A deficiência da desidrogenase de acil-CoA de cadeia média (MCAD) é o mais frequente defeito de oxidação de ácidos graxos, caracterizado bioquimicamente pelo acúmulo tecidual predominante dos ácidos graxos de cadeia média octanoato (AO), decanoato (AD) e cis-4-decenoato (AcD). Embora os sinais clínicos dos afetados sejam fundamentalmente neurológicos, os mecanismos fisiopatológicos do dano do sistema nervoso central apresentado pelos pacientes afetados por esse distúrbio ainda não estão esclarecidos. Tem sido, no entanto, levantada a hipótese de que os ácidos graxos acumulados nesta doença possam exercer efeitos tóxicos. Neste cenário, o objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos in vitro dos ácidos AO, AD e AcD sobre parâmetros de função mitocondrial e de estresse oxidativo em cérebro de ratos de 30 dias de vida, uma vez que o metabolismo energético é muito ativo e as defesas antioxidantes estão diminuídas neste tecido. Inicialmente, observamos que todos os ácidos graxos testados dimuíram o potencial de membrana mitocondrial em preparações mitocondriais de cérebro de ratos, sendo que as concentrações mais altas testadas do AD e do AcD exerceram efeitos comparáveis ao de um clássico desacoplador da fosforilação oxidativa, sugerindo que estes ácidos graxos atuem como desacopladores. Os ácidos AO, AD e AcD também aumentaram o estado 4 da respiração mitocondrial e diminuíram os valores do índice de controle respiratório. Além disso, o AD e o AcD diminuíram o estado 3 da respiração tanto com glutamato/malato quanto com succinato como substratos, enquanto que o AO dimiuiu o mesmo parâmetro apenas com o succinato. Também encontramos uma diminuição na razão ADP/O na presença de AD e AcD. O atractilosídeo, inibidor do translocador de nucleotídeos de adenina (ANT), foi capaz de impedir parcialmente o efeito desacoplador do AD, sem alterar os efeitos do AO e do AcD, sugerindo um envolvimento deste translocador no efeito desacoplador do AD. O AO e o AD também diminuíram o consumo de oxigênio em mitocôndrias desacopladas. O AcD também diminuiu a produção de peróxido de hidrogênio, sendo seu efeito maior do que o da rotenona, que inibe o fluxo reverso de elétrons. Os AO e AD diminuíram as atividades dos complexos I-III e IV da cadeia transportadora de elétrons, e o AD também inibiu a atividade do complexo II-III. Todos os três ácidos graxos testados diminuíram o conteúdo de equivalentes reduzidos de NAD(P)H na matriz mitocondrial e a posterior adição de rotenona apenas reverteu o efeito do AO, sugerindo que estes equivalentes estejam sendo perdidos para o meio extramitocondrial. Os ácidos AD e AcD também induziram um maior inchamento mitocondrial, sugerindo que estes ácidos graxos possam atuar como desacopladores provavelmente devido a uma permeabilização nãoseletiva da membrana mitocondrial interna. Também avaliamos o efeito dos mesmos ácidos graxos sobre parâmetros de estresse oxidativo. Observamos que o AO, o AD e o AcD induziram um aumento na peroxidação lipídica em córtex cerebral de ratos, evidenciado por um aumento nos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) e na medida de quimioluminescência espontânea. Os AD e AcD também causaram dano oxidativo proteico, visto que aumentaram o conteúdo de carbonilas e diminuíram o conteúdo de grupamentos sulfidrila. Além disso, todos os ácidos graxos testados diminuíram as defesas antioxidantes não-enzimáticas, evidenciado pela diminuição do potencial antioxidante total do tecido (TRAP). Entretanto apenas o AD e o AcD diminuíram os níveis de glutationa reduzida (GSH), o principal antioxidante não-enzimático presente no cérebro. O AcD não ocasionou um aumento nos níveis de TBA-RS em preparações mitocondriais de cérebro de ratos, sugerindo que outros componenentes celulares sejam essenciais para os efeitos pró-oxidantes deste ácido graxo. Entretanto, não foi observado nenhum efeito do AD sobre níveis de GSH e o conteúdo de grupamentos sulfidrila em preparações citosólicas, sugerindo um papel para a mitocôndria nos efeitos causados por este ácido graxo. Devemos também enfatizar