiares baixos e variação individual levam a frequentes problemas. Novos imunoensaios fluorescentes de fase sólida (FLISA) usam a quantificação direta de anticorpos. Aqui, desenvolvemos um FLISA multiplex (FLISAm) para a detecção simultânea de anticorpos IgG e IgM contra Toxoplasma gondii. Após padronização, a eficiência do FLISAm com conjugados comerciais foi feita inicialmente de forma isolada para cada imunoglobulina em 140 amostras de soro de universitários previamente analisadas pelo ELISA IgG/IgM. FLISA IgG mostrou boa concordância (Kappa=0,7088), com sensibilidade de 83,3% e especificidade de 94,2%, enquanto FLISA IgM apresentou boa concordância (K=0,6026), menor sensibilidade de 55,5% e igual especificidade de 98,4%. Foram produzidos novos conjugados fluorescentes de maior especificidade e seu desempenho no FLISAm foi validado em 24 amostras e sua eficiência foi avaliada em 120 amostras conhecidas de soro de gestantes. FLISAm mostrou excelente concordância, tanto para a detecção de anticorpos IgG (K=0.8837, sensibilidade=100,0%, especificidade=87,5%), quanto para a detecção de anticorpos IgM (K=0,9187, sensibilidade=100%, especificidade=99,1%) com excelente reprodutibilidade. O teste desenvolvido é rápido, econômico, de fácil execução, alto rendimento e que pode ser utilizado como método de triagem de soroconversão em mulheres grávidas, útil em aplicações de grande número de amostras como o cuidado pré-natal. / Toxoplasmosis, a disseminated low morbidity protozoan disease, presented significant numbers of affected people, mainly ocular disease, fetal infections or encephalitis in immune deficient patients. Serology is the main diagnosis with commercial antibody assays, but individual variation or low thresholds cause many inconsistencies. New solid phase immunofluorescence assays (FLISA) allows direct antibody quantification in microplates. Here, we developed a multiplex FLISA (FLISAm) for simultaneous detection of IgG and IgM anti-Toxoplasma gondii antibodies. After standardization, the efficiency of this method was initially analyzed in isolated FLISA for each immunoglobulin with commercial conjugates in 140 serum samples of the students previously screened by IgG/IgM ELISA. IgG FLISA showed good concordance (Kappa=0.7088), 83,3% sensitivity and 94,2% specificity, while IgM FLISA also showed good concordance (Kappa=0,6026), lower 55,5% sensitivity and similar 98,4% specificity. New higher efficiency conjugated were prepared and tested in 120 serum samples of the pregnant woman in a same well conjunct IgG/IgM FLISAm. We also validate the FLISAm in 24 serum samples. Compared to isolated ELISA IgG/IgM, FLISAm demonstrated excellent concordance for IgG (Kappa=0.8837; sensitivity=100%; specificity=87,5%,) and IgM (Kappa=0,9187; sensitivity=100%; specificity=99,1%), with excellent reproducibility. The standardized FLISAm is quick, inexpensive, easily performed and high throughput and the assay can be used for screening serum conversion in pregnant women, useful in large numbers applications as antenatal care.

