Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / Afin d'obtenir un ovocyte compétent au développement, une communication bidirectionnelle entre l'ovocyte et les cellules somatiques doit être maintenue à travers la folliculogenèse. Cette communication assure une progression harmonieuse de la folliculogenèse, assurant une croissance et une maturation coordonnées des ovocytes dans le microenvironnement folliculaire. Au stade précoce du développement, la déposition graduelle de la zone pellucide vient poser une barrière physique à la communication intercellulaire entre l'ovocyte et les cellules de la granulosa. Dès lors, des projections cytoplasmiques de la granulosa, les projections transzonales (PTZs) vont s'apposer sur la membrane plasmique de l'ovocyte avec des jonctions gap afin de maintenir une collaboration active entre ces deux compartiments. Il est connu qu'une dérégulation dans le développement des PTZs est associée avec une compétence développementale et un succès reproducteur réduit. Toutefois, peu est connu sur les mécanismes de formation des PTZs. Afin d'avoir une meilleure compréhension du mécanisme de formation des PTZs, un parallèle a été découvert entre la structure et le fonctionnement des PTZs avec les synapses dans le système neuronal. Dans le système neuronal, les facteurs neurotrophiques sont essentiels pour la croissance, la différenciation et la survie des neurones. Ces facteurs sont également présents au sein de l'ovaire et leur dérégulation est associée à diverses pathologies reproductives, jusqu'à l'infertilité chez la femme. Sachant la similitude entre les PTZs et les neurones, il est possible que les facteurs neurotrophiques exercent une fonction similaire dans le développement des connections intercellulaires entre l'ovocyte et les cellules somatiques. L'hypothèse de travail est que les facteurs neurotrophiques supportent les processus de la folliculogenèse et l'ovogenèse partiellement en favorisant le développement et la fonction des PTZs, ainsi supportant la communication intercellulaire au sein du follicule ovarien. Nos objectifs sont d'étudier l'addition de facteurs neurotrophiques, soit *nerve growth factor* (NGF), *brain-derived growth factor* (BDNF) et *glial cell line-derived neurotrophic factor* (GDNF), sur le développement folliculaire et la formation des PTZs. Un système de croissance folliculaire *in vitro* encapsulé est utilisé dans le but de modifier le microenvironnement du follicule ovarien préantral, en exposant ceux-ci aux différents facteurs de croissances neuronaux. Nos résultats ont démontré que les neurotrophines (NGF et BDNF) régulent l'assemblage des PTZs en augmentant leur nombre et leur extension lors du développement des follicules ovariens. GDNF détient un rôle différent, ayant seulement un effet sur l'extension des PTZs. Une interaction entre les voies de signalisations de NGF et GDNF a été explorée, mais n'a pas été démontré comme ayant une implication bénéfique au niveau de la formation des PTZs. Toutefois, cette combinaison a joué un rôle de synergie au niveau de la survie folliculaire. De même, les neurotrophines ont démontré un rôle bénéfique sur la survie. Cette étude illumine une interaction complexe entre la formation des PTZs, la prévention de l'atrésie et le développement folliculaire, étant coordonnée par les facteurs neurotrophiques. Nos travaux offrent des nouvelles perspectives sur l'implication des facteurs des facteurs intra-ovariens sur la qualité ovocytaire. / In order to obtain a competent oocyte, bidirectional communication between the oocyte and somatic cells must be maintained throughout folliculogenesis. This communication ensures a harmonious progression of folliculogenesis, guaranteeing coordinated growth and maturation of oocytes within the follicular microenvironment. In the early stages of development, the gradual deposition of the *zona pellucida* creates a physical barrier to intercellular communication between the oocyte and granulosa cells. Subsequently, cytoplasmic projections from the granulosa, known as transzonal projections (TZPs), adhere to the oocyte's plasma membrane through gap junctions to maintain active collaboration between these two compartments. It is known that dysregulation in TZP development is associated with developmental competence and reduced reproductive success. However, little is known about the mechanisms of TZP formation. To gain a better understanding of TZP formation, a parallel has been discovered between the structure and functioning of TZPs and synapses in the neuronal system. In the neuronal system, neurotrophic factors are essential for the growth, differentiation, and survival of neurons. These factors are also present in the ovary, and their dysregulation is associated with various reproductive pathologies, including infertility in women. Given the similarity between TZPs and neurons, it is possible that neurotrophic factors play a similar role in the development of intercellular connections between the oocyte and somatic cells. Our hypothesis is that neurotrophic factors partially support the processes of folliculogenesis and oogenesis by promoting the development and function of TZPs, thereby supporting intercellular communication within the ovarian follicle. Our objectives are to study the addition of neurotrophic factors, namely nerve growth factor (NGF), brainderived growth factor (BDNF), and glial cell linederived neurotrophic factor (GDNF), on follicular development and TZP formation. An encapsulated *in vitro* follicle growth system is used to modify the preantral ovarian follicle micrnvironment, exposing them to different neurotrophic growth factors. Our results have demonstrated that neurotrophins (NGF and BDNF) regulate the assembly of transzonal projections (TZPs) by increasing their number and extension during the development of ovarian follicles. GDNF plays a different role, primarily affecting the extension of TZPs. An interaction between the signaling pathways of NGF and GDNF was explored but was not demonstrated to have a beneficial implication in TZP formation. However, this combination played a synergistic role in follicular survival. Similarly, neurotrophins showed a beneficial role in survival. This study highlights a complex interaction between TZP formation, prevention of atresia, and follicular development, coordinated by neurotrophic factors. Our work provides new insights into the involvement of intraovarian factors in oocyte quality.