que os efeitos mais pronunciados foram verificados pelo AcD, seguido do AD e por último do AO. Estes resultados, tomados em seu conjunto, indicam que os principais metabólitos acumulados na deficiência de MCAD exercem efeitos neurotóxicos importantes. Dessa forma, é possível que uma disfunção mitocondrial e o estresse oxidativo, possivelmente com outros mecanismos, atuem sinergicamente, colaborando para o dano neurológico apresentado pelos pacientes afetados pela deficiência da MCAD. / Medium-chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD) deficiency (MCADD) is the most frequent fatty acid oxidation disorder, leading to the accumulation of octanoic (AO), decanoic (AD) and cis-4-decenoic (AcD) acids. Considering that the pathophisiology of the neurological damage found in MCAD-deficient patients is not clear yet, and that a role for neurotoxic accumulating metabolites has been considered, the aim of the present work was to investigate the in vitro effect of AO, AD and AcD on mitochondrial function and oxidative stress parameters in 30-dayold rat brain. Initially we investigated the effect of these fatty acids on mitochondrial homeostasis, and we found that all these three metabolites diminished the mitochondrial membrane potential in mitochondrial preparations of rat brain, and the effects of the highest concentration of AD and AcD were similar to the CCCP effect, a classical uncoupler, suggesting that these fatty acids act as uncouplers of oxidative phosphorylation. AO, AD and AcD also increased state 4 respiration and decreased respiratory control ratio. AD and AcD also decreased state 3 respiration with either glutamate/malate or succinate as substrates, while AO only decreased in the presence of succinate. We also observed a decrease in the ADP/O ratio caused by AD and AcD. Atractyloside, an inhibitor of adenine nucleotide transporter (ANT), mildly prevented the uncoupler effect of AD, without any effect of AcD- and AO-induced effects, suggesting a role for ANT on AD-induced effects. AO and AD also diminished uncoupled state (state U) in mitochondrial preparations. AcD also decreased hydrogen peroxide production, and this effect was greater than rotenone effect, which inhibits the reverse electron flow. AO and AD inhibited the activities of the respiratory chain complexes I-III and IV, and AD also inhibited complex II-III activity. All the fatty acids tested decreased mitochondrial matrix NAD(P)H content, and the further addition of rotenone only reverted AO-induced effect, indicating that these reduced equivalents might be lost from the mitochondrial matrix. AD and AcD also induced a mitochondrial swelling, suggesting that these fatty acids act as uncouplers probably due to a non-selective mitochondrial inner-membrane. We also evaluated the effect of the same fatty acids on oxidative stress parameters. We first observed that lipid peroxidation was increased in the presence of AO, AD and AcD, as observed by the increase in the thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS) levels and spontaneous chemiluminescence. AD and AcD also caused protein oxidative damage, since they increased carbonyl content and decreased sulfhydryl group content. All the fatty acids tested also decreased the non-enzymatic antioxidant defenses, as they decreased the total radical-trapping antioxidant potential (TRAP). However, only AD and AcD decreased reduced glutathione (GSH) levels, the major antioxidant in the cell. AcD did not induce an increase in TBA-RS levels in mitochondrial preparations, suggesting that mitochondria were not involved in AcD-induced effects. Furthermore, AD did not alter GSH levels and sulfhydryl group content in cytosolic preparations, suggesting a role for mitochondria in AD-induced effects. Taken together, these results suggest that the MCADD accumulating fatty acids cause important neurotoxic effects. Thus, it is feasible that a mitochondrial dysfunction and oxidative stress, allied to other possible toxic effects, act synergistically, collaborating to the neurological damage found in MCAD-deficient patients.

