Terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica pouco invasiva e sem efeitos térmicos aprovada para o tratamento de doenças neoplásicas e vasculares proliferativas, capaz de produzir necrose tecidual seletiva através de administração de um fármaco fotossensibilizador seguido da aplicação de luz em comprimento de onda adequado. Na presença de luz o fotossensibilizador passa à forma ativada, e na presença de oxigênio molecular presente nas células, produz espécies reativas de oxigênio e oxigênio singleto que induzem as células alteradas à morte. O melhor entendimento dos mecanismos e da resposta celular à TFD, a disponibilidade de fontes de luz mais baratas, confiáveis e de fácil manuseio, bem como bons resultados em pesquisa clínica, dão credibilidade à técnica e a sua difusão na prática clínica. Estudos recentes em dosimetria têm mostrado melhores resultados terapêuticos com o fracionamento da dose de luz uma vez que permite a reoxigenação dos tecidos durante o período em que esse não está sendo iluminado. Neste estudo, investigou-se o dano tecidual (profundidade de necrose) e os danos celulares, especificamente na mitocôndria (estado 3, estado 4, taxa do controle respiratório, relação de ADP/O, potencial de membrana e intumescimento ou ?swelling?) do fígado normal de rato submetendo-o a regime de fracionamento da dose de luz. Vinte e cinco ratos Wistar receberam 1.5 mg/kg do fotossensibilizador Photogem 30 minutos antes da iluminação com laser de diodo (? = 630nm), potência 200 mW, intensidade 250 mW/cm2 e dose total fixa de 200 J/cm2. Os animais foram divididos em 5 grupos de 5 animais, cada um sendo iluminado em intervalos diferentes de claro (C) e escuro (E): 800s, 400s, 200s, 100s e 50s, alternando, respectivamente nesses grupos, os períodos de C/E em 800s/0s, de 400s/400s, de 200s/200s, de 100s/100s e de 50s/50s. Os animais foram mortos 30 horas após a aplicação do Photogem. O tecido iluminado foi submetido à análise histológica. As lâminas histológicas mostraram uma tendência de aumento na profundidade de necrose, com um aumento de até 30% em comparação ao regime contínuo e também uma tendência de diminuição na RCR e na relação ADP/O em função do tempo de escuro, principalmente até 200s do intervalo de C/E. Com tempo do fracionamento menor, as tendências de ADP/O e de RCR se invertem. O intumescimento e o potencial de membrana não mostraram diferença significativa com os diferentes regimes de iluminação. Conclui-se que o aumento de eficiência em PDT devido ao fracionamento da dose de luz é proporcionado pela maior disponibilidade de oxigênio na área tratada o que pode ocorrer pela reversão da oclusão vascular provisória ou do menor consumo de oxigênio pela reação fotodinâmica até o esquema do fracionamento da dose de luz de 200s. Para intervalos de escuro maiores tem-se uma limitação da reposição do oxigênio com conseqüente redução dos danos mitocondriais. O regime de fracionamento de dose de luz melhora a eficácia da técnica de PDT e mostra uma relação causal com a profundidade de necrose, embora a determinação da extensão dos intervalos de escuro seja fundamental para o sucesso da técnica. / Photodynamic therapy is a promising minimally invasive and non-thermal therapeutic modality approved for the treatment of neoplastic and vascular disease, which produces localized tissue necrosis with light following admistration of a photosensitizing drug. The drug is activated by light of a specific wavelength. The activated photosensitizer, in the presence of oxygen, generates singlet oxygen and reactive oxygen species that will induce selected cells to death. The current best understanding of PDT mechanisms and cellular response, the availability of cheaper, trustworthy and easy handling sources of light, as well as good results in clinical investigations, had provided trustworthiness to the technique and its diffusion in clinical practice. Recent dosimetry studies had suggested better therapeutical results with dose light fractionation. In this study, it was investigated the tissue damage (depth of necrosis) and cellular damage specifically in the mitochondria (state 3, state 4, respiratory control rate (RCR), ADP/O ratio, swelling and membrane potencial) in normal rat liver submitted to the fractionation of the light dose scheme. Twenty five Wistar rats received 1,5 mg/kg of the first generation Russian photossensitizer Photogem® 30 minutes before illumination with diode laser (? = 630nm), power 200 mW, fluence rate 250 mW/cm2 and fluence 200 J/cm2. Animals had been divided into 5 groups of 5 animals each, being illuminated in different intervals of light and dark (L/D): 800s, 400s, 200s, 100s and 50s, for each one had respectively alternated light/dark photodynamic therapy intervals of 800s/0s, 400s/400s, 200s/200s, 100s/100s and 50s/50s. The rats were sacrificed 30 hours after Photogem application. The illuminated tissue was submitted to histological analyze. The histological sections of the illuminated tissue volume showed a trend toward increasing depth of necrosis (increase 30%) as well as decreasing in RCR and ADP/O as a function of the increase in the dark interval, mainly until 200s of light interval. With lower fractionation time the trends of ADP/O and RCR becomes inverted. Swelling and membrane potencial did not show significant difference in all fractionation schemes. It can be concluded that the enhancement of PDT efficiency by the fractionation of light is due to improved oxygen supply to the treated area, which may be due to the reversal of the temporary vascular occlusion or slower photochemical consumption of oxygen until 200s fractionation scheme. For higher light intervals there is a limitation in the oxygen replenishment leading to a reduction of the mitochondrial damage. A fractionated light dose delivery can enhance PDT efficiency with Photogem and presents a causal relation with necrosis depth, although the determination of the extension of the dark intervals is fundamental for the success of technique.