Este estudo in vitro avaliou o efeito da adição de rodamina B dissolvida em etanol nas concentrações de 0,02mg/mL e 0,10mg/mL, nas propriedades mecânicas dos sistemas adesivos não simplificados considerados padrão-ouro. 96 coroas de terceiros molares humanos hígidos foram seccionadas transversalmente no terço oclusal para remoção do esmalte e exposição da dentina. Os espécimes foram divididos de acordo com os sistemas adesivos Adper Scotchbond Multi-Purpose (MP) - convencional de três passos ou Clearfil SE Bond (SE) - autocondicionante de dois passos: MP-C e SE-C (MP e SE controles); MP-C1 e SE-C1 (MP e SE com rodamina B 0,02mg/mL); MP-C2 e SE-C2: (MP e SE com rodamina B 0,10mg/mL). Para o teste de RU, os espécimes (n=10) foram submetidos ao desgaste com lixas de granulação 320 e 600. A dentina foi tratada de acordo com as instruções de cada fabricante dos sistemas adesivos e restaurada com resina composta FiltekTM Z250. Após o armazenamento em saliva artificial (7dias/37oC), os espécimes foram seccionados para obtenção de palitos com 0,64 mm2 de área média e submetidos ao teste de microtração em máquina de teste universal a 0,5 mm/min, que foram analisados após 7 dias e 6 meses. O modo de fratura dos espécimes foi analisado com estereomicroscópio digital (x200) e classificado em: adesiva, coesiva em dentina, coesiva em resina e mista. Para o teste de MS, as coroas seccionadas (n=6) foram planificadas com lixa de granulação 600. A dentina foi tratada de acordo com as instruções de cada fabricante dos sistemas adesivos e os espécimes foram mantidos secos em estufa a 37oC durante 48 horas. O teste de MS foi realizado utilizando ponta Knoop (Microdurômetro Shimadzu HMV-2), a 10x e carga estática de 25gF por 10 segundos. Os resultados obtidos foram analisados por análise de variância (ANOVA-2 critérios) e teste de Bonferroni para comparações múltiplas (p<0,05). A análise de acordo com o tempo foi realizada com o teste de t-student. Os valores médios de RU e desvio padrão (MPa±dp; 7 dias / 6 meses) foram: MP-C (41,95±2,38 / 22,76±3,66); MP-C1 (28,02±5,12 / 17,93±5,70); MP-C2 (26,28±5,55 / 14,30±5,68); SE-C (46,07±1,43 / 19,07±6,75); SE-C1 (37,49±13,31 / 18,54±6,71); SE-C2 (34,16±7,71 / 17,89±4,87). No tempo de 7 dias, os fatores sistema adesivo e concentração de rodamina B foram significantes. Após 6 meses, apenas o fator concentração de rodamina B foi significante. A falha de fratura predominante em todos os grupos foi adesiva. Os valores de MS (KHN) e desvio padrão foram: MP-C (8,97±3,85); MP-C1 (7,33±0,99); MP-C2 (7,17±2,45); SE-C (4,71±4,42); SE-C1 (4,42±0,56); SE-C2 (3,27±0,30). Na comparação entre os sistemas adesivos, eles diferiram entre si na condição controle e de 0,10mg/mL. Para cada adesivo, não houve diferença entre as distintas condições de acordo com a adição de rodamina B. Em função dos resultados apresentados, a adição de rodamina B nos sistemas adesivos não simplificados MP e SE, nas concentrações de 0,02mg/mL e 0,10mg/mL, deve ser incorporada com cautela para que não influencie nas propriedades mecânicas do material. / This in vitro study evaluated the effect of addition of rhodamine B dissolved in ethanol in concentrations of 0.02mg/mL and 0.10mg/mL, the mechanical properties of non-simplified adhesive systems. 96 crowns of human third molars were transversely sectioned on the oclusal third to remove the enamel and exposure the dentin. The specimens were divided according to the adhesive systems Adper Scotchbond Multi-Purpose (MP) 3-step-etch-andrinse or Clearfil SE Bond (SE) 2-step-self-ecthing: MP-C and SE-C (MP and SE controls); MP-C1 and SE-C1 (MP and SE with 0.02mg/mL rhodamine B); MP-C2 and SE-C2: (MP and SE with 0.10mg/mL rhodamine B). For the &#x3BC;TBS test, the specimens (n=10) were ground with 320- to 600-grit silicon carbide paper. The dentin was treated according to the instructions of each manufacturer and restored with composite resin FiltekTM Z250. The specimens were stored in artificial saliva (7 days/37oC), and then sectioned to obtain sticks with an average of 0.64 mm2 area and submitted to &#x3BC;TBS test at a universal testing machine at 0.5 mm/min, which were analyzed immediately after 7 days and 6 months. The mode of fracture of the specimens was analyzed with digital