Depuis les dernières décennies, la parentalité est un projet qui se voit pour plusieurs repoussé à un âge plus avancé. Par conséquent, de plus en plus de couples font face à des problèmes d'infertilité lors que vient le temps de fonder une famille. Le recours aux techniques de procréation médicalement assistée, telle que la fécondation in vitro, est donc lui aussi en constante augmentation. Malgré les nombreux progrès réalisés depuis l'introduction de la fécondation in vitro dans les années 80, le taux de succès de cette technique demeure insatisfaisant, avec un taux de grossesse autour de 30%. La réponse des patientes au traitement de stimulation ovarienne précédant la fécondation in vitro est extrêmement variable et difficile à prédire. De plus, lorsqu'un cycle échoue, c'est généralement sans raison apparente. Les travaux de cette thèse reposent sur l'hypothèse qu'il existe une signature moléculaire liée aux différentes réponses/causes d'échec. L'expression des gènes pourrait être utilisée pour caractériser la réponse des patientes à la stimulation hormonale de façon à pouvoir adapter le traitement suivant et potentiellement améliorer les chances de succès. Nous nous sommes donc intéressés à l'expression des gènes dans les cellules de la granulosa provenant principalement de follicules en contexte de stimulation hormonale, durant la période 34 heures post hCG ou encore provenant d'un modèle in vitro de culture cellulaire. Dans un premier temps, des cellules folliculaires provenant de femme ayant recourt à la fécondation in vitro ont été récoltées lors de la ponction ovarienne. Une biopuce fut utilisée afin de comparer l'expression des gènes entre les patientes pour qui le cycle de fécondation in vitro fut un échec (pas de grossesse) et celles pour qui ce fut un succès(grossesse). Nous avons constaté qu'il existe une signature transcriptomique différente chez les patientes pour qui le cycle a échoué. De plus, l'analyse des gènes différentiellement exprimés et des principales voies biologiques y étant associée nous ont renseignés davantage sur les mécanismes physiologiques potentiellement liés à l'échec, notamment un débalancement inflammatoire, une différenciation anormale et une augmentation de l'apoptose. Par la suite, 135 échantillons de cellules folliculaires provenant exclusivement de patientes pour qui la fécondation in vitro fut un échec (pas de grossesse) ont été utilisés. Des gènes liés à différentes causes d'échec potentielles ont été analysés en qRT-PCR, avant de réaliser une analyse de regroupement hiérarchique (clustering). La population de patientes non enceintes fut divisée en trois groupes possédant chacun un modèle d'expression génique particulier lié à une cause d'échec potentielle. Nous avons ainsi pu voir qu'il était possible de distinguer différentes causes d'échec ou différentes réponses folliculaires chez les patientes dont le cycle a échoué. Nous avons finalement utilisé un modèle in vitro de cellules de la granulosa humaine (lignée cellulaire KGN) afin d'étudier la capacité des cellules de la granulosa de répondre, à elles seules, à différents stimuli inflammatoires. Cette étude nous a permis de voir, via l'expression de gènes d'inflammation, que les cellules de la granulosa peuvent créer une réponse inflammatoire et que celle-ci est différente selon le type de stimulus. Globalement, les résultats de ces études améliorent les connaissances et la compréhension de l'échec en contexte de fécondation in vitro. Ils mettent également en lumière le potentiel de l'expression des gènes comme outil de diagnostic de la réponse folliculaire. Finalement, ils confirment également l'importance de l'inflammation et de son contrôle, particulièrement en contexte de procréation assistée. / Since the last few decades, couples tend to postpone parenthood to later in life. As a result, an increasing number of couples are facing infertility problems when it comes to building a family and have children. Consistently, the use of assisted reproductive technologies such as in vitro fertilization is also increasing. Despite all the progress that has been made since the introduction of in vitro fertilization in the 1980s, the success rate of this technique remains low, with a pregnancy rate around 30%. The patient's response to the stimulation treatment that precedes in vitro fertilization is extremely variable and difficult to predict. Moreover, when a cycle fails, most of the time there is no apparent reason. The hypothesis of this thesis is that there is a transcriptomic signature in follicular cells that reflects the ovarian response. Gene expression could be used to characterize the patient's response to the hormonal stimulation in order to adapt the next treatment accordingly and thus potentially improve the chances of success. Our work focuses on the gene expression in granulosa cells coming mainly from stimulated follicles in the context of in vitro fertilization or from an in vitro cell culture model. First, follicular cell samples from women undergoing in vitro fertilization treatment were obtained. We used a microarray to compare gene expression between patients that did not become pregnant following the in vitro fertilization cycle and those that did. We found that there is a different transcriptomic signature in patients who failed to conceive following in vitro fertilization. In addition, the analysis of the differentially expressed genes and the related biological pathways gave us more information on the physiological mechanisms potentially related to IVF failure, such as inflammatory imbalance, abnormal differentiation and increased apoptosis. For the next study, 135 follicular cell samples coming exclusively from patients who failed to conceive following in vitro fertilization (no pregnancy) were used. Genes related to different potential failure causes were analyzed using qRT-PCR and a hierarchical clustering analysis was then performed. The population of non-pregnant patients was divided into three groups, each one having a specific gene expression pattern related to a potential failure cause. The results of this study showed that it is possible to distinguish different failure causes or different follicular responses in patients whose cycle had failed. We finally used an in vitro model of human granulosa cells (KGN cell line) to see if pure granulosa cells were able to respond to different inflammatory stimuli. This preliminary study showed, through the expression of inflammation-related genes, that granulosa cells alone are able to create an inflammatory response and that this response differs depending on the type of stimulus. Taken together, the results of these studies improve the current knowledge and our understanding of in vitro fertilization failure. They also highlight the potential of gene expression to serve as a follicular response diagnostic tool. Finally, they also confirm the importance of inflammation and its control, particularly in the context of assisted reproductive technologies.