Orientador: Roger Frigério Castilho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T14:26:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ruas_JulianaSilveira_M.pdf: 1871713 bytes, checksum: a20e3cd08d0b770aed3b059541e382e3 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A maioria das células tumorais depende da glicólise para a ressíntese de ATP durante um processo de rápida proliferação, mesmo que haja disponibilidade de oxigênio para a transdução de energia mitocondrial (Efeito Warburg). O objetivo do presente estudo foi avaliar o papel do metabolismo oxidativo mitocondrial na proliferação de células de glioblastoma humano U-87MG e T98G. Quando as células foram cultivadas na presença de oligomicina (um inibidor da ATP sintase) ou antimicina A (um inibidor do complexo III da cadeia transportadora de elétrons), observou-se apenas uma inibição parcial da proliferação das células. Notadamente, a incubação dessas células com ambos os inibidores causou uma inibição quase completa na proliferação celular. Resultados semelhantes foram observados em cultura primária de astrócitos, havendo uma queda na proliferação celular somente quando ambos os inibidores mitocondriais estavam presentes. Medidas de consumo de oxigênio indicaram que células de glioblastoma utilizam parcialmente a fosforilação oxidativa para a ressíntese de ATP e apresentam uma respiração bem acoplada. Quando se inibiu, nestas células, a fosforilação oxidativa do ADP com oligomicina ou antimicina A, houve um pequeno aumento no consumo de glicose e na produção de lactato. No entanto, o tratamento com ambos os inibidores mitocondriais promoveu um menor consumo de glicose e produção de lactato, em comparação com os efeitos que a antimicina A promoveu. Isso indica que a cadeia transportadora de elétrons quando inibida pela presença de antimicina A, promove um funcionamento inverso da ATP sintase, promovendo a hidrólise de ATP para que haja um bombeamento de prótons para o espaço intermembranar mitocodrial. De acordo com os resultados acima descritos, uma queda quase completa do potencial de membrana mitocondrial foi observada apenas quando as células de glioblastoma foram incubadas na presença de ambos os inibidores mitocondriais, oligomicina e antimicina A. Quando a análise do ciclo celular foi realizada, observou-se uma diminuição da percentagem das células em G0-G1 e um aumento nas fases S e G2-M quando tratadas com oligomicina. Quando as células foram tratadas com antimicina A e oligomicina mais antimicina A foi constatado uma diminuição significativa nas fases G0-G1 e G2-M, e um aumento na fase S. Em conclusão, estes resultados indicam que a rápida proliferação de células de glioblastoma depende da existência do potencial de membrana mitocondrial, mas não da fosforilação oxidativa ou do transporte de elétrons na cadeia respiratória / Abstract: Most tumor cells rely on glycolysis for ATP resynthesis during rapid proliferation, despite the availability saturating levels of oxygen for mitochondrial energy transduction (Warburg effect). The aim of the present study was to evaluate the role of mitochondrial oxidative metabolism on proliferation of human glioblastoma cells U-87MG and T98G. When cells were cultured in the presence of oligomycin (ATP synthase inhibitor) or antimycin A (inhibitor of complex III of the electron transport chain), we observed only a partial inhibition of cell proliferation. Remarkably, incubation of cells with both inhibitors caused an almost complete inhibition of cell proliferation. Similar results were observed in primary culture of astrocytes, with a decrease in cell proliferation only when both mitochondrial inhibitors were present. Oxygen consumption measurements indicated that glioma cells partially rely on oxidative phosphorylation for ATP turnover and exhibit a well-coupled respiration. In fact, shutting down mitochondrial ADP phosphorylation in these glioma cells with either oligomycin or antimycin inhibitors slightly increased glucose consumption and lactate release. However, the treatment with both mitochondrial inhibitors promoted lower glucose consumption and lactate release as compared with the effects of antimycin alone, which indicates that ATP synthase is operating reversely and thus hydrolyzing ATP and pumping H+ out when the respiratory chain is inhibited by antimycin. In agreement, an almost complete collapse of mitochondrial membrane potential was only observed when the glioma cells were incubated in the presence of both antimycin and oligomycin, but not of only antimycin. When cell cycle analyses were performed in oligomycin-treated cells, a decrease in the percentage of cells in G0-G1 phase and an increase in S and G2-M phases were observed. When cells were treated with antimycin A or oligomycin plus antimycin A, it was observed a significant decrease in G0-G1 and G2-M cell phases and an increase in S phase. Overall, our results suggest that the rapid proliferation of glioblastoma cells is dependent on the mitochondrial membrane potential, but not on oxidative phosphorylation or electron transport in the respiratory chain / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestra em Ciências