stereomicroscope (x200) and classified as: adhesive, cohesive in dentine, cohesive in resin and mixed. For the SM test, the sectioned crowns (n=6) were flattened with 600-grit silicon carbide paper. The dentin was treated according to the manufacturers instructions for each adhesive system and the specimens were stored in dry condition at 37oC during 48 hours. The SM test was performed with Knoop indenter (Shimadzu HMV-2 hardness tester), at 10x and 25gF of load for 10 seconds. The results were analyzed by two-way analysis of variance tests and the Bonferroni test for multiple comparisons (p<0.05). The analysis regarding time was checked with t-student test. The mean &#x3BC;TBS and standard deviation (MPa±dp; 7 days / 6 months) were: MP-C (41.95±2.38 / 22.76±3.66); MP-C1 (28.02±5.12 / 17.93±5.70); MP-C2 (26.28±5.55 / 14.30±5.68); SE-C (46.07±1.43 / 19.07±6.75); SE-C1 (37.49±13.31 / 18.54±6.71); SE-C2 (34.16±7.71 / 17.89±4.87). In the immediate time, the adhesive system and rhodamine B concentration factors were significant. After 6 months, only the rhodamine B concentration was a significant factor. The predominant failure in all groups was adhesive. The values of SM and standard deviation were: MP-C (8.97±3.85); MP-C1 (7.33±0.99); MP-C2 (7.17±2.45); SE-C (4.71±4.42); SE-C1 (4.42±0.56); SE-C2 (3.27±0.30). In the comparison between the adhesive systems, they were significantly different for the conditions control and 0.10mg/mL. For each adhesive systems, there was no difference between the different conditions according to the addition of rhodamine B. Regarding the shown results, addition of rodhamine B in non-simplified adhesives MP and SE, in the concentrations of 0.02mg/mL e 0.10mg/mL must be carefully added to avoid implications to the mechanical properties of the materials.

Orientador: Luis Alexandre Maffei Sartinni Paulillo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-21T22:09:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Araujo_CintiaTerezaPimentade_D.pdf: 9367664 bytes, checksum: 6c7161dae0f158a143f829e530249b20 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A microscopia confocal de varredura a laser (MCVL) é um recurso de visualização microscópica que permite a análise de materiais ou estruturas com requisitos mínimos de preparação de amostras de modo não destrutivo. Assim, os objetivos deste estudo foram: avaliar a influência da incorporação do corante fluorescente Rodamina B (R) nas propriedades mecânicas resistência coesiva (RC), módulo de elasticidade (ME) e resistência à flexão (RF) de 2 sistemas adesivos, o autocondicionante Clearfil SE Bond e o convencional Scotchbond Multi-Purpose (estudo 1); validar o método modificado de microtração (?TBS), em que micro-amostras de secção transversal de 0,09 mm2 foram testadas e verificar a influência da R na resistência à união a dentina e integridade interfacial através de microscopia confocal (estudo 2). Para avaliar a influência do corante, 0,16 mg/ml de R foram incorporados aos adesivos constituindo assim dois grupos para cada adesivo: grupos dos adesivos corados e não corados totalizando 4 grupos experimentais. Para a análise da RC, E e RF, os corpos de prova foram confeccionados a partir de uma matriz de silicone por adição. Sobre a matriz, foram dispensados 10 ?L de adesivo variando de acordo com cada grupo de adesivos corados e não corados. RC (n= 10), E e RF (n= 5) foram avaliadas em máquina de ensaio universal a 0,5 mm/min, até a ruptura da amostra. Para visualização em microscopia confocal e análise da resistência à união os adesivos foram aplicados à superfície plana da dentina oclusal de 32 pré-molares humanos. Após a realização dos procedimentos adesivos, realizaram-se as restaurações (blocos de 16 mm2) com Charisma Opal (Kulzer - cor A3). Em seguida, para a realização do teste modificado de microtração, micro-amostras em forma de palito (secção transversal 0,09 mm2) foram confeccionadas. Previamente ao ensaio mecânico, foi realizada através de MVCL a análise micromorfológica das microamostras dos grupos de adesivos corados. Posteriormente a resistência à união foi mensurada através do ensaio modificado de microtração a velocidade de 0,5 mm/min em máquina de ensaio universal. Os dados de todos os testes avaliados foram submetidos