Ce mémoire s’intéresse au développement folliculaire chez la vache laitière et à l’effet du déficit énergétique sur le fonctionnement de cette structure ovarienne pendant la période post-partum. L’analyse des gènes exprimés dans les cellules folliculaires a permis l’identification de voies de signalisations et de molécules qui sont au cœur des changements observés dans le follicule. La première partie de ce projet porte sur la caractérisation des différents stades de croissance du follicule dominant chez le bovin. La seconde partie porte sur l’effet de l’ampleur du déficit énergétique sur le follicule à 60 jours post-partum, lors de la période critique du pic de lactation. Les résultats de ce projet sont d’un grand intérêt pour la recherche fondamentale sur la reproduction autant que pour la gestion pratique de la fertilité bovine, puisqu’ils éclaircissent certains aspects de la folliculogénèse et proposent des outils intéressants pour améliorer la fertilité de la vache laitière. / This master’s thesis focused on the follicular development in dairy cows and the effects of post-partum negative energy balance on the follicle. Analysis of genes’ transcription in follicular granulosa cells allowed the identification of several molecular pathways and upstream regulators having a great impact on follicular functions. The first part of this project aimed to characterise the different growth stages of dominant follicles in cattle (growth, plateau and atresia). The second part of this project evaluated the impact of the severity of negative energy balance on follicular functions at 60 days post-partum, during the lactation peak. The results provided are of great interest to fundamental reproduction science as well as to practical management of dairy cattle fertility. They shed light on several unknown aspects of folliculogenesis and offer interesting tools to improve post-partum fertility in dairy cattle.

Ce mémoire porte sur l’analyse de la croissance folliculaire dans l’ovaire chez la vache et l’humain. La transcription des gènes dans les cellules folliculaires indique quels mécanismes moléculaires sont modulés dans le follicule. Le premier volet de ce projet, chez le bovin, avait pour but de déterminer le profil transcriptomique des follicules de taille moyenne, entre 6 et 9 mm, appartenant à la phase de développement portant les ovocytes les plus compétents. Dans le deuxième volet, réalisé avec des tissus humains, l’impact de l’administration de hCG, une hormone pré-ovulatoire, a été évalué au niveau transcriptomique dans un cycle stimulé. Pour la première fois, des indicateurs géniques sont associés spécifiquement à trois phases clés du développement folliculaire, mais plus particulièrement à la phase plateau, ou atrésie précoce, correspondant à une compétence accrue des ovocytes à produire un embryon. Ces résultats apportent une contribution importante dans la définition des mécanismes moléculaires agissant dans le développement folliculaire. / This master’s thesis focused on the analysis of follicle growth in the ovary of both cows and humans. Genes’ transcription in follicular granulosa cells indicates which molecular mechanisms are modulated in the follicle. The first part of this project, in bovine, aimed to determine the transcriptomic profile of medium-sized follicles, between 6-9 mm, belonging to the follicular phase containing the most competent oocytes. In the human facet, the impact of hCG administration, a pre-ovulatory hormone, was evaluated at the transcriptomic level in a stimulated cycle. For the first time, genic indicators are specifically associated to three key phases of follicular development, especially the plateau phase, or early atresia, which correspond to an enhanced competence of the oocyte to produce an embryo. These results are an important step towards further defining the molecular mechanisms at work during follicular development, or folliculome.