Nessa dissertação foi realizada uma scoping review com objetivo de buscar na literatura o que existe, até o presente momento, para explicar a relação entre o metabolismo mitocondrial com a síndrome da fadiga crônica (SFC). A SFC se apresenta de forma diferente para cada indivíduo, o que torna complexo seu entendimento, uma vez que não foram identificados biomarcadores específicos para auxiliar em um diagnóstico definitivo que favoreça uma intervenção adequada e tratamentos mais eficazes. Diferentes mecanismos biológicos são estudados, sendo que alterações no metabolismo mitocondrial têm sido foco de pesquisas recentes. Tais alterações podem ser a causa de fadiga severa e estudos sobre SFC mostraram que entre os principais indicadores da disfunção mitocondrial, envolvidos com a menor produção de ATP, está o comprometimento das vias de fosforilação oxidativa. O método utilizado nessa revisão, scoping review, é utilizado para investigar conceitos-chave subjacentes a uma nova área de pesquisa, bem como esclarecer definições de trabalhos, analisando o título e resumo de artigos para seleciona-los. Como critérios de inclusão ficaram determinados: (1) estudos clínicos que registram pacientes adultos (>= 18 anos de idade); (2) mostram uma relação entre questões do metabolismo e bioenergética mitocondrial com síndrome da fadiga crônica; (3) são escritos em português, inglês ou espanhol; (4) artigos publicados nos últimos 10 anos. E de exclusão: (1) utilizaram modelos animai; (2) relatos de casos, editoriais, cartas, revisões de literatura, resumos e dissertações de reuniões; (3) literatura cinzenta. Entre os descritores comuns, utilizados para realizar a busca nas bases de dados estão: mitochondria OR mitochondrial, fatigue, bioenergy OR bioenergetic OR energy metabolism. O estudo foi guiado pela seguinte questão: \"\"Alterações no metabolismo energético mitocondrial estão relacionados com a origem e prevalência da síndrome da fadiga crônica?\". Após utilizar a estratégia de busca, específica para cada uma das quatro bases de dados (PubMed, EMBASE, SCOPUS e Web of Science), foram encontrados 228 artigos, os quais foram exportados para o software Rayyan QCRI e removidos aqueles que se encontravam em duplicata. Este software permitiu que dois revisores executassem, de forma independente, a leitura dos títulos e resumos de 150 artigos e 27 foram selecionados para a leitura na íntegra, por atenderem aos critérios supracitados. Dentre esses últimos, apenas 10 relatavam alterações no metabolismo mitocondrial relacionadas à SFC. As alterações compreendem modificações nas vias de transporte mitocondrial e na cadeia respiratória; mutações no DNA mitocondrial e, até mesmo, disfunções energéticas em células do sistema imune, como as natural-killer. Foram encontrados dados de pesquisas em diversas áreas clínicas, tais como: cardiologia, oncologia e distúrbios musculares, os quais podem colaborar para trazer luz às causas biológicas dessa síndrome. Desta forma, tornou-se ainda mais evidente a conexão entre distúrbios na bioenergética mitocondrial, como uma menor capacidade de transporte de oxigênio por meio das vias de transporte, ou até mesmo, a insuficiência mitocondrial para produção de ATP, com a SFC. De acordo com os estudos que compuseram a amostra final desta revisão (n=10), o metabolismo mitocondrial e suas principais atividades, como a produção e transporte de ATP, são um alvo potencial para auxiliar na compreensão de incógnitas existentes sobre a SFC. Esses resultados são promissores para a enfermagem, sobretudo na área da ciência dos sintomas, com impacto na qualidade de vida e no manejo personalizado de sintomas em diferentes condições crônicas, especialmente na SFC / In this dissertation a scoping review was carried out with the objective of searching in the literature what exists to date to explain the relationship between mitochondrial metabolism and chronic fatigue syndrome (CFS). SFC presents itself differently for each individual, which makes complex their understanding, since no specific biomarkers were identified to aid in a definitive diagnosis that favors an appropriate intervention and more effective treatments. Different biological mechanisms are studied, and changes in mitochondrial metabolism have been the focus of recent research. Such alterations may be the cause of severe fatigue and studies on CFS have shown that among the main indicators of mitochondrial dysfunction, involved in the lower production of ATP, is the involvement of oxidative phosphorylation pathways. The method used in this review, scoping review, is used to investigate key concepts underlying a new research area, as well as clarifying definitions of papers, analyzing the title and abstract articles to select them. As inclusion criteria were determined: (1) clinical studies that register adult patients (>= 18 years of age); (2) show a relationship between metabolism and bioenergetic mitochondrial issues with chronic fatigue syndrome; (3) written in Portuguese, English or Spanish; (4) articles published in the last 10 years. The exclusion criteria: (1) used animal models; (2) case reports, editorials, letters, literature reviews, abstracts and dissertations; (3) gray literature. Among the common descriptors used to perform the search in the databases are: mitochondria OR mitochondrial, fatigue, bioenergy OR bioenergetic OR energy metabolism. The study was guided by the following question: \"\" Changes in mitochondrial energy metabolism are related to the origin and prevalence of chronic fatigue syndrome? \". After using the search strategy, specific to each of the four databases (PubMed, EMBASE, SCOPUS and Web of Science), 228 articles were found, which were exported to the Rayyan QCRI software and removed from those that were in duplicate. This software allowed two reviewers to independently perform the reading of the titles and abstracts of 150 articles and 27 were selected