à análise de variância dois fatores. Os resultados mostraram que o comportamento dos sistemas adesivos investigados não se modificou, independente da presença do corante, pois não foram observadas diferenças significativas nas propriedades mecânicas estudadas: resistência à união, resistência coesiva, resistência flexural, módulo de elasticidade, bem como a integridade interfacial. A preparação de micro-amostras não comprometeu os resultados do ensaio de resistência adesiva. De acordo com os resultados obtidos e análise dos parâmetros: coeficiente de variação, porcentagem de padrão de fratura e incidência de falhas prematuras, concluiu-se que o teste modificado de microtração foi considerado um método confiável para a avaliação da resistência à união de sistemas adesivos. A técnica de visualização microscópica confocal produziu informações detalhadas da interface adesiva e pode ser bem indicada para a avaliação da efetividade de união de sistemas adesivos. Desta forma, é possível associar ambas as metodologias obtendo-se uma avaliação mais realista e confiável dos materiais restauradores / Abstract: The confocal laser scanning microscopic (CLSM) is a tool of visualization that allows microscopic analysis of materials or structures labeled with fluorescent dyes with minimal requirements of specimen's preparation nondestructively. The aims of this study were: to evaluate the influence of incorporation of fluorescent dye Rhodamine B (R) in the properties mechanical: cohesive strength (CS), elastic modulus (E) and flexural strength (FS) of the selfetching Clearfil SE Bond and etch-and-rinse Scotchbond Multi-Purpose (Study 1); validating the modified microtensile method using micro-specimens cross section of 0.09 mm2 (?TBS) and evaluate the influence of R in bond strength in dentin and interfacial integrity by confocal microscopy (study 2). To evaluate the influence of the dye, 0.16 mg/ml of R were incorporated into adhesives thus forming two groups for each adhesive: groups of labeled adhesives and no-labeled totaling 4 experimental groups. For the analysis of CS, E and FS the specimens were made from a silicone matrix. About the matrix were 10 ?L dispensed adhesive varying according to each group of adhesives stained or not. CS (n = 10), E and FS (n = 5) were evaluated in a universal testing machine at 0.5 mm/min until failure of the specimen. For visualization in confocal microscopy and bond strength analysis (n = 8), the adhesives were applied to the occlusal dentine surface 32 of human premolars. After procedures adhesives, composite crowns approximately (16 mm2) were built up with Charisma Opal (Kulzer - color A3). Then for testing modified microtensile, micro-specimens beam-shaped were prepared. Prior to mechanical testing micromorphological analysis of micro-sticks of the groups of labeled adhesives was performed using CLSM. Subsequently bond strength was measured using the modified microtensile test in a universal testing machine speed of 0.5 mm/min. The results showed that the behavior of the adhesive systems investigated did not change regardless of the presence of the dye, as there were no significant differences in mechanical properties studied: bond strength, tensile strength, flexural strength, modulus of elasticity, as well as interfacial integrity. The preparation of micro-specimens did not affect the results of the bond strength test. According to the analysis results and parameters: coefficient of variation percentage of fracture pattern and incidence of early failures, it is concluded that the modified microtensile test was considered a reliable method for evaluating the bond strength of adhesive systems. The confocal microscopic visualization technique yielded detailed information of the adhesive interface and can be well suited for evaluating the effectiveness of adhesive systems. Thus, it is possible to associate both methods give a more realistic and reliable adhesive restoration on the presence of fluorescent dye / Doutorado / Dentística / Doutora em Clínica Odontológica