O surgimento de resistência bacteriana aos tratamentos convencionais tem proporcionado o desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas para o tratamento e/ou controle da cárie dentária. Nesse contexto, a utilização da terapia fotodinâmica (TFD) é sugerida como alternativa para a inativação de microrganismos patogênicos envolvidos na gênese da cárie. O objetivo do presente estudo foi avaliar in vitro o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica (TFD) sobre três culturas de S. mutans: uma cepa padrão de S. mutans (ATCC 25175) e dois isolados clínicos (43513 e 47513) oriundos da saliva de crianças. O corante (C) azul de orto-toluidina (TBO) foi utilizado associado à iluminação com LEDs (L) no comprimento de onda vermelho. Estas suspensões foram transferidas para placas de 96 orifícios, tratadas com quatro concentrações de TBO (0,25; 2,5; 25 e 250 µg/mL) e expostas a quatro dosimetrias (12; 24; 36 e 48 J/cm2) constituindo o grupo C+L+ (TFD). Suspensões adicionais foram tratadas somente com as quatro concentrações de TBO (C+L-) ou apenas com as quatro dosimetrias (C-L+). Amostras não submetidas ao tratamento com a fonte de luz nem ao corante, constituíram a condição C-L- (controle positivo). Alíquotas de 100 µL de cada orifício foram transferidas para tubos de ensaio para se verificar a presença ou ausência de crescimento microbiológico. Adicionalmente, alíquotas de 25 µL do grupo correspondente a TFD (C+L+) foram semeadas em placas de Petri, as quais foram incubadas a 370C por 48 horas para posterior visualização de halos de inibição e/ou crescimento microbiológico correspondente a efetividade ou ineficiência da TFD, respectivamente. Com o intuito de confirmar os achados, essas mesmas amostras foram submetidas à análise pela microscopia confocal a laser. Os resultados demonstraram que a TFD, em determinadas condições experimentais, foi efetiva no controle do crescimento microbiológico das espécies de S. mutans usadas neste estudo. A concentração mínima de TBO necessária para a inativação in vitro das três culturas de S. mutans foi de 2,5 µg/mL associada à dosimetria mínima de 24 J/cm2 da fonte de luz LED utilizada no estudo. / The increase of bacterias resistance to conventional treatment resulted in the development of new therapeutic modalities for dental caries treatment and/or prevention. In this field, the use of photodynamic therapy (PDT) is suggested as an alternative for inactivation of patogenic microrganisms involved in the etiology of tooth decay. The aim of this study was to evaluate in vitro the antimicrobian effect of the photodynamic therapy (PDT) on bacteria suspensions of S. mutans (ATCC 25175) and two suspensions (43513 and 47513) from infants saliva. Toluidine blue O (TBO) (D) and a red light-emmiting diodes (LEDs) (L) were used in association. Samples were inserted into 96 well-plate and treated with four TBO concentrations (0.25; 2.5; 25 e 250 µg/mL) and exposed to four dosimetries (12; 24; 36 e 48 J/cm2) defining the D+L+ group (PDT). Additional samples were treated only with TBO (D+L-) or only with red LEDs (D-L+). The treatment without dye and none red LED constituted the D-L- condition (positive control). Aliquots from D+L+ (TFD group) were inserted in Petri dishes, which were incubated at 370C for 48 hours. Posterior analysis of microbiologic growth, corresponding to PDT effectivity, was conducted. These samples were also submitted to laser confocal microscopy analysis for microbiologic data confirmation. The results showed PDT effectiveness for S. mutans inactivation in particular conditions. It was demonstrated that PDT was efficient to kill S. mutans species in the presence of the TBO at 2.5 µg/mL (minimum concentration) associated to 24 J/cm2 dosimetry.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica inovadora para o tratamento de tumores cutâneos. As ftalocianinas têm sido utilizadas como fotossensibilizantes sistêmicos devido à sua alta afinidade ao tecido tumoral e seu efeito acentuado quando irradiadas com luz. No entanto, a lipossolubilidade e o baixo coeficiente de partilha óleo/água dessas substâncias dificultam sua aplicação tópica, levando ao desenvolvimento de derivados carregados, como a zinco ftalocianina tetrassulfonada (ZnPcS4) na tentativa de aumentar sua solubilidade em água, bem como melhorar sua captação pelas células tumorais. Entretanto, moléculas carregadas têm dificuldades em atravessar o estrato córneo (EC), a principal barreira da pele. Como a iontoforese é uma técnica não-invasiva capaz de aumentar e controlar a penetração de moléculas carregadas na pele, ela parece ser uma alternativa para aumentar a penetração cutânea da ZnPcS4 nas camadas da pele onde os tumores estão presentes. Dessa forma, foram realizados experimentos in vitro de iontoforese de um gel hidrofílico da ZnPcS4 aplicado topicamente na presença e ausência de NaCl. Estudos de iontoforese in vivo também foram realizados, empregando ratos Wistar como modelo animal, bem como experimentos em cultura de células tumorais para avaliar a citotoxicidade do fármaco em estudo. O método analítico para quantificação do fármaco na pele foi validado quanto à linearidade, precisão, exatidão, sensibilidade e seletividade. A iontoforese catódica promoveu um aumento significativo da retenção da ZnPcS4 tanto no EC como na epiderme viável nos experimentos realizados na presença e ausência de NaCl em relação à aplicação passiva da formulação e de iontoforese anódica, sendo que ocorreu um aumento da quantidade do fármaco retido nas diferentes camadas da pele quando o sal foi retirado da formulação. Os estudos in vivo com a formulação também mostraram que a corrente elétrica aumentou a penetração do fármaco para as camadas mais profundas da pele em relação aos experimentos passivos de permeação, o que foi evidenciado pela intensidade de fluorescência do fármaco visualizada por microscopia confocal e pela quantidade de fármaco retido nas diferentes camadas da pele. Resultados em cultura de células tumorais A431 sugerem que a concentração de fármaco que chega à epiderme viável após experimentos de iontoforese catódica é capaz de matar mais de 90% dessas células tumorais quando a dose de irradiação de 5 J/cm2 é aplicada. Além disso, quando a corrente elétrica é aplicada em cultura celular, não foi observado nenhum aumento significativo da citotoxicidade da ZnPcS4, demonstrando que a aplicação de corrente elétrica não fez com que a entrada do fármaco para o interior das células tumorais aumentasse. Não restam dúvidas, no entanto, que a corrente elétrica aumentou a penetração do fármaco nas camadas profundas da pele, além de levar a uma distribuição homogênea da ZnPcS4 nessas camadas após 15 minutos de aplicação. / Photodynamic therapy (PDT) is an innovative therapeutic modality for the treatment of cutaneous tumors. The phthalocyanines have been used as systemic photosensitizing agents due to its high affinity to tumor tissues and its accentuated effect when irradiated with light. However, the lipophilicity and the low partition coefficient oil/water of these substances difficult its topical application, leading to the development of charged