for reading in full, because they meet the aforementioned criteria. Among the latter, only 10 reported changes in mitochondrial metabolism related to CFS. The changes comprise modifications in mitochondrial transport pathways and respiratory chain; mutations in mitochondrial DNA, and even energy dysfunctions in cells of the immune system, such as natural killer. Research data have been found in several clinical areas, such as: cardiology, oncology and muscular disorders, which can collaborate to bring light to the biological causes of this syndrome. Thus, the connection between disturbances in mitochondrial bioenergetics, such as reduced oxygen transport capacity, or even mitochondrial insufficiency for ATP production, with CFS became even more evident. According to the studies that compose the final sample of this review (n = 10), mitochondrial metabolism and its main activities, such as the production and transport of ATP, are a potential target to aid in the understanding of existing unknowns about CFS. These results are promising for nursing, especially in the area of symptom science, with an impact on quality of life and personalized management of symptoms in different chronic conditions, especially CFS

Apesar da melhoria no sistema de produção e cultivo dos embriões in vitro, cerca de 60% dos oócitos que entram no sistema, não atingem o estágio de blastocisto e a qualidade dos embriões obtidos é bastante variável quando comparadas com embriões produzidos in vivo. Este bloqueio pode ser afetado por íons inorgânicos, tampões, aminoácidos e composição da atmosfera gasosa. Partindo-se da premissa que há influência da mitocôndria sobre a ativação da morte celular programada levou-nos a formular a hipótese que ausência de fragmentação nuclear nos embriões antes das 72 hpi está relacionada com a ausência do potencial de membrana mitocondrial e a inibição da OXPHOS pela utilização de bloqueadores leva a manutenção de baixos níveis de potencial de membrana mitocondrial e baixas taxas de fragmentação nuclear nos embriões. Embriões foram produzidos in vitro mediante maturação durante 22 horas, fecundação e cultivo 18 horas após a inseminação (hpi). Decorridas 24hpi realizou-se o cultivo com 0% de oxigênio, a fim de bloquear o processo de OXPHOS. Após 48 hpi realizou-se o feeding do meio de cultivo (SOF) com inibidores da OXPHOS (antimicina A e/ou oligomicina, cianeto de potássio) em diferentes doses. O número de embriões 8 células foi determinado às 80 hpi, mesmo momento em que foram realizadas as técnicas de JC-1 e TUNEL. Verificou-se as 168 hpi o efeito dos tratamentos no desenvolvimento embrionário. Os resultados obtidos com a inibição da OXPHOS após 48 hpi com oligomicina e/ou antimicina A nas doses utilizadas não alterou a capacidade do embrião atingir o estádio de 8 células. Entretanto, esta inibição inviabilizou o desenvolvimento até o estádio de blastocisto. O tratamento com KCN permitiu o desenvolvimento até o estádio de 8 células e a blastocisto em taxas semelhantes ao controle. A inibição do cultivo na ausência do O2 inviabilizou o processo de cultivo. Já os resultados obtidos quanto ao Ψmm e TUNEL evidenciam que os tratamentos dos embriões antimicina e/ou oligomicina levaram a um aumento do Ψmm e fragmentação nuclear na maioria dos embriões testados. Portanto, não foi possível testar a hipótese de que o Ψmm é necessário para o estabelecimento da MCP, todavia, foi observada uma correlação positiva entre Ψmm e fragmentação nuclear. / Although in vitro embryo production has been improved in the last 2 decades, about 60% of the oocytes do not reach the blastocyst stage and embryo quality is very variable when compared with in vivo produced embryo. This developmental block can be affected by inorganic ions, buffers, aminoacids and gaseous atmosphere composition. The knowledge that there influence of mitochondria on the activation of the programmed cellular death led to formulate the hypothesis that nuclear fragmentation absence in embryos before 72 post insemination is related with absence of mitochondrial membrane potential and OXPHOS blockage by inhibiting agents, would cause the maintenance of low levels of mitochondrial membrane potential and low rates of embryo nuclear fragmentation. Embryos were cultured in vitro for 18 hours post insemination (hpi) and after 24 hpi, they were submitted to 0% oxygen culture, in order to block the OXPHOS process. At 48 hpi, feeding was performed with SOF medium containing OXPHOS inhibitors (antimycin A and/or oligomycin, potassium cyanide) in different concetrations. The numbers of 8 cell embryos were estimated at 80 hpi, the same moment that they were submitted to JC-1 probes and TUNEL for mitochondrial membrane potential and DNA damages evaluation, respectively. At 168 hpi the effect of the treatments was verified on embryonic development. The results obtained with the OXPHOS inhibition after 48 after hpi using oligomycin and/or antimycin A did not modify embryo capacity to reach 8 cell stage. However, this inhibition prevented development to the blastocyst stage. KCN treatment allowed development up to the 8 cell stage and blastocyst similar to controls. The absence of O2 prevented embryo development. The Ψmm and TUNEL results showed that antimycin and/or oligomycin treatment increased Ψmm and nuclear fragmentation in the majority of the embryos tested. In conclusion, it was not possible to test the hypothesis that Ψmm is necessary to the establishment of MCP, but a positive correlation between Ψmm and nuclear fragmentation was observed.