One of the main subjects of this thesis is to design a novel synthetic route to covalently functionalize carbon nanotubes with various molecules in a non-toxic way on both surface and suspension. Functionalized carbon nanotubes are of great interest in the field of molecular electronics, materials science and nano-bio applications because of their remarkable structural, chemical and physical properties. First, the single-walled carbon nanotubes are functionalized with gold nanoparticles by the route, which involves silanization and copper-free click chemistry (SPAAC). We characterize the functionalized nanotubes through XPS, IR and Raman spectroscopic techniques to identify the surface attachment of molecules after each step. We observe a drastic change in homogeneity and functionalization density of single-walled carbon nanotubes with gold nanoparticles concerning solvent through TEM. Employing the same route, biomolecules such as fluorescent dyes and single-stranded DNA molecules are integrated with SWNTs. Fluorescence lifetime analysis of AF647 functionalized SWNTs is reduced compared to free dye due to the fluorescence quenching phenomenon of carbon nanotubes. Functionalized SWNTs are characterized with FLIM, SEM, and Raman for better correlation at the same area of interest. Furthermore, the nanotubes are resolved at the nanoscale level through STORM imaging technique with a limited photon budget. Single-stranded DNA molecules of different lengths are used to investigate the fluorescence quenching as they are distance-dependent. DNA-PAINT is engaged in imaging the functionalized SWNTs with an unlimited photon budget, overcoming STORM's challenge. Lastly, the route is transferred to surface-grown CNTs through the CVD technique, in which both the gold nanoparticles and fluorescent dyes are grafted with nanotubes selectively. CVD is carried out on different substrates Si/SiO2, quartz substrate and quartz coverslip for substrate functionalization. Catalyst deposition plays a significant role in not only the CVD growth but also in the lifetime analysis of the substrate functionalized nanotubes. We observe similar fluorescence quenching of nanotubes in the substrate compared with nanotubes functionalized in suspension. Surface-grown nanotubes in the optically transparent substrate can be resolved through STORM at the nanoscale level. In conclusion, we demonstrate a synthetic design to functionalize SWNTs which provides the possibility to be versatile and non-toxic. Moreover, we show that the nanotubes can be functionalized through this route homogeneously and selectively on both surface and suspension. This work lays the foundation for tailoring SWNTs with not only a wide range of molecules and to study their functional characteristics but also to carry out functionalization on different substrates for various applications.

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A toxoplasmose é uma infecção que pode causar graves lesões fetais quando adquirida durante a gestação. O diagnóstico é sobretudo sorológico e deve ser feito por acompanhamento mensal em gestantes soronegativas, que tem aumentado nos últimos anos. A triagem sorológica para estas gestantes demanda metodologias de alto desempenho e eficiência, que permitam a introdução rápida do tratamento evitando a doença. Para este fim, desenvolvemos um ensaio sorológico fluorescente de fase sólida para a detecção conjunta de IgG, IgM e IgA contra Toxoplasma gondii (FISAt). Nosso grupo tem desenvolvido novos testes fluorimétricos de fase sólida com conjugados fluorescentes refinados sensíveis e específicos com possibilidade de detecções simultâneas numa mesma reação. Para a construção do FISAt, foram selecionados e produzidos conjugados marcados com fluorocromos de emissão não interferente, com alta eficiência e similares à reatividade de conjugados comerciais enzimáticos. Esta seleção de conjugados fluorescentes detectados com filtros de excitação e emissão adequados permitiram um aumento da intensidade do sinal de fluorescência e maior discriminação entre soros positivos e negativos. A reação foi realizada com extrato total de T. gondii adsorvido em fase sólida e para o controle positivo das reações, utilizamos a adsorção de classes de imunoglobulinas purificadas, evitando o uso de raros soros positivos controles. A validação do FISAt foi feita com 500 amostras de soro em sua maioria gestantes do HCFMUSP previamente analisadas por ensaios comerciais realizados em outro