Le développement des follicules, des ovocytes et des embryons sont des processus biologiques qui contrôlent la possibilité de devenir un organisme vivant. La maturation des ovocytes est un événement tout à fait unique avec deux divisions asymétriques, la méiose, mais également caractérisée par l'arrêt de la transcription et le stockage des transcrits et des protéines nécessaires au développement embryonnaire précoce. Comme nous le savons, le liquide folliculaire forme partie du micro environnement autour de l'ovocyte et influence la compétence de l'ovocyte. Cependant, la composition du liquide folliculaire peut changer sous divers statuts nutritionnels, tels que l'obésité chez l'homme et un bilan énergétique négatif chez les vaches et les truies. Ces modifications moléculaires du liquide folliculaire induites par les conditions métaboliques maternelles peuvent affecter la qualité des ovocytes, le développement embryonnaire et peuvent par la suite provoquer des troubles métaboliques et autres maladies chez les prochaines générations. Ces dernières années, de nouvelles études se sont concentrées sur les effets de contextes nutritionnels anormaux, p.ex., niveaux élevés d'acides gras non estérifiés (AGNE), sur les cellules de la granulosa, les cellules du cumulus, les ovocytes et le développement précoce de l'embryon chez diverses espèces, notamment chez l'homme, la souris et le bétail. Dans cette thèse, le porc a été utilisé comme modèle expérimental. Le porc est un excellent modèle pour étudier l'impact de la nutrition sur la fonction ovarienne chez l'homme, puisqu'il existe de nombreuses similitudes entre les porcs et l'homme telles que la physiologie digestive et la durée approximative de la maturation in vitro (IVM). En outre, les niveaux élevés d'AGNE induits par la nutrition existent également pendant la lactation chez les porcs. Enfin, les embryons de porc peuvent être générés in vitro et leur étude n'est pas soumise aux mêmes limitations éthiques que les humains. Pour mieux comprendre les effets de niveaux élevés d'AGNE au cours de la maturation des ovocytes chez le porc, des ovocytes porcins ont été exposés au milieu de maturation in vitro contenant une combinaison de niveaux élevés d'AGNE. Des puces à ADN ont été utilisées pour obtenir des informations globales sur les schémas transcriptomiques et de méthylation de l'ADN des blastocystes provenant des ovocytes exposés aux AGNE. Afin de mieux mimer un environnement folliculaire fonctionnel lors de la maturation, des ovocytes exposés aux AGNE ont été co-cultivés ou non avec des cellules de la granulosa porcine issues de follicules de taille moyenne (diamètre entre 3 et 5 mm). Pour capturer la réponse des cellules de la granulosa aux AGNE, les informations transcriptomiques des cellules de la granulosa co-cultivées ont également été étudiées. Le travail réalisé dans cette thèse nous a permis de mettre en évidence et d'expliquer les impacts de niveaux élevés d'AGNE folliculaires sur les blastocystes issus d'ovocytes exposés aux AGNE et les cellules de la granulosa co-cultivées. Les ovocytes exposés aux AGNE ont moins de potentiel de se développer en blastocystes, et les blastocystes dérivés ont montré une inflammation, plus d'apoptose, et des changements métaboliques des schémas transcriptomiques et de méthylation de l'ADN. La méthylation différente de l'ADN ouvre la possibilité de transmettre les impacts induits par les AGNE aux générations suivantes. Lorsque les voies affectées des blastocystes provenant d'ovocytes avec coculture de cellules de la granulosa ont été comparées à celles sans coculture, davantage de voies anti-inflammatoires ont été observées dans des conditions de coculture, suggérant le rôle protecteur des cellules de la granulosa dans la diminution des effets néfastes des AGNE sur les ovocytes. En examinant le transcriptome des cellules de la granulosa avec ou sans AGNE, nous avons observé que les cellules de la granulosa étaient capables d'atténuer les effets néfastes des AGNE sur les ovocytes par la régulation du métabolisme, des facteurs anti-inflammatoires et l'inhibition de la transition épithéliale-mésenchymateuse. Le dernier chapitre résume le métabolisme des acides gras dans les ovocytes, les cellules folliculaires et les embryons, et traite également des effets néfastes de l'exposition aux AGNE pendant la maturation in vitro sur les ovocytes, les cellules folliculaires et les embryons. Les informations dérivées des résultats mettent en évidence les effets néfastes des niveaux élevés d'AGNE dans le liquide folliculaire induits par l'état nutritionnel maternelle avec un aperçu global des schémas transcriptomiques et de méthylation de l'ADN chez les porcs. Ensuite, le rôle des cellules de la granulosa dans la protection des ovocytes envers l'environnement défavorable des acides gras en excès est proposé. Les connaissances acquises donnent une idée du métabolisme du niveau élevé d'acides gras dans les follicules et suggèrent l'importance d'une concentration appropriée d'acide gras pendant la folliculogenèse et la maturation des ovocytes. / The development of follicles, oocytes, and embryos are the biological processes that control the possibility to become a living organism. The oocyte maturation is a quite unique event with two asymmetric cleavages, the meiosis, but also characterized by the arrest of transcription and the storage of transcripts and proteins required for early embryonic development. As we know, the follicular fluid is part of the microenvironment surrounding the