Apesar da melhoria no sistema de produção e cultivo dos embriões in vitro, cerca de 60% dos oócitos que entram no sistema, não atingem o estágio de blastocisto e a qualidade dos embriões obtidos é bastante variável quando comparadas com embriões produzidos in vivo. Este bloqueio pode ser afetado por íons inorgânicos, tampões, aminoácidos e composição da atmosfera gasosa. Partindo-se da premissa que há influência da mitocôndria sobre a ativação da morte celular programada levou-nos a formular a hipótese que ausência de fragmentação nuclear nos embriões antes das 72 hpi está relacionada com a ausência do potencial de membrana mitocondrial e a inibição da OXPHOS pela utilização de bloqueadores leva a manutenção de baixos níveis de potencial de membrana mitocondrial e baixas taxas de fragmentação nuclear nos embriões. Embriões foram produzidos in vitro mediante maturação durante 22 horas, fecundação e cultivo 18 horas após a inseminação (hpi). Decorridas 24hpi realizou-se o cultivo com 0% de oxigênio, a fim de bloquear o processo de OXPHOS. Após 48 hpi realizou-se o feeding do meio de cultivo (SOF) com inibidores da OXPHOS (antimicina A e/ou oligomicina, cianeto de potássio) em diferentes doses. O número de embriões 8 células foi determinado às 80 hpi, mesmo momento em que foram realizadas as técnicas de JC-1 e TUNEL. Verificou-se as 168 hpi o efeito dos tratamentos no desenvolvimento embrionário. Os resultados obtidos com a inibição da OXPHOS após 48 hpi com oligomicina e/ou antimicina A nas doses utilizadas não alterou a capacidade do embrião atingir o estádio de 8 células. Entretanto, esta inibição inviabilizou o desenvolvimento até o estádio de blastocisto. O tratamento com KCN permitiu o desenvolvimento até o estádio de 8 células e a blastocisto em taxas semelhantes ao controle. A inibição do cultivo na ausência do O2 inviabilizou o processo de cultivo. Já os resultados obtidos quanto ao Ψmm e TUNEL evidenciam que os tratamentos dos embriões antimicina e/ou oligomicina levaram a um aumento do Ψmm e fragmentação nuclear na maioria dos embriões testados. Portanto, não foi possível testar a hipótese de que o Ψmm é necessário para o estabelecimento da MCP, todavia, foi observada uma correlação positiva entre Ψmm e fragmentação nuclear. / Although in vitro embryo production has been improved in the last 2 decades, about 60% of the oocytes do not reach the blastocyst stage and embryo quality is very variable when compared with in vivo produced embryo. This developmental block can be affected by inorganic ions, buffers, aminoacids and gaseous atmosphere composition. The knowledge that there influence of mitochondria on the activation of the programmed cellular death led to formulate the hypothesis that nuclear fragmentation absence in embryos before 72 post insemination is related with absence of mitochondrial membrane potential and OXPHOS blockage by inhibiting agents, would cause the maintenance of low levels of mitochondrial membrane potential and low rates of embryo nuclear fragmentation. Embryos were cultured in vitro for 18 hours post insemination (hpi) and after 24 hpi, they were submitted to 0% oxygen culture, in order to block the OXPHOS process. At 48 hpi, feeding was performed with SOF medium containing OXPHOS inhibitors (antimycin A and/or oligomycin, potassium cyanide) in different concetrations. The numbers of 8 cell embryos were estimated at 80 hpi, the same moment that they were submitted to JC-1 probes and TUNEL for mitochondrial membrane potential and DNA damages evaluation, respectively. At 168 hpi the effect of the treatments was verified on embryonic development. The results obtained with the OXPHOS inhibition after 48 after hpi using oligomycin and/or antimycin A did not modify embryo capacity to reach 8 cell stage. However, this inhibition prevented development to the blastocyst stage. KCN treatment allowed development up to the 8 cell stage and blastocyst similar to controls. The absence of O2 prevented embryo development. The Ψmm and TUNEL results showed that antimycin and/or oligomycin treatment increased Ψmm and nuclear fragmentation in the majority of the embryos tested. In conclusion, it was not possible to test the hypothesis that Ψmm is necessary to the establishment of MCP, but a positive correlation between Ψmm and nuclear fragmentation was observed.