derivatives, such as the zinc phthalocyanine tetrasulfonated (ZnPcS4) in an attempt to increase the water solubility, as well as improve the drug uptake by tumor cells. However, charged molecules have difficulties to cross the stratum corneum (SC), the main barrier of the skin. As iontophoresis is a noninvasive technique able to improve and control the penetration of charged molecules through the skin, it seems to be an alternative for enhancing ZnPcS4 penetration into the deep layers of the skin, where cutaneous tumors reside. This way, in vitro iontophoresis experiments of a hydrophilic gel containing ZnPcS4 applied topically in the presence and absence of NaCl were performed. In vivo iontophoresis studies were also carried out employing Wistar rats as animal model, as well as experiments in culture of tumour cells to evaluate the cytotoxicity of the drug. The analytical method for the quantification of the drug in the skin was validated considering the parameters of linearity, precision, accuracy, sensitivity and selectivity. The cathodal iontophoresis promoted a significant increase in retention of ZnPcS4 in both SC and viable epidermis in the experiments conducted in the presence and absence of NaCl in relation to the formulation applied passively or by anodal iontophoresis. Therefore, there was an increase in the amount of the drug retained in different layers of the skin when salt was removed from the formulation in the cathodal iontophoresis. In vivo studies also demonstrated that the electrical current increased penetration of the drug to the deeper layers of the skin in relation to passive experiments, evidenced by the fluorescence intensity of the drug showed by confocal microscopy and by the amount of drug retained in the different layers of the skin. Results with A431 tumor cells suggest that the concentration of the drug that reaches the viable epidermis after cathodal iontophoresis is able to kill more than 90% of these tumor cells when the radiation dose of 5 J/cm² was applied. In addition, when the electric current was applied to the cells, it was not observed any significant increase of cytotoxicity, demonstrating that the electric current application did not increased the uptake of the ZnPcS4 by the tumor cells. There are no doubts, however, that the electric current increased the ZnPcS4 penetration to the deep layers of the skin and lead to a homogeneous distribution of ZnPcS4 in these layers after 15 minutes of application.

A Terapia Fotodinâmica (PDT) é uma técnica utilizada para tratar vários tipos de tumores em que a luz estimula um fotossensibilizador (FS) a gerar espécies reativas de oxigênio (ROS) que levam à morte celular por apoptose ou necrose. A partir de uma clorina (CHL), cuja nomenclatura é metilfeoforbídio, visando torná-la mais anfifílica foi adicionado o grupo TRISMA (CHL-T). Os vários parâmetros usados na PDT (tipo de FS, concentração do FS, tempo de incubação do FS e dose de luz) podem desencadear diferentes vias para apoptose. Poucos estudos sobre o tipo de morte celular induzido com clorinas têm sido realizados. Diante disso, o objetivo deste estudo foi determinar a citotoxicidade dessa nova clorina, assim como identificar o tipo de morte celular envolvido na PDT e elucidar a participação da proteína apoptótica p53 nesse processo comparando-se com CHL e HY. A hipótese principal deste trabalho é que esta nova clorina modificada tem maior eficiência na indução de apoptose. Para testar esta hipótese, foi avaliada a indução de apoptose por microscopia de fluorecência e por citometria e a citotoxicidade pelo ensaio do MTT de três FSs: uma clorina (CHL), a clorina modificada (CHL-T) e a hipericina (HY). As clorinas apresentaram maior acumulação para as duas linhagens celulares quando comparada com a hipericina. A fototoxicidade apresentada pela nova clorina foi cerca de 10 a 20 vezes maior que a clorina de origem (CHL) nas duas linhagens celulares como demonstrado pelos resultados do ensaio com MTT. Os testes realizados por microscopia de fluorescência resultaram numa porcentagem de morte celular crescente com o aumento das concentrações diferenciando maior apoptose causada por PDT com CHL-T nas células HEp-2 e maior necrose nas células HeLa. A análise da apoptose por citometria também apresentou um efeito muito superior da CHL-T em relação aos demais FSs estudados para apoptose inicial (80,35%) para a concentração de 0,52 \'mü\'M, tempo de incubação de 2h e dose de luz 6 J/\'CM POT.2\'. Já a detecção de ROS por citometria não apresentou diferenças estatisticamente significativas para PDT nessas condições. Um discreto aumento na ativação de p53 com CHL-T e irradiação foi observado, porém não estatisticamente significativo. Os resultados sugerem que a indução da morte celular na PDT não depende dessa proteína e que a CHL-T tem excelente desempenho como FS em PDT. / Photodynamic therapy (PDT) is a technique used in the treatment of various types of tumors in that light stimulates a photosensitizer (PS) to generate reactive oxygen species (ROS) that lead to cell death by apoptosis or necrosis. From a chlorine (CHL), whose nomenclature is methylfeoforbidio, hoping to make it over the amphiphilic the TRISMA group (CHL-T) has been added. Several parameters (type of PS, concentration of PS, incubation time and light dose) can trigger different apoptotic pathways. Few studies aiming the type of cell death induced by chlorines as a PS have been done. Thus, the objective of this project was to determine the cytotoxicity of this new chlorine, as well as identify the type of cell death involved in PDT as well as to elucidate the involvement of apoptotic protein p53 in this process comparing with CHL and HY. The main hypothesis of this study is that the modified chlorine has greater efficiency in the induction of apoptosis. To test this hypothesis, it was evaluated the induction of apoptosis by fluorescence microscopy and cytometry and the cytotoxicity by the MTT assay of three PSs: chlorine (CHL), the modified chlorine (CHL-T) and hypericin (HY).The chlorins accumulation was higher for the two cell lines compared with hypericin. Phototoxicity presented by the chlorin was about 10 to 20 times greater than by the chlorine source (CHL) for the two cell lines as demonstrated by the MTT assay. Tests conducted by fluorescence microscopy showed the percentage of cell death increased with increasing concentrations distinguishing higher apoptosis caused by PDT with CHL-T in HEp-2 cells and higher necrosis in HeLa cells. Analysis of apoptosis by flow cytometry also showed a superior response of CHL-T comparing to the others two studied PSs for initial apoptosis (80.35%) for concentration of 0.52 mM, incubation time of 2h and light dose 6 J/\'CM POT.2\'. However the detection of ROS by flow cytometry showed no statistically significant values for PDT in these conditions. A slight increase in the activation of p53 for CHL-T and irradiation was observed, but without being statistically significant. Thus, the results suggest that the induction of cell death in PDT does not depend on this protein and that CHL-T has excellent performance as a PS in PDT.