oocyte and influences the oocyte competence. However, the composition of follicular fluid may change under various nutrition statuses, such as obesity in humans and negative energy balance in cows and sows. These maternal metabolic conditions induce follicular fluid changes may affect oocyte quality, embryonic development, and subsequently cause metabolic problems and diseases in the next generations. In recent years, new studies focused on the effects of abnormal nutrition contexts, e.g., elevated levels of non-esterified fatty acids (NEFAs), on granulosa cells, cumulus cells, oocytes, and early embryo development in various species including humans, mice, and cattle. In this thesis, the pig was used as the experimental model. The pig is an excellent model to study the impacts of nutrition on human ovarian function since there are many similarities between pigs and humans, such as digestive physiology and approximate length of in vitro maturation (IVM). Besides, the nutrition-induced elevated levels of NEFA also exist during the lactation in pigs. Finally, porcine embryos can be generated in vitro and are not subjected to the same ethical limitations as human embryos. To better understand the effects of elevated levels of NEFAs during oocyte maturation in pigs, porcine oocytes were exposed to an in vitro maturation medium containing a combination of high level of NEFAs. Microarrays were used to draw global information of the transcriptomic and DNA methylation patterns of blastocysts originated from NEFAs' exposed oocytes. To better mimic a functional follicular environment during maturation, oocytes exposed to NEFAs were co-cultured or not with porcine granulosa cells from medium size follicles (diameter between 3 and 5 mm). To capture the response of granulosa cells to NEFAs, the transcriptomic information of the cocultured granulosa cells was also investigated. The work completed in this thesis allowed us to highlight and explain the impacts of elevated levels of follicular NEFAs on the blastocysts originated from NEFAs-exposed oocytes and the cocultured granulosa cells. NEFAs-exposed oocytes have less potential to develop into blastocysts, and the derived blastocysts showed inflammation, more apoptosis, and metabolic changes both in transcriptomic and DNA methylation patterns. The altered DNA methylation opens the possibility of transmitting the NEFAs-induced impacts to subsequent generations. When the affected pathways of blastocysts originated from oocytes cocultured with granulosa cells were compared to those without coculture, more anti-inflammatory pathways were observed in coculture condition, suggesting the protective role of granulosa cells in decreasing the detrimental effects of NEFAs on oocytes. Looking at the granulosa cell transcriptome with or without NEFAs, we observed that the granulosa cells were able to attenuate the adverse effects of NEFAs on oocytes through regulation of metabolism, anti-inflammatory factors, and inhibition of the epithelial-mesenchymal transition. The last chapter summarizes the metabolism of fatty acids in oocytes, follicular cells, and embryos, and also discusses the adverse impacts of exposure to NEFAs during IVM on oocytes, follicular cells, and embryos. The information derived from the results highlights the detrimental impacts of maternal nutrition-induced elevated NEFAs levels in follicular fluid with a global overview of the transcriptomic and DNA methylation patterns in pigs. Then the role of granulosa cells in protecting the oocytes from the adverse environment of excess fatty acids is proposed. The acquired knowledge provides the idea about the metabolism of the high level of fatty acids in follicles and suggests the importance of a suitable concentration of fatty acids during folliculogenesis and oocyte maturation.

La membrane est aujourd'hui perçue comme une mosaïque de micro-domaines membranaires, ou « lipid rafts ». Ces domaines sont moins fluides que le reste de la membrane, car ils sont enrichis en cholestérol et en sphingolipides à longues chaînes saturées. Ils comportent peu de protéines, mais plusieurs de celles-ci sont impliquées dans la signalisation cellulaire. C'est pour cette raison que les « rafts » sont considérés comme des plates-formes de signalisation cellulaire. Les investigations réalisées sur les « rafts » au niveau des gamètes femelles ont essentiellement été pratiquées sur les œufs de Xenopus, mais chez les mammifères presque rien n'a encore été démontré quant à la présence et surtout à la fonctionnalité des « rafts » dans les ovocytes et autres cellules du follicule ovarien. Ce mémoire présente une étude des « lipid rafts » des ovocytes, des cellules de la granulosa et des complexes ovocyte-cumulus porcins. / Nowadays, plasma membrane is perceived as a mosaic of micro-domains called lipid rafts. Because of their enrichment in cholesterol and sphingolipids, these domains are less fluid than the bulk membrane. Only a few proteins partition into lipid rafts, but most of these are implicated in cell signalling. For this reason, lipid rafts are considered as platforms for cell signalling. Most of the investigations performed on female gametes were realised on Xenopus eggs, but not much as been done yet to assess the presence and especially the functionality of lipid rafts of the oocytes and other cell types of the mammalian ovarian follicle. The present study investigates the presence and the functionality of lipid rafts in porcine oocytes, granulosa cells and cumulus-oocyte complex.