laboratório (Elecsys Toxo IgG/IgM, e IFAT IgM) ou ELISA IgG/IgM/IgA. Comparado com o Elecsys Toxo IgG/IgM, o FISAt IgG mostrou boa concordância (Kappa=0.77), com sensibilidade de 76.2% e especificidade de 96.8%, enquanto que o FISAt IgM mostrou boa concordância (Kappa=0.63), menor sensibilidade de 62.1% e especificidade de 97.6%. O FISAt foi mais concordante com o ELISA tanto na detecção de IgG, quanto de IgM anti-T. gondii (Kappa>70%), com maior sensibilidade de 82% e similar especificidade. E o FISAt IgA obteve excelente concordância com o ELISA (Kappa=0.77), com sensibilidade de 92.0% e especificidade de 98.3%. Em comparação com o método confirmatório IFAT IgM, o FISAt IgM mostrou sensibilidade de 100% e especificidade de 94.6%. Das 420 gestantes, 0.7% obtiveram resultado de baixa avidez de anticorpos IgG anti-T. gondii e foram identificadas na triagem como IgG, IgM e/ou IgA positivas em todos os testes avaliados, mostrando a eficiência discriminante do FISAt. O FISAt mostrou excelente reprodutibilidade (r2>0.82) e alto rendimento na triagem de grande número de amostras. Este novo teste múltiplo rápido e de detecção quantitativa pode ser usado em sistemas robóticos e tem uma aplicabilidade essencial para a triagem e tratamento de gestantes em risco de toxoplasmose congênita, ou para outras abordagens diagnosticas de alto volume de amostras. / Toxoplasmosis is an infection that can cause serious fetal damage when obtained during pregnancy. The diagnosis is mainly serological and should be done monthly monitoring seronegative pregnant women, which has increased in recent years. The serological screening for these pregnant women demands high performance and efficiency methodologies which allow the rapid introduction of the treatment avoiding the disease manifestation. With this in mind, our goal was to develop a solid phase fluorescent serological assay for IgG, IgM and IgA detection against Toxoplasma gondii (FISAt). Our group has been develop new solid phase fluorimetric assays with sensitive and specific refined fluorescent conjugates with the possibility of simultaneous detection in the same reaction. For the construction of the FISAt, conjugates labeled with non-interfering emission fluorochromes were designed and produced with high efficiency and similar reactivity of enzymatic commercial conjugates. This design of conjugates with suitable filters generated an increase in fluorescence intensity with a higher signal between positives and negatives sera. The reaction was made with total extract of T. gondii adsorbed solid phase. Also, for the positive control of the reactions, we have used the adsorption of purified classes of immunoglobulins, avoiding the use of rare positive control sera. FISAt validation was performed with 500 serum samples, mostly from HCFMUSP pregnant women previously analyzed by commercial tests (Elecsys Toxo IgG/IgM, and IFAT IgM) or ELISA IgG/IgM/IgA. In comparation to Elecsys Toxo IgG/IgM, FISAt IgG has shown excellent agreement (Kappa=0.77), with a sensitivity of 76.2% and specificity of 96.8%, whereas IgM FISAt has shown a good agreement (Kappa=0.63), with a lower sensitivity (62.1%) and similar specificity (97.6%). FISAt was more consistent with ELISA in both anti-T. gondii IgG and IgM detection (Kappa> 70%), with greater sensitivity (82%) and similar specificity. FISAt IgA obtained excellent agreement with the ELISA (Kappa = 0.77), showing 92.0% of sensitivity and 98.3% of specificity. In comparison with the IFAT IgM confirmatory method, FISAt IgM showed excellent sensitivity of 100% and specificity of 94.6%. Amongst 420 pregnant women, 0.7% had a low avidity anti-T. gondii IgG antibody result and were identified in the screening as IgG, IgM and/or IgA positive in all the evaluated tests, showing the discriminant efficiency of the FISAt. FISAt showed excellent reproducibility (r2>0.82) and a great income for high throughput screening. This new rapid and quantitative multiple detection assay can be used in robotic systems and has an essential applicability for screening and treatment of pregnant women at congenital toxoplasmosis risk, as well as for others diagnostic approaches of high volume samples.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2003. / Härtill 8 uppsatser.