Thesis addresses the physiological role of formyl tetrahydrofolate synthetase (Fhs) and bifunctional folate dehydrogenase (FolD) in folate mediated one carbon metabolism in bacteria. Thesis consists of 5 chapters. First chapter provides the details of the literature on folate metabolism, enzymes involved the synthesis and physiological roles various folate co-factors. Second chapter discusses the study of Clostridium perfringens Fhs generation of folD deletion in the support of fhs. Third chapter explores the characterization of the folD deletion strain. Fourth chapter presents the characterization of monofunctional versions of FolD from Clostridium perfringens. Fifth chapters talks about anti-correlation existence of Fhs and PurT (phosphoribosyl glycinamide formyl transferase II) The detailed experimental study is discussed below i. Characterization of Clostridium perfringens Formyl Tetrahydrofolate Synthetase (Fhs) In this chapter we have characterized Fhs from pathogenic Clostridium perfringens. Fhs catalyzes the formation of N10-formyl THF from THF and formate. Previously Fhs has been characterized from various non-pathogenic species of Clostridium. In addition, the detailed kinetic parameters are not known. In this report we have characterized the Fhs Clostridium perfringens and detailed kinetic parameters were determined. We have also shown the biological function by rescue of UV photorepair sensitive strain. ii. One-carbon metabolic pathway rewiring in Escherichia coli reveals an evolutionary advantage of 10-formyltetrahydrofolate synthetase (Fhs) in survival under hypoxia In cells, N10-formyltetrahydrofolate (N10-formyl THF) required for formylation of eubacterial/organeller initiator tRNA and purine biosynthesis is produced by methylene- tetrahydrofolate dehydrogenase/cyclohydrolase (FolD) and/or 10-formyltetrahydrofolate synthetase (Fhs). folD is present in all organisms, where as fhs shows mixed distribution. We show that in E. coli, which naturally lacks fhs, essential function of folD could be replaced with fhs of Clostridium perfringens when provided on a medium copy plasmid or integrated as single copy gene in the chromosome of the ∆folD strains, for their growth in a complex medium. However, these strains require purines and glycine as supplements for growth in M9 minimal medium. The in vivo levels of N10-formyl THF in the ∆folD strains (harboring fhs) were limiting despite their high enzymatic capacity to synthesize the same. Auxotrophy for purines could be alleviated by adding formate to the medium, and that for glycine by engineering THF import into the cells. The ∆folD strains showed high NADP+/NADPH ratio and were hypersensitive to trimethoprim (TMP). Further, the presence of fhs was disadvantageous to E. coli under aerobic growth. However, under hypoxia, E. coli strains harboring fhs outcompeted those lacking it. And, the computational analysis revealed a predominant natural occurrence of fhs in anaerobic and facultative anaerobic bacteria. We also propose that inhibitors aimed at folD could potentiate the effect TMP drugs. iii. 5, 10-methylene-THF dehydrogenase (DH) and 5, 10-methenyl-THF cyclohydrolase (CH) activities of FolD are essential to maintain folate homeostasis and anti-folate resistance While E. coli and many other organisms have folD alone or folD and fhs, Clostridium species possess an annotated bi-functional FolD and an annotated methenyl tetrahydrofolate cyclohydrolase (FchA). Simultaneous presence of 3 enzymes for the synthesis of N10-formyl THF was intriguing. To understand this unusual feature we have cloned Clostridium perfringens CpeFolD and CpeFchA, over expressed and purified to near homogeneity. Biochemical analyses revealed that CpeFolD possess only dehydrogenase activity as opposed to in silico prediction, while CpeFchA possess cyclohydrolase activity as expected. We also show that expression of both proteins together allowed folD deletion in E. coli. From this study we found that presence of dehydrogenase and cyclohydrolase functions are very important in the maintenance of folate homeostasis and anti-folate resistance. iv. Analysis of distribution of fhs and purT genes in the organisms While analysing distribution of fhs across genomes, serendipitously we also found that large number of organism which have fhs lack purT(phosphoribosyl glycinamide formyl transferase II), in short where ever purT was present fhs was absent. This kind of anti-correlation was strictly conserved in Bacillus genes as well. Growth competition experiments were done to address anti-correlation between fhs and purT. Growth competition experiments revealed that simultaneous presence of both purT and fhs is disadvantageous, when compared to presence of either one gene.