Introdução: A lesão de isquemia/reperfusão do fígado é caracterizada pelo agravamento da lesão isquêmica hepatocelular quando o órgão é revascularizado, podendo originar, nos casos mais graves, uma reação inflamatória sistêmica com lesão de órgãos à distância. O controle desse fenômeno é importante no transplante de fígado, nas cirurgias de ressecção hepática e no choque hemorrágico. A administração de soluções salinas hipertônicas têm se mostrado eficaz no tratamento do choque hemorrágico, pois melhora as alterações hemodinâmicas e, possivelmente, apresenta uma ação antiinflamatória. Neste trabalho foram avaliados os efeitos locais e sistêmicos da administração da solução salina hipertônica na lesão de isquemia/reperfusão hepática em ratos. Métodos: Enquanto 14 ratos Wistar machos, dos 56 utilizados no estudo, compuseram o grupo controle, grupo C; os demais, que foram submetidos à uma hora de isquemia hepática e 4 horas de reperfusão, compuseram outros grupos de 14 animais: o grupo ST, animais que não receberam tratamento; o grupo SSF, animais que receberam 34 mL/kg de NaCl 0,9%, por via endovenosa, 15 minutos antes da reperfusão; o grupo SSH, animais que receberam 4 mL/kg de NaCl 7,5%, 15 minutos antes da reperfusão. Após 4 horas de reperfusão, os materiais foram coletados para análise. Foram realizadas as dosagens das transaminases AST e ALT, a avaliação das funções oxidativas e fosforilativas mitocondriais, a dosagem das interleucinas IL-6 e IL-10, as análises teciduais pulmonares e a análise histológica do fígado isquêmico e não isquêmico. Resultados: Quando comparado aos grupos ST e SSF, o grupo SSH apresentou elevação dos níveis de AST e ALT significantemente menores; preservação da função mitocondrial tanto dos lobos isquêmicos, como dos não isquêmicos, significantemente melhor; elevação dos níveis de IL-6 e IL-10 sem significância estatística; aumento da permeabilidade vascular pulmonar significantemente menor; e elevação da atividade da mieloperoxidase pulmonar sem significância estatística. Em relação à análise histológica da lesão de isquemia/reperfusão hepática, o escore da lesão do grupo SSH foi significantemente menor que o da lesão do grupo C; entretanto, quando comparados os três grupos submetidos à isquemia hepática ST, SSH e SSF não se observaram diferenças significantes estatisticamente. Conclusão: A administração da solução salina hipertônica a 7,5% na isquemia/reperfusão hepática normotérmica melhorou as lesões hepáticas locais e as lesões à distância, principalmente pulmonares / Introduction: During liver ischemia, the drop in mitochondrial energy production leads to cellular damage, which is aggravated during restoration of blood supply. Besides local hepatic injury, the ischemia/reperfusion process can trigger a systemic inflammatory syndrome producing remote organ damage. To control these alterations in clinical conditions like liver transplantation, liver resections and hypovolemic shock, is crucial to achieve proper patient management. Aim: To evaluate the effect of the sodium chloride hypertonic solution on prevention of local and systemic injury during partial liver ischemia/reperfusion. Methods: Animals underwent partial warm liver ischemia/reperfusion. Fity six Wistar male rats were randomly allocated into four groups. Fourteen animals were submitted to sham operation and allocated to C group; 42, submitted to one hour of liver ischemia followed by 4 hours of reperfusion, were allocated in three additional groups: ST group, 14 animals that received no treatment; SSF group, 14 animals that received NaCl 0.9%, 34 mL/kg, intravenously; SSH group, animals that received NaCl 7.5%, 4 mL/kg, intravenously. Blood and tissue samples were collected four hours after reperfusion, when animals were killed. Blood samples were collected to determinate AST, ALT, IL-6 and IL-10 levels. Liver and pulmonary tissues were assembled for liver histology and for liver mitochondrial phosphorylation, pulmonary vascular permeability and myeloperoxidase analyzes. Results: Hypertonic saline solution showed beneficial effects in the treatment of liver ischemia/reperfusion injury. SSH group presented elevation of AST and ALT plasma levels significantly lower than ST and SSF groups. A significant reduction on mitochondrial dysfunction was observed in SSH group compared with ST and SSH groups. Elevation in serum IL-6 and IL-10 was similar among ST, SSF and SSH groups. Pulmonary vascular permeability was significantly lower in group SSH compared with ST and SSF groups. No differences in myeloperoxidase activity were observed among these three groups. Histological score for liver ischemia/reperfusion injury was significantly lower in SSH group compared to ST group, however no differences were observed between SSH and SSF groups. Conclusion: Administration of hypertonic saline solution in an experimental rat model of liver ischemia-reperfusion ameliorated local and systemic injuries