L’objet de ce travail a été d’étudier la relation entre la différenciation folliculaire et la compétence ovocytaire chez deux espèces mono-ovulantes, la vache et la femme. Dans un premier temps, un model bovin d’augmentation et de diminution de la compétence en termes de taux de blastocyste a été développé. Il a permis de déterminer la meilleure période pour la ponction ovocytaire suite à une superstimulation ovarienne avec FSH et de montrer que la taille folliculaire n’est pas toujours positivement corrélée avec la compétence au développement de l’ovocyte. Grâce au modèle développé, la différenciation des cellules de granulosa en période d’augmentation puis de diminution de la compétence a été étudiée. Au cours de la différenciation, l’expression génique est associée à la croissance folliculaire impliquant la matrice extracellulaire et l’angiogenèse, à l’hypoxie, à l’apoptose et à l’inflammation. Ce modèle est aussi caractérisé par la présence de LH basal. Afin de mieux comprendre son impact sur le follicule, ce même modèle a été utilisé mais en présence d’un inhibiteur de GnRH. L’absence de LH basal affecte négativement la croissance folliculaire. Il induit l’augmentation de l’expression de transcrits associés à l’apoptose au niveau des cellules de granulosa et aussi la diminution d’autres associés à l’augmentation de la compétence dans ce modèle. Le transcriptome de cellules de granulosa humaines issues de cycles de superstimulation a été ensuite analysé en fonction du volume de leur follicule d’origine et du devenir de l’ovocyte en termes de transférabilité de l’embryon obtenu. La relation entre la taille folliculaire et la compétence de l’ovocyte identifiée chez la vache, se vérifierait chez la femme. De plus, des marqueurs transcriptomiques de bons follicules de taille moyenne, également associés a à la compétence chez la vache, ont été identifiés. Finalement, afin de mesurer l’impact transcriptomique de FSH, au niveau du follicule, une étude à large échelle dans un modèle de culture de cellules de granulosa in vitro a été effectuée avec des follicules d’ovaires bovins. Ce projet apporte des connaissances fondamentales sur la physiologie et la transcriptomique des cellules de granulosa en relation avec la compétence ovocytaire, et ouvre la voie à des applications cliniques chez la vache et la femme. / The purpose of this work was to study the relation between follicular differentiation and the developmental competence of the oocyte in two mono-ovulating species, in cows and in women. As a first step, a bovine model including the competence increase and decrease in terms of blastocyst rates was developed. It permitted to identify the best temporal window for oocyte recovery following FSH ovarian superstimulation, and to show that follicular size is not always positively correlated with oocyte developmental competence. Following the development of the model, the granulosa cell differentiation during the competence increase and then decrease was studied. During differentiation of granulosa cells, gene expression is associated with follicular growth, implying the extracellular matrix and angiogenesis, with hypoxia, apoptosis and inflammation. This model is also characterized by basal LH. In order to better understand its impact on the follicle, this model was used in presence of a GnRH inhibitor. The lack of basal LH negatively affects follicular growth. It induced an increase in expression of transcripts associated to apoptosis in granulosa cells and also the decrease of expression of other transcripts associated to increasing oocyte developmental competence in this model. The human granulosa cell transcriptome from superstimulation cycles was then analyzed according to the volume of their follicle of origin, and the transferability of the embryo obtained following the fertilization of the enclosed oocyte. The relation between follicular size and oocyte developmental competence identified in cows seems to apply also to women. Furthermore, some transcriptomic markers of good medium size follicles, also associated to developmental competence in cows, were identified. Finally, in order to evaluate the FSH transcriptomic impact at the follicular level, a large scale analysis with an in vitro bovine granulosa cell culture model was developed. This project provides basic science knowledge on the physiology and the granulosa cells transcriptome according to oocyte developmental competence, and opens the way to clinical applications in cows and in women.

Lors de traitement de fertilité chez l’humain, l’efficacité de la sélection embryonnaire reste faible, puisque les méthodes d’évaluation basées sur la morphologie embryonnaire comportent de sérieuses limitations. Afin d’améliorer les taux de grossesse, il est dans la norme de transférer plus d’un embryon chez une patiente, augmentant les probabilités de grossesses multiples qui sont associées à des risques plus élevés pour la santé de la mère et des enfants à naître. Ainsi, il est essentiel de développer une méthode efficace de sélection embryonnaire afin d’atteindre des meilleurs taux de grossesse tout en transférant un seul embryon. Puisqu’une étroite communication s’établie entre les cellules folliculaires (CFs) et l’ovocyte durant la maturation folliculaire et que cette relation est essentielle afin de produire un ovocyte possédant toutes les compétences nécessaires à donner une grossesse, des marqueurs associés à cette compétence pourraient être identifiés dans ces CFs. Dans cette étude, nous avons identifié 10 marqueurs folliculaires potentiels associés à la compétence du follicule à mener à une grossesse. Ces marqueurs proviennent de cellules folliculaires et seraient un portrait de la compétence de l’ovule à se développer en un embryon et à produire une grossesse à terme. Cinq candidats, 3βHSD1, FDX1, SERPINE2, CYP19A et CDC42 ont été significativement plus exprimés dans les groupes d’échantillons provenant de CFs associées à un embryon ayant donné une grossesse comparé aux CFs associées à un embryon non transféré ayant eu des difficultés au niveau de son développement. Chez des patientes ayant produit à la fois un embryon ayant donné une grossesse et un embryon ayant eu des difficultés de développement, nous avons identifié quatre marqueurs, soit PGK1, RGS2, RGS3 et encore CDC42 associés à un résultat de grossesse. Un modèle de prédiction a aussi été développé à partir de l’expression des gènes PGK1 et RGS2. Enfin, quatre marqueurs, soit PHLDA1, UGP2 ainsi que les candidats déjà identifiés PGK1 et CDC42 ont été associés à des grossesses dans les embryons dont l’évaluation morphologique avait permis un transfert embryonnaire ayant mené ou non à une grossesse. La plupart des gènes candidats identifiés peuvent être reliés au mécanisme de lutéinisation des cellules de granulosa. L’identification de marqueurs associés à la compétence folliculaire à se développer en une progéniture viable ouvre la voie à une possible application dans les centres de fertilité afin d’améliorer la sélection embryonnaire en procréation assistée. Le développement d’un modèle de prédiction basé sur l’expression des gènes provenant de FCs ainsi que sur l’évaluation morphologique embryonnaire pourrait être utile afin de sélectionner chez une même patiente l’embryon qui semble le plus prometteur à donner une grossesse. / Embryo selection efficiency for single embryo transfer in human fertility treatment is still impaired by low pregnancy rates because evaluation methods based on embryo morphology for predicting embryo quality have significant limitations. To overcome this situation, usually more than one embryo are transferred in patient, leading to high risk of multiple pregnancies associated with important health risk to both mother and child. Therefore, the development of an accurate method to select high quality embryos is essential to achieve high pregnancy rates with single embryo transfer. Tight communication exists between the follicular cells (FCs) and the oocyte during follicle maturation to achieve developmental competence. In this way, markers in the surrounding FCs could determine oocyte developmental competence. In this work, we have identified 10 potential FCs markers involved in oocyte developmental competence. Five markers, 3βHSD1, FDX1, SERPINE2, CYP19A and CDC42 were significantly more expressed in pooled samples of FCs associated to an embryo leading to a pregnancy compared to FCs from embryos with failure in their development. In individual patients presenting both embryo with pregnancy results and embryo with failure in its development, we have identified four markers, PGK1, RGS2, RGS3 and again CDC42 associated to pregnancy results. The best predictors for ongoing pregnancy were PGK1 and RGS2. Finally, four markers, PHLDA1, UGP2 and again PGK1 and CDC42 were associated to pregnancy outcome in FCs related to follicles associated with good morphological transferred embryos with or without pregnancy results. Most of these markers could be related to granulosa luteinisation process. The identification of these markers of follicular competence paves the way on a possible application in fertility clinic in order to improve embryo selection in human assisted reproduction. The development of a predictive model based on FCs gene expression and embryo morphology evaluation could be useful to select in a same patient the most promising embryo to give a pregnancy.