The Maillard reaction products (MRPs) 3-deoxyglucosone (3-DG) and 5-hydroxymethylfurfural (HMF), which are formed during the thermal processing and storage of food, come into contact with technologically used yeasts during the fermentation of beer and wine. In order for the yeast cells to work efficiently, handling of the stress-inducing carbonyl compounds is essential. In the present study, the utilization of 3-DG and HMF by 13 Saccharomyces yeast strains (7 brewer’s yeast strains, 1 wine yeast strain, 6 yeast strains isolated from natural habitats) was investigated. All yeast strains studied were able to metabolize 3-DG and HMF. 3-DG is mainly reduced to 3-deoxyfructose (3-DF) and HMF is completely converted to 2,5-bishydroxymethylfuran (BHMF) and 5-formyl-2-furancarboxylic acid (FFCA). The ratio of conversion of HMF to BHMF and FFCA was found to be yeast strain-specific and no differences in the HMF stress tolerance of the yeast strains and species were observed. After incubation with 3-DG, varying amounts of intra- and extracellular 3-DF were found, pointing to a faster transport of 3-DG into the cells in the case of brewer’s yeast strains. Furthermore, the brewer’s yeast strains showed a significantly higher 3-DG stress resistance than the investigated yeast strains isolated from natural habitats. Thus, it can be shown for the first time that Saccharomyces yeast strains differ in their interaction of 3-DG induced carbonyl stress.

Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung der kationisch initiierten Oligomerisation von N-Vinylformamid mit Iod, Brom, Trifluormethansulfonsäure und Trifluormethansulfonsäure-trimethylsilylester. Quantenchemische Berechnungen zur Konformation und zur Elektronendichteverteilung von N-Vinylformamid, sowie zu seiner Reaktion mit Elektrophilen werden vorgestellt. Die Struktur der erhaltenen Oligomere wird mittels 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie, MALDI-TOF-MS, GPC, IR-Spektroskopie, Thermogravimetrie und quantitativer Elementaranalyse untersucht. Die Abhängigkeit von Ausbeute, mittleren Polymerisationsgrad und Kopfgruppenfunktionalität der erhaltenen Oligo(N-vinylformamide) vom Initiator, sowie von der Polarität des Lösemittels, dem eingesetzten Monomer/Initiator-Verhältnis und der Reaktionstemperatur wird vorgestellt. Im Vergleich zum N-Vinylformamid werden N-Vinylacetamid, N-Methyl-N-vinylformamid, N-Methyl-N-vinylacetamid und N-Vinylpyrrolidon auf ihre Fähigkeit untersucht, mit Initiatoren der kationischen Polymerisation Oligomere zu bilden. Mit N-Deutero-N-vinylformamid als Monomer und der 2H-NMR-Analyse der erhaltenen Oligomere wird der Einfluß der NH-Eliminierung während der Oligomerisation von N-Vinylformamid untersucht. Ausgehend von den experimentellen Ergebnissen wird ein für die Vinylpolymerisation neuer Mechanismus für die Oligomerisation von N-Vinylformamid vorgeschlagen und diskutiert. / The topic of the dissertation is the survey of the cationically initiated oligomerization of N-vinylformamide with iodine, bromine, trifluoromethanesulfonic acid, and trifluoromethanesulfonic acid trimethylsilylester as initiators. Quantum chemical calculations on the conformation and the electron density of N-vinylformamide, as well as on its reaction with electrophiles are presented. The structure of the obtained oligomers is investigated with 1H- and 13C NMR spectroscopy, MALDI-TOF-MS, GPC, IR spectroscopy, thermal decomposition, and quantitative combustion analysis. The influence of the polarity of the solvent, of the initiator, of the reaction temperature, and of the monomer/initiator ratio on yield, degree of polymerization, head group functionality, and chain structures of the obtained oligo(N-vinylformamide) is investigated. In comparison with N-vinylformamide, the ability of N-vinylacetamide, N-methyl-N-vinylformamide, N-methyl-N-vinylacetamide, and N-vinylpyrrolidone in undergoing a cationically induced polymerization to oligomeric products is investigated. The influence of the NH-elimination on the oligomerization process is investigated with N-deutero-N-vinylformamide as monomer and the 2H NMR analysis of the obtained oligomers. From the results, a new mechanism for the oligomerization of N-vinylformamide is proposed and discussed.

Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung der kationisch initiierten Oligomerisation von N-Vinylformamid mit Iod, Brom, Trifluormethansulfonsäure und Trifluormethansulfonsäure-trimethylsilylester. Quantenchemische Berechnungen zur Konformation und zur Elektronendichteverteilung von N-Vinylformamid, sowie zu seiner Reaktion mit Elektrophilen werden vorgestellt. Die Struktur der erhaltenen Oligomere wird mittels 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie, MALDI-TOF-MS, GPC, IR-Spektroskopie, Thermogravimetrie und quantitativer Elementaranalyse untersucht. Die Abhängigkeit von Ausbeute, mittleren Polymerisationsgrad und Kopfgruppenfunktionalität der erhaltenen Oligo(N-vinylformamide) vom Initiator, sowie von der Polarität des Lösemittels, dem eingesetzten Monomer/Initiator-Verhältnis und der Reaktionstemperatur wird vorgestellt. Im Vergleich zum N-Vinylformamid werden N-Vinylacetamid, N-Methyl-N-vinylformamid, N-Methyl-N-vinylacetamid und N-Vinylpyrrolidon auf ihre Fähigkeit untersucht, mit Initiatoren der kationischen Polymerisation Oligomere zu bilden. Mit N-Deutero-N-vinylformamid als Monomer und der 2H-NMR-Analyse der erhaltenen Oligomere wird der Einfluß der NH-Eliminierung während der Oligomerisation von N-Vinylformamid untersucht. Ausgehend von den experimentellen Ergebnissen wird ein für die Vinylpolymerisation neuer Mechanismus für die Oligomerisation von N-Vinylformamid vorgeschlagen und diskutiert. / The topic of the dissertation is the survey of the cationically initiated oligomerization of N-vinylformamide with iodine, bromine, trifluoromethanesulfonic acid, and trifluoromethanesulfonic acid trimethylsilylester as initiators. Quantum chemical calculations on the conformation and the electron density of N-vinylformamide, as well as on its reaction with electrophiles are presented. The structure of the obtained oligomers is investigated with 1H- and 13C NMR spectroscopy, MALDI-TOF-MS, GPC, IR spectroscopy, thermal decomposition, and quantitative combustion analysis. The influence of the polarity of the solvent, of the initiator, of the reaction temperature, and of the monomer/initiator ratio on yield, degree of polymerization, head group functionality, and chain structures of the obtained oligo(N-vinylformamide) is investigated. In comparison with N-vinylformamide, the ability of N-vinylacetamide, N-methyl-N-vinylformamide, N-methyl-N-vinylacetamide, and N-vinylpyrrolidone in undergoing a cationically induced polymerization to oligomeric products is investigated. The influence of the NH-elimination on the oligomerization process is investigated with N-deutero-N-vinylformamide as monomer and the 2H NMR analysis of the obtained oligomers. From the results, a new mechanism for the oligomerization of N-vinylformamide is proposed and discussed.

Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Synthese von α-Azidoalkoholen durch die Reaktion von aliphatischen sowie aromatischen Aldehyden mit Stickstoffwasserstoffsäure. Dabei stellt sich ein Gleichgewicht ein, dessen Lage durch die Ermittlung der Gleichgewichtskonstanten quantitativ bestimmt wird. In jedem Fall besteht die Möglichkeit, den α-Azidoalkohol in der Gleichgewichtsmischung zu charakterisieren und teilweise gelingt die Isolierung der reinen α-Azidoalkohole bei tiefen Temperaturen sowie deren Charakterisierung mittels Tieftemperatur-NMR-Spektroskopie. Die Ausgangsaldehyde für die Synthese der α-Azidoalkohole besitzen elektronenschiebende oder elektronenziehende Substituenten oder sind prochiral oder besitzen funktionelle Gruppe für intramolekulare Reaktionen. Die Titelverbindungen werden mit Cyclooctin im Sinne einer 1,3-dipolaren Cycloaddition abgefangen oder mit Carbonsäurechloriden in die entsprechenden Ester der α-Azidoalkohole überführt. Das nur aus theoretischen Arbeiten bekannte Formylazid wird erstmals aus den α-Azidoalkoholen durch Oxidation hergestellt und in Lösung vollständig charakterisiert. Es werden zudem zahlreiche Alternativsynthesen für Formylazid erfolgreich durchgeführt.

Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Synthese von α-Azidoalkoholen durch die Reaktion von aliphatischen sowie aromatischen Aldehyden mit Stickstoffwasserstoffsäure. Dabei stellt sich ein Gleichgewicht ein, dessen Lage durch die Ermittlung der Gleichgewichtskonstanten quantitativ bestimmt wird. In jedem Fall besteht die Möglichkeit, den α-Azidoalkohol in der Gleichgewichtsmischung zu charakterisieren und teilweise gelingt die Isolierung der reinen α-Azidoalkohole bei tiefen Temperaturen sowie deren Charakterisierung mittels Tieftemperatur-NMR-Spektroskopie. Die Ausgangsaldehyde für die Synthese der α-Azidoalkohole besitzen elektronenschiebende oder elektronenziehende Substituenten oder sind prochiral oder besitzen funktionelle Gruppe für intramolekulare Reaktionen. Die Titelverbindungen werden mit Cyclooctin im Sinne einer 1,3-dipolaren Cycloaddition abgefangen oder mit Carbonsäurechloriden in die entsprechenden Ester der α-Azidoalkohole überführt. Das nur aus theoretischen Arbeiten bekannte Formylazid wird erstmals aus den α-Azidoalkoholen durch Oxidation hergestellt und in Lösung vollständig charakterisiert. Es werden zudem zahlreiche Alternativsynthesen für Formylazid erfolgreich durchgeführt.