O tratamento da Periodontite Agressiva (PA) representa um desafio para os clínicos, pois não existem protocolos padronizados para um controle eficiente da doença. Este estudo clínico controlado, aleatório e duplo-cego avaliou o efeito de múltiplas aplicações da Terapia Fotodinâmica antimicrobiana (TFDa) como adjuvante ao tratamento periodontal não cirúrgico (TPnc) em pacientes diagnosticados com PA. Utilizando um modelo de estudo do tipo boca dividida, 20 pacientes com diagnóstico clínico de PA foram tratados com TFDa (Grupo Teste) associada à raspagem e alisamento radicular (RAR) ou apenas RAR (Grupo Controle). As aplicações da TFDa foram realizadas em 4 episódios (dias 0, 2, 7 e 14). Todos os pacientes foram acompanhados por 90 dias. Os seguintes parâmetros clínicos, microbiológicos e imunológicos foram analisados: i) profundidade de bolsa à sondagem (PS) e nível de inserção clínico (NCI); ii) contagem de 40 espécies subgengivais em amostras de placa bacteriana (checkerboard DNA-DNA hybridization); iii) avaliação dos níveis de Interleucina (IL)-1&beta;, IL-10 e Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-&alpha;) no fluido crevicular gengival (Luminex). Os dados obtidos foram estatisticamente analisados. Na análise de bolsas periodontais profundas (PS inicial &ge; 7mm), o Grupo Teste apresentou, aos 90 dias, redução de PS (-3,96 mm ± 0,83) e ganho de inserção clínica (2,77 mm ± 1,05) significativamente maiores (p < 0,05) que aqueles do Grupo Controle (PS = - 2,56 ± 0,72; NCI = 1,75 ± 1,07). Foi constatado, também, um número significativamente menor de bolsas periodontais residuais (PS &ge; 5mm) no Grupo Teste quando comparado ao Grupo Controle aos 90 dias (p < 0,05). Na análise microbiológica, o Grupo Teste apresentou proporções significativamente menores de espécies microbianas dos complexos vermelho e laranja, bem como maiores proporções de espécies do complexo azul quando comparado ao Grupo Controle aos 90 dias (p < 0,05). Na análise imunológica, observou-se níveis de IL-1&beta; no Grupo Controle significativamente maiores que aqueles do Grupo Teste aos 14, 30 e 90 dias (p < 0,05). Em relação aos níveis de IL-10, apenas o Grupo Teste apresentou valores significativamente maiores (p < 0,05) que aqueles do baseline aos 30 dias. Para TNF-&alpha;, não foi possível observar diferenças significativas nas comparações inter e intragrupos em todos os períodos experimentais. O Grupo Teste apresentou razão IL-1&beta;/IL-10 significativamente menor que aquela do Grupo Controle aos 90 dias (p < 0,05). Pode-se concluir que a utilização de aplicações múltiplas da TFDa como recurso adjuvante à TPnc de pacientes com PA: i) melhora significativamente os parâmetros clínicos periodontais, reduzindo a necessidade de tratamentos periodontais adicionais aos 90 dias; ii) elimina de forma mais eficaz periodontopatógenos dos complexos vermelho e laranja; iii) melhora os parâmetros imunoinflamatórios, reduzindo a concentração de citocinas proinflamatórias e aumentando os níveis de citocinas anti-inflamatórias. / Treatment of Aggressive Periodontitis (AP) is challenging for clinicians because there are no standardized protocols for effective disease control. This double-blind randomized controlled clinical trial evaluated the effects of multiple applications of antimicrobial Photodynamic Therapy (aPDT) as an adjunct to scaling and root planning (SRP) on patients diagnosed with AP. Using a split-mouth model, 20 patients with clinical diagnosis of AP were treated with aPDT associated with SRP (Test Group) or SRP alone (Control Group). aPDT applications were performed along with SRP and 2, 7 and 14 days after SRP. All patients were monitored during 90 days. The following clinical, microbiological and immunological parameters were analyzed: i) probing pocket depth (PPD) and clinical attachment level (CAL), ii) counts of 40 subgingival species in plaque samples (checkerboard DNA-DNA hybridization) and iii) levels of interleukin (IL)-1&beta;, IL-10 and tumor necrosis factor (TNF)-&alpha; in gingival crevicular fluid (Luminex). Data were statistically analyzed. In deep periodontal pockets (initial PPD &ge; 7 mm), the Test Group presented a decrease in PPD (-3.96 ± 0.83 mm) and a clinical attachment gain (2.77 ± 1.05 mm) significantly higher than the Control Group (PPD = - 2.56 ± 0.72 mm; CAL = 1.75 ± 1.07 mm) at 90 days (p < 0.05). It was also observed significantly fewer residual periodontal pockets (PPD &ge; 5 mm) in the Test Group when compared to the Control Group at 90 days (p < 0.05). Regarding microbiological analysis, the Test Group presented proportions of red and orange complexes significantly lower and proportions of blue complex significantly higher than the Control Group at 90 days (p < 0.05). Immunological analysis demonstrated significantly lower levels of IL-1&beta; in the Control Group when compared to the Test Group at 14, 30 and 90 days (p < 0.05). Only the Test Group presented significantly higher IL-10 levels in relation to baseline values at 30 days (p < 0.05). Intra and inter-groups comparisons of the mean levels of TNF-&alpha; did not demonstrate significantly differences. IL-1&beta;/IL-10 ratio was significantly lower in the Test Group than in the Control Group at 90 days (p < 0.05). It can be concluded that repeated aPDT as an adjunct to SRP in the nonsurgical treatment of AP: i) significantly improves clinical periodontal parameters, reducing the need for further treatments at 90 days; ii) eliminates periodontal pathogens of red and orange complexes more effectively and iii) enhances the host immunoinflammatory response, decreasing the levels of proinflammatory cytokines and increasing the levels of anti-inflammatory cytokines.

