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Les protéines kinases A (PKA) sont des enzymes qui catalysent la phosphorylation de résidus sérine ou thréonine. L’activité des PKA peut être mesurée in cellulo grâce aux biosenseurs AKAR (A-Kinase Activity Reporter). AKAR est composé de 4 modules: la séquence substrat des PKA, un domaine de liaison aux acides aminés, et 2 protéines fluorescentes pouvant interagir par FRET (Förster Resonant Energy Transfer). La phosphorylation de la séquence consensus par la PKA et l’interaction de l’acide aminé phosphorylé avec le module senseur provoque une modification de la conformation d’AKAR et une augmentation du FRET entre les 2 protéines fluorescentes.L’objectif initial de ce travail était de produire un biosenseur AKAR basé sur un nouveau couple de protéines fluorescentes plus performantes, et insensibles au pH. Ce biosenseur devant à terme être utilisable en imagerie ratiométrique, et en FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy). Ainsi nous avons mis au point une nouvelle version d’AKAR: AqAKARCit. Cette version exploite la protéine Aquamarine, l'une des meilleures protéines cyan disponibles aujourd'hui, avec un rendement quantique de 89%, un déclin de fluorescence mono-exponentiel, et une insensibilité au pH dans tout le domaine physiologique. Les résultats obtenus en FLIM avec cet AqAKARCit ont permis des améliorations notables en stabilité et sensibilité.Une version baptisée AqAKARTagRFP a été construite, dans laquelle l’accepteur est une protéine fluorescente orange permettant une meilleure séparation spectrale entre donneur et accepteur et insensible aux variations de pH. Les étapes de caractérisations de AqAKARTagRFP ont été accomplies en FLIM, et en ratiométrie. AqAKARTagRFP permet d'obtenir de bonnes réponses en FRET par ratiométrie, mais reste difficilement utilisable en FLIM en raison d'une dynamique de réponse limitée. La sensibilité du biosenseur a été améliorée par une modification de l'ancrage de l'Aquamarine. Les modifications apportées à cette version nommée AqEAKARTagRFP la place au niveau des biosenseurs AKAR les plus performants actuellement disponibles.Les mesures de sensibilité au pH d’ AqEAKARTagRFP réalisées en FLIM ont révélé une insensibilité au pH du biosenseur sur une étendue de pH jamais atteinte jusqu’à présent. Cependant, en ratiométrie, on note malgré tout une sensibilité détectable aux pHs fortement acides (pH ≤ 6), ce qui ne permettra pas de l'utiliser pour l'imagerie ratiométrique de compartiments cellulaires acides. Un contrôle négatif non phosphorylable AqEAKARmutTagRFP a été étudié. Ce contrôle présente les mêmes variations de signal en réponse à des changements imposés de pH intracellulaire, révélant que ces variations sont indépendantes de l’activité PKA.L'étude de tandems CFP-Cit et Aq-Cit dépourvus de la partie senseur nous à permis d'analyser le comportement de FRET des couples cyan/jaune en fonction du pH. Un modèle décrivant ce comportement a été créé et appliqué à AKAR.Les expériences complémentaires faites sur CFPAKARCit sont en accord avec nos simulations mais la construction AqAKARCit révèle du FRET résiduel à pH acide que notre modèle numérique ne prévoit pas. Une sensibilité aux pH acides de la partie senseur d’AKAR qui provoquerait un changement de conformation du biosenseur et une augmentation de FRET pourrait expliquer ce phénomène.Ce travail de thèse a permis la mise au point d’un nouveau couple de protéines fluorescentes par le FRET insensibles au pH. Ce couple va permettre une meilleure caractérisation des sensibilités des biosenseurs existants comme nous l’avons montré avec AKAR. Ce couple de protéines fluorescentes pourra également être utilisé dans