Les homéoprotéines sont des régulateurs transcriptionnels impliqués dans le développement, l'embryogenèse et la différenciation cellulaire chez plusieurs espèces. Les homéoprotéines sont les produits des homéogènes et elles sont exprimées dans une pléiade de tissus au cours du développement. Dans le but d'approfondir nos connaissances sur les contrôles transcriptionnels qui régissent le développement et la différenciation des organes reproducteurs, je me suis intéressée à l'expression des homéoprotéines dans les cellules de Leydig dû à l'importance de ces facteurs dans les processus développementaux. Nous avons nouvellement identifiés dans les cellules de Leydig, le gène Lbx2 et l'homéoprotéine PBX1. Il n'existe actuellement pas de données sur l'expression de ces gènes au cours de la différenciation du système reproducteur et ce faisant des cellules de Leydig. Cette thèse présente donc l'expression de Lbx2 et PBX1 au cours de la différenciation du système reproducteur dans le testicule, l'épididyme, l'ovaire et les cellules de Leydig. J'ai précisé le profil d'expression du gène Lbx2 au cours du développement testiculaire, épididymaire et ovarien. J'ai déterminé que les transcrits de Lbx2 sont présents durant le développement du testicule, de l'épididyme et de l'ovaire. De plus, mes analyses révèlent également que Lbx2 est un gène dont l'expression est sexuellement dimorphique dans les gonades embryonnaires. L'élaboration du profil d'expression de la protéine PBX1 révèle qu'elle est présente au cours du développement testiculaire et durant la vie adulte. Dans les cellules de Leydig, mes résultats démontrent que PBX1 est principalement exprimée à la puberté. L'expression de PBX1 est plus forte dans les cellules de Sertoli chez l'adulte et dans les cellules myoïdes péritubulaires au cours du développement embryonnaire et postnatal. Les travaux présents dans cette thèse auront également permis d'identifier d'autres nouvelles homéoprotéines, PRRX2, GBX1, MEIS1, PREP1 exprimées dans les organes reproducteurs. Ainsi, la caractérisation du profil d'expression des homéoprotéines au cours du développement du système reproducteur aura permis d'identifier de potentiels régulateurs transcriptionnels du développement et de la différenciation du système reproducteur.

Au cours des dernières décennies, les stratégies de reproduction chez la vache ont été progressivement améliorées grâce au développement des techniques de reproduction assistées. L’intégration de la sélection génomique à la stimulation ovarienne et du transfert d’embryons a considérablement amplifié le taux de reproduction des animaux et le gain génétique chez la vache laitière. L’utilisation de jeunes donneuses d’ovocytes dans les programmes de sélection génomique est aussi une méthode efficace afin d’accélérer les gains génétiques en diminuant le temps entre les générations. Même si les techniques de reproduction assistées utilisées chez les vaches adultes sont possibles chez les génisses prépubères sans aucun effet néfaste, la compétence au développement des ovocytes est significativement plus faible. De plus, la variabilité individuelle chez les donneuses en réponse au traitement hormonal demeure élevée. L’hypothèse de cette thèse stipule que le patron d’expression des gènes des cellules de la granulosa est associé avec les performances reproductives et le statut de différenciation du follicule chez les vaches ayant suivi une stimulation ovarienne. Des génisses et vaches laitières âgées de 5 mois jusqu’à 9 ans ont suivi un protocole de stimulation ovarienne avec une période de coasting de 19, 30, 44 ou 54 h dans un environnement commercial contrôlé. Les ovocytes collectés ont été fécondés in vitro et les cellules de la granulosa aspirées lors de la récolte ont été purifiées et congelées à -80 °C avant l’extraction de l’ARN pour chaque animal individuel. Au cours de nos travaux, nous avons identifié l’âge (5 à 10 mois) à laquelle les ovocytes des génisses sont significativement moins compétents que les vaches sexuellement matures. Nous avons aussi observé une grande variabilité dans la compétence développementale des ovocytes chez les vaches à la suite de la stimulation ovarienne et du coasting. Les analyses de l’expression des gènes des cellules de la granulosa ont été faites avec des micropuces à ADN en utilisant différents contrastes dans le but d’explorer les voies géniques associées avec les bonnes et les mauvaises donneuses d’ovocytes ou en fonction de l’âge des donneuses d’ovocytes. Tout d’abord, la variabilité interindividuelle au traitement ovarien semble être principalement associée au degré de maturité ou de différenciation du follicule lors de la récolte des ovocytes, ce qui explique les différences de compétence au développement des ovocytes de chacun des animaux étudiés. De plus, nous avons observé des signes de déficience nutritionnelle chez les animaux grâce au niveau de l’expression des gènes dans les cellules de la granulosa des donneuses d’ovocytes incompétents ce qui peut associer en partie la variabilité interindividuelle et l’alimentation des animaux. Grâce à l’utilisation de la méta-analyse, nous