O tratamento da Periodontite Agressiva (PA) representa um desafio para os clínicos, pois não existem protocolos padronizados para um controle eficiente da doença. Este estudo clínico controlado, aleatório e duplo-cego avaliou o efeito de múltiplas aplicações da Terapia Fotodinâmica antimicrobiana (TFDa) como adjuvante ao tratamento periodontal não cirúrgico (TPnc) em pacientes diagnosticados com PA. Utilizando um modelo de estudo do tipo boca dividida, 20 pacientes com diagnóstico clínico de PA foram tratados com TFDa (Grupo Teste) associada à raspagem e alisamento radicular (RAR) ou apenas RAR (Grupo Controle). As aplicações da TFDa foram realizadas em 4 episódios (dias 0, 2, 7 e 14). Todos os pacientes foram acompanhados por 90 dias. Os seguintes parâmetros clínicos, microbiológicos e imunológicos foram analisados: i) profundidade de bolsa à sondagem (PS) e nível de inserção clínico (NCI); ii) contagem de 40 espécies subgengivais em amostras de placa bacteriana (checkerboard DNA-DNA hybridization); iii) avaliação dos níveis de Interleucina (IL)-1&beta;, IL-10 e Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-&alpha;) no fluido crevicular gengival (Luminex). Os dados obtidos foram estatisticamente analisados. Na análise de bolsas periodontais profundas (PS inicial &ge; 7mm), o Grupo Teste apresentou, aos 90 dias, redução de PS (-3,96 mm ± 0,83) e ganho de inserção clínica (2,77 mm ± 1,05) significativamente maiores (p < 0,05) que aqueles do Grupo Controle (PS = - 2,56 ± 0,72; NCI = 1,75 ± 1,07). Foi constatado, também, um número significativamente menor de bolsas periodontais residuais (PS &ge; 5mm) no Grupo Teste quando comparado ao Grupo Controle aos 90 dias (p < 0,05). Na análise microbiológica, o Grupo Teste apresentou proporções significativamente menores de espécies microbianas dos complexos vermelho e laranja, bem como maiores proporções de espécies do complexo azul quando comparado ao Grupo Controle aos 90 dias (p < 0,05). Na análise imunológica, observou-se níveis de IL-1&beta; no Grupo Controle significativamente maiores que aqueles do Grupo Teste aos 14, 30 e 90 dias (p < 0,05). Em relação aos níveis de IL-10, apenas o Grupo Teste apresentou valores significativamente maiores (p < 0,05) que aqueles do baseline aos 30 dias. Para TNF-&alpha;, não foi possível observar diferenças significativas nas comparações inter e intragrupos em todos os períodos experimentais. O Grupo Teste apresentou razão IL-1&beta;/IL-10 significativamente menor que aquela do Grupo Controle aos 90 dias (p < 0,05). Pode-se concluir que a utilização de aplicações múltiplas da TFDa como recurso adjuvante à TPnc de pacientes com PA: i) melhora significativamente os parâmetros clínicos periodontais, reduzindo a necessidade de tratamentos periodontais adicionais aos 90 dias; ii) elimina de forma mais eficaz periodontopatógenos dos complexos vermelho e laranja; iii) melhora os parâmetros imunoinflamatórios, reduzindo a concentração de citocinas proinflamatórias e aumentando os níveis de citocinas anti-inflamatórias. / Treatment of Aggressive Periodontitis (AP) is challenging for clinicians because there are no standardized protocols for effective disease control. This double-blind randomized controlled clinical trial evaluated the effects of multiple applications of antimicrobial Photodynamic Therapy (aPDT) as an adjunct to scaling and root planning (SRP) on patients diagnosed with AP. Using a split-mouth model, 20 patients with clinical diagnosis of AP were treated with aPDT associated with SRP (Test Group) or SRP alone (Control Group). aPDT applications were performed along with SRP and 2, 7 and 14 days after SRP. All patients were monitored during 90 days. The following clinical, microbiological and immunological parameters were analyzed: i) probing pocket depth (PPD) and clinical attachment level (CAL), ii) counts of 40 subgingival species in plaque samples (checkerboard DNA-DNA hybridization) and iii) levels of interleukin (IL)-1&beta;, IL-10 and tumor necrosis factor (TNF)-&alpha; in gingival crevicular fluid (Luminex). Data were statistically analyzed. In deep periodontal pockets (initial PPD &ge; 7 mm), the Test Group presented a decrease in PPD (-3.96 ± 0.83 mm) and a clinical attachment gain (2.77 ± 1.05 mm) significantly higher than the Control Group (PPD = - 2.56 ± 0.72 mm; CAL = 1.75 ± 1.07 mm) at 90 days (p < 0.05). It was also observed significantly fewer residual periodontal pockets (PPD &ge; 5 mm) in the Test Group when compared to the Control Group at 90 days (p < 0.05). Regarding microbiological analysis, the Test Group presented proportions of red and orange complexes significantly lower and proportions of blue complex significantly higher than the Control Group at 90 days (p < 0.05). Immunological analysis demonstrated significantly lower levels of IL-1&beta; in the Control Group when compared to the Test Group at 14, 30 and 90 days (p < 0.05). Only the Test Group presented significantly higher IL-10 levels in relation to baseline values at 30 days (p < 0.05). Intra and inter-groups comparisons of the mean levels of TNF-&alpha; did not demonstrate significantly differences. IL-1&beta;/IL-10 ratio was significantly lower in the Test Group than in the Control Group at 90 days (p < 0.05). It can be concluded that repeated aPDT as an adjunct to SRP in the nonsurgical treatment of AP: i) significantly improves clinical periodontal parameters, reducing the need for further treatments at 90 days; ii) eliminates periodontal pathogens of red and orange complexes more effectively and iii) enhances the host immunoinflammatory response, decreasing the levels of proinflammatory cytokines and increasing the levels of anti-inflammatory cytokines.