des compartiments cellulaires acides, par exemple pour étudier des interactions protéine/protéine. Enfin, grâce à une meilleure séparation spectrale en excitation et en émission, ce couple peut être utilisé dans des applications plus exigeantes comme la microscopie biphotonique. / Protein kinase A (PKA) are enzymes which catalyze the phosphorylation of serine or threonine residues. The activity of PKA can be measured in cellulo through AKAR biosensors (A-Kinase Activity Reporter). AKAR consists of 4 modules: the PKA substrate sequence, a phospho-amino binding domain, and two fluorescent proteins that can interact by FRET (Förster Resonant Energy Transfer). After action of the PKA, the interaction between the phophorylated amino acid and the phospho-amino binding domain causes a change in the conformation of AKAR and an increase in FRET between the two fluorescent proteins.The initial objective of this work was to produce an AKAR biosensor based on a new pair of improved fluorescent proteins, and insensitive to pH. This biosensor to eventually be used in ratiometric imaging and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy). So we developed a new version of AKAR: AqAKARCit. This version uses the Aquamarine protein, one of the best cyan proteins available today, with a quantum yield of 89%, a near mono-exponential fluorescence decay, and insensitive to pH throughout the physiological range. The results obtained with this AqAKARCit allowed significant improvements in stability and sensitivity.A version called AqAKARTagRFP was built, in which the acceptor is an orange fluorescent protein allowing better spectral separation between donor and acceptor and insensitive to pH variations. The characterization of AqAKARTagRFP was performed in FLIM, and ratiometry. AqAKARTagRFP provides good answers in FRET by ratiometry but remains difficult to use in FLIM due to limited dynamic responses. The sensitivity of the biosensor has been improved by modification of the anchoring of Aquamarine. Changes to this version named AqEAKARTagRFP place it at the most efficient AKAR biosensors currently available.The pH-responsive measures of AqEAKARTagRFP made in FLIM showed insensitivity to pH on a range never reached so far. However, in ratiometry, there is still a detectable sensitivity to highly acidic pHs (pH ≤ 6), which will not allow to use it for ratiometric imaging of cellular acidic compartments. A negative unphosphorylatable control AqEAKARmutTagRFP was studied. This control presents the same signal variations in response to changes imposed on intracellular pH, revealing that these variations are independent of PKA activity.The study of the CFP-Cit and Aq-Cit tandems devoid of the sensor part allowed us to analyze the behavior of cyan / yellow FRET pairs regarding the pH. A model describing this behavior was created and applied to AKAR. Additional experiments on CFPAKARCit are in agreement with our simulations but AqAKARCit reveals residual FRET at acidic pHs that our numerical model does not predict. A sensitivity to acidic pH of the sensor module of AKAR which would cause a conformational change in the biosensor and an increase in FRET could explain this phenomenon.This thesis has allowed the development of a new pair of fluorescent proteins for FRET imaging insensitive to pH. This couple will allow better characterization of existing biosensors sensibilities as we have shown with AKAR. This pair of fluorescent proteins may also be used in acidic cellular compartments, for example to study protein / protein interactions. Finally, through improved spectral separation in excitation and in emission, this pair can be used in more demanding applications such as biphoton microscopy.