Introdução: A lesão de isquemia/reperfusão do fígado é caracterizada pelo agravamento da lesão isquêmica hepatocelular quando o órgão é revascularizado, podendo originar, nos casos mais graves, uma reação inflamatória sistêmica com lesão de órgãos à distância. O controle desse fenômeno é importante no transplante de fígado, nas cirurgias de ressecção hepática e no choque hemorrágico. A administração de soluções salinas hipertônicas têm se mostrado eficaz no tratamento do choque hemorrágico, pois melhora as alterações hemodinâmicas e, possivelmente, apresenta uma ação antiinflamatória. Neste trabalho foram avaliados os efeitos locais e sistêmicos da administração da solução salina hipertônica na lesão de isquemia/reperfusão hepática em ratos. Métodos: Enquanto 14 ratos Wistar machos, dos 56 utilizados no estudo, compuseram o grupo controle, grupo C; os demais, que foram submetidos à uma hora de isquemia hepática e 4 horas de reperfusão, compuseram outros grupos de 14 animais: o grupo ST, animais que não receberam tratamento; o grupo SSF, animais que receberam 34 mL/kg de NaCl 0,9%, por via endovenosa, 15 minutos antes da reperfusão; o grupo SSH, animais que receberam 4 mL/kg de NaCl 7,5%, 15 minutos antes da reperfusão. Após 4 horas de reperfusão, os materiais foram coletados para análise. Foram realizadas as dosagens das transaminases AST e ALT, a avaliação das funções oxidativas e fosforilativas mitocondriais, a dosagem das interleucinas IL-6 e IL-10, as análises teciduais pulmonares e a análise histológica do fígado isquêmico e não isquêmico. Resultados: Quando comparado aos grupos ST e SSF, o grupo SSH apresentou elevação dos níveis de AST e ALT significantemente menores; preservação da função mitocondrial tanto dos lobos isquêmicos, como dos não isquêmicos, significantemente melhor; elevação dos níveis de IL-6 e IL-10 sem significância estatística; aumento da permeabilidade vascular pulmonar significantemente menor; e elevação da atividade da mieloperoxidase pulmonar sem significância estatística. Em relação à análise histológica da lesão de isquemia/reperfusão hepática, o escore da lesão do grupo SSH foi significantemente menor que o da lesão do grupo C; entretanto, quando comparados os três grupos submetidos à isquemia hepática ST, SSH e SSF não se observaram diferenças significantes estatisticamente. Conclusão: A administração da solução salina hipertônica a 7,5% na isquemia/reperfusão hepática normotérmica melhorou as lesões hepáticas locais e as lesões à distância, principalmente pulmonares / Introduction: During liver ischemia, the drop in mitochondrial energy production leads to cellular damage, which is aggravated during restoration of blood supply. Besides local hepatic injury, the ischemia/reperfusion process can trigger a systemic inflammatory syndrome producing remote organ damage. To control these alterations in clinical conditions like liver transplantation, liver resections and hypovolemic shock, is crucial to achieve proper patient management. Aim: To evaluate the effect of the sodium chloride hypertonic solution on prevention of local and systemic injury during partial liver ischemia/reperfusion. Methods: Animals underwent partial warm liver ischemia/reperfusion. Fity six Wistar male rats were randomly allocated into four groups. Fourteen animals were submitted to sham operation and allocated to C group; 42, submitted to one hour of liver ischemia followed by 4 hours of reperfusion, were allocated in three additional groups: ST group, 14 animals that received no treatment; SSF group, 14 animals that received NaCl 0.9%, 34 mL/kg, intravenously; SSH group, animals that received NaCl 7.5%, 4 mL/kg, intravenously. Blood and tissue samples were collected four hours after reperfusion, when animals were killed. Blood samples were collected to determinate AST, ALT, IL-6 and IL-10 levels. Liver and pulmonary tissues were assembled for liver histology and for liver mitochondrial phosphorylation, pulmonary vascular permeability and myeloperoxidase analyzes. Results: Hypertonic saline solution showed beneficial effects in the treatment of liver ischemia/reperfusion injury. SSH group presented elevation of AST and ALT plasma levels significantly lower than ST and SSF groups. A significant reduction on mitochondrial dysfunction was observed in SSH group compared with ST and SSH groups. Elevation in serum IL-6 and IL-10 was similar among ST, SSF and SSH groups. Pulmonary vascular permeability was significantly lower in group SSH compared with ST and SSF groups. No differences in myeloperoxidase activity were observed among these three groups. Histological score for liver ischemia/reperfusion injury was significantly lower in SSH group compared to ST group, however no differences were observed between SSH and SSF groups. Conclusion: Administration of hypertonic saline solution in an experimental rat model of liver ischemia-reperfusion ameliorated local and systemic injuries