A periodontite é uma doença multifatorial iniciada pela presença de biofilme bacteriano que interage com os mecanismos de defesa do hospedeiro e ocasiona intensa resposta inflamatória e destruição tecidual. A Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (TFDa) proporciona uma ação antibacteriana de maneira localizada, utilizando uma fonte de luz e um fármaco fotossensível. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da TFDa, utilizando o fotopolimerizador LED como fonte de luz e a eritrosina como fotossensibilizador, no tratamento de periodontite induzida por ligadura, em ratos, por meio das análises histomorfométrica, imunohistoquímica e imunoenzimática. Em 60 ratos, a doença periodontal foi induzida pela colocação de ligaduras nos primeiros molares inferiores e segundos molares superiores, durante 14 dias. Os animais foram então divididos em seis grupos experimentais: G1 (n=9) - Sem tratamento; G2 (n=9) - Raspagem e alisamento radicular (RAR); G3 (n=9) - Light Emitting Diode (LED), com um comprimento de onda de 450nm e intensidade de luz de 67mW/cm², 10 segundos/sítio (totalizando 1 minuto/dente); G4 (n=9) - RAR + TFDa (Eritrosina 1,0mg/mL + LED); G5 (n=9) TFDa. G6 (n=9) - Eritrosina. O estudo também teve 2 controles internos: sem doença (SDP) (n=3) e máxima doença (DP+) (n=3). Os animais foram eutanasiados nos períodos de 3, 7 e 15 dias após a remoção das ligaduras (18 animais para cada tempo, 3 de cada um dos grupos experimentais), havendo preparo de material para avaliações histomorfométrica, imunohistoquímica (molares inferiores), e imunoenzimática (molares superiores). Na análise histomorfométrica da perda óssea linear, o G4 apresentou diferença significante no tempo de 3 e 15 dias em relação a todos os grupos experimentais e aos 7 dias em relação ao G1, G2, G3. Na análise imunohistoquímica, os menores níveis absolutos de osteopontina estão relacionados ao G4. A marcação das células TRAP positivas demonstrou diferenças significantes no tempo de 3 dias entre o G4(34) quando comparado com o G2(57) e DP+(67). Na avaliação imunoenzimática dos níveis de RANKL, o G4 (3.69 pg/ml) apresentou diferenças significantes em relação ao G1 (6.44 pg/ml), G2 (5.84 pg/ml), G3 (6.19 pg/ml), G5 (5.94 pg/ml) e DP+ (6.87 pg/ml). A quantificação de OPG mostrou diferenças significantes nos períodos de 3 e 7 dias entre o G4 e todos os grupos. Aos 15 dias, essas diferenças foram: G4 versus G3, G5, G6 e DP+. A relação RANKL/OPG apresentou, aos 3 dias, diferenças significantes entre o grupo G4 e todos os grupos experimentais (para todas as análises, p<0,05). Concluiu-se que o uso coadjuvante da TFDa, utilizando eritrosina e fonte de luz LED, em associação à raspagem e alisamento radicular apresentou os melhores resultados terapêuticos no tratamento da doença periodontal induzida por ligaduras em ratos. / Periodontal disease (PD) is an inflammatory destructive disease that targets tooth-supporting structures through complex and multifactorial processes. Scaling and root planing (SRP) may not be always affective in preventing disease progression. Therefore, adjunctive methods have been proposed to improve clinical outcomes after periodontal therapy, such as the antimicrobial photodynamic therapy (aPDT). aPDT for human infections is based on the concept that an agent (a photosensitizer), which absorbs light, can be preferentially taken up by bacteria and subsequently activated by light of the appropriate wavelength in the presence of oxygen to generate singlet oxygen and free radicals that are cytotoxic to microorganisms. The aim of this study was to evaluate the adjunctive effect of aPDT to SRP on induced PD in rats, analysing histomorphometrical, immunohistochemical and immunoenzymatic parameters. Ligatures were placed around the mandibular first molars and maxillary second molars of 60 rats to induce PD. After 14 days of PD induction, the ligatures were removed and the animals were divided in six groups, which received the following treatments: G1(n=09): no treatment was done; G2(n=09): SRP; G3(n=09): Light Emitting Diode (LED), with a wavelength of 450nm and a maximum power of 67 mW/cm², 10 seconds/site (totaling 1 minute/tooth); G4(n=09): SRP + aPDT (Erythrosine dye 1,0 mg/mL + LED as described for G3); G5(n=9): aPDT; G6(n=9): Erythrosine. The animals were euthanized 3, 7 and 15 days after treatment (18 animals for each time, 3 of each experimental group). In addition to the six experimental groups, there were two internal control groups: Group without PD (WPD) induction (n=3); and Group with maximum bone loss (MBL), euthanized immediately after ligature removal (n=3). In the histomorphometrical analysis of linear bone loss, G4 showed statistically significant differences to other experimental groups after 3 and 15 days, and to G1, G2 and G3 after 7 days. Immunohistochemically, counting of TRAP positive cells was significantly lower in G4 (34) when compared to G2 (57) and MBL (67) groups after 3 days. The immunoenzymatic assay (Luminex xMAP) showed significantly lower levels of receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL) for G4 (3.69 pg/ml) when compared to G1 (6.44 pg/ml), G2 (5.84 pg/ml), G3 (6.19 pg/ml), G5 (5.94 pg/ml) and MBL (6.87 pg/ml) after 3 days. Osteoprotegerin (OPG) quantification showed statistically significant differences between G4 and all other experimental groups after 3 and 7 days. The RANKL/OPG ratio, after 3 days, showed statistically significant differences between G4 and all other experimental groups (for all analysis, ANOVA one way + Tukey´s post-hoc test, p < 0.05). It was concluded that the adjunctive use of aPDT (Erythrosine dye + LED) in combination with scaling and root planing showed the best therapeutic results in the treatment of ligature-induced periodontal disease in rats.