avons créé un plan de l’expression des gènes des cellules de la granulosa suivant le déclin ou le retrait de FSH. De plus, nous avons identifié des biomarqueurs spécifiques afin d’évaluer le degré de différenciation des follicules lors de la stimulation ovarienne. Finalement, nos recherches ont permis de démontrer une expression aberrante des gènes associés avec une concentration basale de l’hormone lutéinisante (LH) chez les donneuses d’ovocyte prépubères. De plus, nous avons démontré une plus grande expression de biomarqueurs de l’atrésie folliculaire chez les jeunes donneuses, ce qui suggère que les follicules entrent en atrésie plus rapidement chez les génisses lors du coasting, probablement due à une insuffisance du niveau de LH basale. Pour conclure, nos résultats vont fournir à l’industrie un outil diagnostique qui va permettre d’évaluer le statut folliculaire lors de la récolte des ovocytes dans le but d’ajuster la prochaine stimulation ovarienne. Nous présentons un nouveau concept, la capacitation du follicule, qui fait référence à la période après le déclin ou de retrait de la FSH dans laquelle le follicule prépare sa machinerie moléculaire pour le pic de LH et l’ovulation. Les résultats de cette thèse améliorent nos connaissances fondamentales de l’expression des gènes des cellules de la granulosa lors de la période d’acquisition de la compétence développementale de l’ovocyte chez le bovin / In the past few decades, the reproductive strategies in bovine have been drastically improved by the development of assisted reproductive technologies. The incorporation of embryo transfer and ovarian stimulation to genomic selection has considerably increased the reproduction rate of high genetic merit animals and the genetic gain in dairy cattle. The use of oocytes from younger donors in such programs is a great opportunity to accelerate the genetic gain by compressing the time between generations. Although the use of the same assisted reproductive technologies applied to sexually mature cows is possible in prepubertal heifers without any detrimental effect on subsequent reproductive performance, their oocyte developmental competence is significantly lower. Moreover, the variability associated to the ovarian treatment remains high in both pre- and post-pubertal animals. In this thesis we hypothesize that the gene expression patterns in granulosa cell is associated with subsequent reproductive performance after ovarian stimulation in cattle and provide information about the follicle differentiation status. A large number of Holstein heifers and cows aged from 5 months to 9 years of age underwent ovarian stimulation followed by a coasting period of 19, 30, 44 or 54h in a controlled commercial environment. Collected oocytes were fertilized in vitro and granulosa cells from the aspiration media were collected, purified and keep at -80 oC before RNA extraction for each animal. In this thesis we identified that oocytes from animal aged between 5 and 10 months of age yielded fewer blastocysts compared to sexually mature animals. We also reported a high variability in oocyte developmental competence associated to the animal following ovarian stimulation and coasting. The transcriptomes of granulosa cells recovered with the oocytes were analyzed using microarrays in different contrasts to explore the gene expression associated with donors of low oocyte competence compared to the donors of good oocyte competence or with donors from different ages. To begin with, inter-individual variability is mainly associated to the difference in follicle maturity at the time of oocyte collection and could explain differences in oocyte developmental competence in individual animals. Moreover, the nutritional deficiency signs have been shown in granulosa cells from donors of incompetent oocytes and from younger donors. By using meta-analysis, we were able to create a blueprint of the follicle gene expression following FSH decline in granulosa cells and to identify specific biomarkers to assess the follicle status and to create the tools in order to identify the degree of differentiation in follicle following ovarian stimulation and coasting. Finally, we discovered the multiple traits associated with basal concentration of luteinising hormone are more apparent in prepubertal donors. We also showed a higher expression of biomarkers of follicle atresia in younger donors, suggesting that follicle atresia occur more rapidly during coasting, resulting in lower oocyte developmental due to a possible insufficiency in basal LH in prepubertal donors. In conclusion, this thesis has provided important information to assess a follicle differentiation diagnosis in order to adjust the next ovarian stimulation and coasting. We defined the unique period following FSH decline and withdrawal as ‘follicle capacitation’ which refers to the functional changes occurring within the follicle to prepare its molecular machinery for the LH surge and ovulation. The results from this thesis will improve our understanding of the granulosa cells gene expression during the period of oocyte developmental competence acquisition in bovine