Calcium plays important roles in both eukaryotic and prokaryotic cells. Its actions help to stabilize cell synthesis, growth and development. In this thesis, studies have been completed to determine effects of calcium and pH on bacterial cell growth and protein expression using the bacterial cell strain E.coli BL21(DE3). Our studies demonstrated the addition of calcium addition in the media does not affect growth but increases protein expression, while reducing the pH from 7 to 4 through the addition of 10mM EGTA in LB media inhibits both. Additionally, we report studies on the design, expression, and purification of fluorescent mCherry variants and their differences in their optical properties, including: extinction coefficients , quantum yields and pKa values. Also, we report progress in the crystallization of two GFP calcium sensors: G1 and D1, using 13 and15% PEG 4000 and 3350 respectively in 50mM HEPES buffer (pH 6.8-7.0) in an effort to optimize crystallization.

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Thesis (Ph.D. in Cell Biology, Stem Cells, & Development) -- University of Colorado Denver, 2008. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 138-155). Free to UCD Anschutz Medical Campus. Online version available via ProQuest Digital Dissertations;

Orientador: Selma Giorgio / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T13:17:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_SolangedosSantos_M.pdf: 4660323 bytes, checksum: 5aef15cb049a82091dd076c48c1f6f2b (MD5) Previous issue date: 2010 / Mestrado / Parasitologia / Mestre em Parasitologia

Tous les organismes vivants convertissent leurs informations génétiques en protéines fonctionnelles par des mécanismes de transcription/traduction. Ces phénomènes fondamentaux de la biologie sont maintenant maitrisés au niveau biochimique, et il est possible par le biais de systèmes dits " cell free " de produire des protéines in vitro à partir de fragments d'ADN synthétiques. Ces systèmes minimaux d'expression génique représentent autant un outil fondamental pour la compréhension des mécanismes du vivant qu'une plateforme pour de nombreuses applications biotechnologiques. Néanmoins, le contrôle (déclenchement, régulation) de ces systèmes reste limité en comparaison de leurs analogues naturels. Dans cette thèse, j'explore tout d'abord des moyens de régulation de l'expression en système cell-free par voie métabolique, en étudiant l'influence de différents facteurs biochimiques ou énergétiques. Je m'intéresse ensuite à la mise en place d'un contrôle réversible en exploitant un couplage antibiotique/enzyme. Je montre également que l'inhibition produite par cet antibiotique peut être exploitée pour étudier les cinétiques de maturation des protéines fluorescentes. Enfin, je décris un protocole innovant de préparation de protéoliposomes géants fonctionnels permettant à la fois l'expression in situ de protéines membranaires eucaryotes et leur modification post-traductionnelle. Cette approche est appliquée en particulier pour la reconstitution de pores membranaires déclenchables par voie thermique ou enzymatique. / Throughout Transcription and Translation, every single living organism converts the genetic information it carries into functional proteins. These fundamental mechanisms are nowadays mastered up to their biochemical level, enabling us to produce in vitro proteins from synthetic DNA fragments, by the use of so called Cell-free systems. This minimalistic approach of gene expression represents both a tool to unravel biological mechanisms and a platform to develop new biotechnology applications. In spite of these credits, controlling these systems (triggering, regulation) is still scarcely achieved. The aim of the thesis is first of all to explore new means of metabolic regulation for gene expression in cell-free systems, by studying the influence on expression levels of biochemical and energetic factors. I then focus the research to establish a reversible control comprising the coupling of an enzyme and an antibiotic. Moreover, I demonstrate that the inhibition caused by this antibiotic can be used to study the maturation kinetics of fluorescent proteins. Finally, I describe an innovative, one-pot, protocol to prepare functional giant proteoliposomes, enabling simultaneously in situ expression of the eukaryotic membrane proteins and their post-translational modifications. This approach is then applied to reconstitute membranous pores triggered by thermal changes or specific enzymatic activity.

and keywords Abstract and keywords The ubiquitin-proteasome system (UPS) is a tightly and specifically regulated system of protein degradation in eukaryotic cells. Inhibition of an UPS component might represent a strategy to control human diseases, including cancer. Modulation of the UPS can also be employed in basic research strategies. This thesis deals with two independent yet methodologically connected research aims - first, to search for the target of the newly identified UPS inhibitor CBU79, and second, to develop a fluorescent cell-based reporter exploiting proteasomal degradation. In the first part of my work, previous findings regarding the molecular mechanisms of CBU79 inhibiton on the UPS were confirmed. In the next step, I characterized how the UPS inhibitor CBU79 affects protein synthesis using the metabolic labelling of proteins based on click chemistry. I also examined the cytotoxic effect of CBU79 treatment on different cell lines. Finally, I performed a CRISPR/Cas9 whole-genome enrichment screen with the aim to find a potential target of the inhibitor. I found out that CBU79 probably decreases levels of protein synthesis by triggering cellular signalling via the unfolded protein response (UPR). Using the screen, I found 22 potential targets of the CBU79 inhibitor that will be...

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