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2018. / A nanobiotecnologia, que aplica técnicas, princípios biológicos e nanotecnológicos para melhorar a compreensão e transformação dos biossistemas, é oferecida como proposta de inovação tecnológica para tratamento do câncer. Dentre os avanços da nanobiotecnologia nos diversos setores do campo da saúde, destacam-se aqueles aplicados à terapia fotodinâmica (TFD), modalidade terapêutica minimamente invasiva e cujo uso é clinicamente aprovado para o tratamento de diferentes tipos de doenças oncológicas e não oncológicas. A TFD é capaz não apenas de destruir o tumor devido à sua toxicidade direta às células cancerosas, mas também de causar infarto do tecido canceroso por destruir a microvasculatura tumoral, bem como por ativar o sistema imunitário contra antígenos tumorais. Diante disso, o objetivo principal deste estudo foi avaliar a indução de morte celular imunogênica (MCI) causada pela TFD mediada por nanoemulsão com cloreto de alumínio-ftalocianina (TFD-NE-AlFtCl) em células de câncer de mama murino in vitro e in vivo. Para tanto, foi realizada a produção de um novo lote da NE-AlFtCl, que foi caracterizado e teve a estabilidade para suas prorpiedades coloidais, fotofísicas e físico-química avaliada. Concomitantemente aos testes de estabilidade, a NE-AlFtCL foi utilizada para avaliação do perfil de internalização pelas células 4T1, bem como para a avaliação de qual via de endocitose estava sendo utilizada para internalização, além da investigação de sua colocalização subcelular. Após a avaliação dos perfis de internalização, da via endocítica e da colocalização, as células 4T1 foram submetidas a diferentes protocolos da TFD-NE-AlFtCl, variando os tempos e doses de energia (J/cm²). As células 4T1 foram avaliadas quanto à via de morte desencadeada pela exposição a TFD-NE-AlFtCl. Foi verificada também a emissão de padrões moleculares associados a dano (DAMP) —HSP70, HSP90, Calreticulina, HMGB1 e IL-1β—, fator-chave para a indução de morte celular imunogênica (MCI). Por fim, após a avaliação dos perfis de liberação desses DAMP, as células pré-tratadas com TFD-NE-AlFtCl foram utilizadas como vacina em camundongos da espécie Balb-C a fim de verificar a ativação de uma resposta antitumoral. Para tanto, após as vacinações, os animais foram submetidos ao enxerto de células 4T1 viáveis, e monitorados quanto ao surgimento de tumor, volume tumoral e sobrevida durante todo experimento. O tempo de 15 minutos foi suficiente para identificação do FS AlFtCl dentro das células 4T1 e essa internalização foi dependente de caveolinas. Os resultados obtidos quanto à internalização e à colocalização subcelular do FS AlFtCl nas organelas núcleo, lisossomos, mitocôndrias e no retículo endoplasmático (RE) demonstraram diferenças na retenção do FS AlFtCl. Sendo que, os tempos de 15, 30 e 45 minutos apresentaram uma maior quantidade de FS AlFtCl nas organelas supracitadas, quando comparados como os tempos de 60, 120 e 240 minutos. Os diferentes protocolos da TFD-NE-AlFtCl aplicados nas células foram eficazes quanto à diminuição da viabilidade das células 4T1. Vale ressaltar ainda que à medida em que o tempo e a dose de energia foram variados, houve variação do perfil de morte e da via de morte ocasionada (apoptose/necrose). Os tratamentos com TFD-NE-AlFtCl 9,01 nM 25 J/cm² apresentaram maior perfil de apoptose, o que refletiu numa maior emissão de DAMP: HSP70, HSP90, Calreticulina, HMGB1 e IL-1β, quando comparados com os demais protocolos. Esses resultados apresentados pelo tratamento com TFD-NE-AlFtCl 9,01 nM 25 J/cm² se refletiram também, na avaliação in vivo, sendo verificada uma maior resistência dos animais quanto ao surgimento do tumor, a apresentação de menores volumes tumorais e maior sobrevida. Contudo, o presente estudo conclui que os diferentes protocolos de TFD-NE-AlFtCl aplicados às células 4T1 foram capazes de fazer a emissão dos DAMP — sendo esse requisito chave para ação de uma ativação de MCI e uma ativação antitumoral — porém, essas emissões ocorreram de formas diferentes mediante as alterações de tempo de dose de energia. Conclui-se também que a aplicação da TFD-NE-AlFtCl 9,01 nM 25 J/cm² mais branda demonstrou melhores resultados quanto ao surgimento e desenvolvimento do tumor, além de apresentaremm uma maior taxa de sobrevida. / Nanobiotechnology, which applies techniques, biological principles and nanotechnologies that improve the understanding and transformation of biosystems, is offered as a proposal of technological innovation for the treatment of cancer. Among the advances in nanobiotechnology in the various sectors of the health field, the most important are those applied to photodynamic therapy (PDT), a minimally invasive therapeutic modality and whose use is clinically approved for the treatment of different types of oncological and non-oncological diseases. PDT is capable not only of destroying the tumor due to its direct toxicity to the cancer cells but also by causing infarction of the cancerous tissue by destroying the tumor microvasculature as well as by activating the immune system against tumor antigens. Therefore, the main objective of these studies was to evaluate the induction of immunogenic cell death (ICD) of nanoemulsion-mediated PDT with aluminum chloride-phthalocyanine (PDT-NE-AlFtCl) in murine breast cancer cells in vitro and in vivo. For this, the production of a new batch of NE-AlFtCl was carried out, which was characterized and had its stability for its colloidal, photophysical and physicochemical properties evaluated. In parallel to the stability tests, NE-AlFtCL was used to evaluate the internalization profile by 4T1 cells, as well as to evaluate which pathway of endocytosis was being used for internalization, and to evaluate its subcellular colocalization. After the evaluation of the internalization profiles, the endocytic pathway and colocalization, the 4T1 cells were submitted to different protocols of the PDT-NE-AlFtCl, varying the time and energy doses (J/cm²). 4T1 cells were evaluated for the path of death triggered by exposure to PDT-NE-AlFtCl. DAMPs—HSP70, HSP90, Calreticulin, HMGB1 and IL-1β—, a key factor for the induction of immunogenic cell death (ICD), were also verified. Finally, after evaluation of the release profiles of these DAMPs, cells that we pretreated with PDT-NE-AlFtCl were used as vaccine in mice of the Balb-C species in order to verify the activation of an antitumor response. To do this, after the vaccinations, the animals were submitted to the grafting of viable 4T1 cells and monitored for appearance of tumor, tumor volume and survival throughout the experiment. The time of 15 minutes was sufficient for identification of the FS AlFtCl within the 4T1 cells and this internalization was dependent on caveolinas. The results obtained on the internalization and the subcellular colocalization of FS AlFtCl in the nucleus, lysosomes, mitochondria and in the endoplasmic reticulum (ER) showed differences in the retention of FS AlFtCl. The times of 15, 30 and 45 minutes showed a higher amount of FS AlFtCl in the aforementioned organelles when compared with the times of 60, 120 and 240 minutes. The different protocols of PDT-NE-AlFtCl applied in cells were effective in decreasing the viability of the 4T1 cells. It is worth noting that as time and energy dose were varied, there was variation of the death profile and of the way of death (apoptosis / necrosis). Treatments with 9.01 nM PDT-25 J/cm² had a higher apoptosis profile, which reflected in a higher emission of DAMPs: HSP70, HSP90, Calreticulin, HMGB1 and IL-1β, when compared to the other protocols. These results presented by the treatment with PDT-NE-AlFtCl 9.01 nM 25 J /cm2 also reflected in the in vivo evaluation, which demonstrated a greater resistance of the animals regarding the appearance of the tumor, the presentation of smaller tumor volumes and greater survival rates. However, the present study concludes that the different PDT-NE-AlFtCl protocols applied to the 4T1 cells were able to make the DAMPs emission — this being a key requirement for the action of ICD activation and antitumor activation —; it is worth mentioning that these emissions occurred in different ways regarding modification in time and energy doses. It was also concluded that the application of the milder 9,01 nM 25 J / cm2 PDT-NE-AlFtCl demonstrated better results regarding the occurrence and development of the tumor, besides presenting better survival rates.

O conceito de PDT é a fotoindução da citotoxicidade das células proliferativas envolvendo um agente fotossensibilizador, uma fonte de luz e oxigênio. Apesar de ser uma terapia eficiente no tratamento de várias neoplasias, a PDT apresenta algumas limitações dentre as quais a não seletividade em células do tecido hepático.O presente trabalho avaliou a correlação entre penetração luminosa e necrose, assim como a extensão da mesma em função da concentração do fotossensibilizador utilizado (Photogem&#61666;) e de três diferentes doses de energia. A transição do epitélio necrosado e do epitélio sadio, foi realizada após a irradiação de fígados normais de ratos previamente fotossensibilizados. O acúmulo do Photogem, administrado via endovenosa, no fígado, foi investigado através da espectroscopia de fluorescência. As fontes de luz utilizadas para irradiação foram um laser de diodo de 630nm e um dispositivo a base de LEDs (diodos emissores de luz). Observamos que o tecido hepático normal, fotossensibilizado, apresenta suas características ópticas alteradas, evidenciadas nos estudos de penetração da luz e alteração térmica durante a irradiação, refletindo na profundidade da necrose. Verificamos que a presença do FS no tecido alvo diminui a penetração da luz, levando a um aumento da temperatura, devido à grande quantidade de energia absorvida pelo FS, a qual é dissipada na forma de calor. Notamos uma abrupta delineação da necrose correspondendo à queda de intensidade luminosa no tecido iluminado. A profundidade de necrose obtida com o uso do LED apresentou uma pequena variação, devido à linha espectral do mesmo ser mais larga, quando comparado ao laser. Histologicamente o tecido hepático e irradiado apresentou necrose coagulativa, infiltrado inflamatório neutrofílico e necrose da veia centrolobular em todos os grupos experimentais; também observamos uma nítida delimitação entre o tecido epitelial normal e o tecido epitelial fotossensibilizado. Estes resultados serão importantes para o desenvolvimento de estratégias para um possível protocolo para aplicação da PDT em tumores malignos hepáticos. / The PDT concept is the photo induction of the citotoxicity of proliferating cells involving a photosensitizer agent, a light source and oxygen. Despite being an efficient therapy on the treatment of several neoplasias, PDT presents some restrictions including the non-selectivity in hepatic tissue cells. This work evaluated the correlation between light penetration and necrosis, as well as the extension of such as function of the concentration of the photosensitizer used (Photogem) and three different doses of energy. The necrosed epithelium and healthy epithelium transition was performed after the irradiation of normal livers of previously photosensitized rats. The Photogem accumulation, intravenously administrated, on the liver was investigated through fluorescence spectroscopy. The light sources used for irradiation were: diode laser operating at 630 nm and a LEDs (Light Emitting Diode) device. We observe that the photosensitized normal hepatic tissue presents its optical characteristics altered, which was previously evidenced on the studies of light penetration and thermal alteration during the irradiation, altering the necrosis depth. We checked that the photosensitizer presence on the target tissue decreases the light penetration leading to a temperature increase, due to a large amount of energy absorbed by the photosensitizer, which is dissipated by means of heat. We noticed an abrupt necrosis delineation corresponding to the drop of the light intensity on the irradiated tissue. When the LED was used, the necrosis depth presented little variation, due to its spectral line being larger when compared to the laser’s spectral line. Histological, the irradiated hepatic tissue presented coagulative necrosis, inflammatory infiltration neutrophilic and centrilobular vein necrosis in all experimental groups, we also observed a clear delimitation between normal epithelial tissue and photosensitized tissue. These results will be important to the development of strategies for a possible protocol for the PDT application on hepatic malign tumors.

Entre os métodos de prevenção da cárie dentária, os controles mecânico e químico do biofilme dentário são de grande relevância neste processo. O controle mecânico é eficaz desde que executado diariamente e sistematicamente envolver todas as superfícies dentárias expostas ao meio bucal. Ele pode ser realizado pelo odontólogo por meio da profilaxia profissional e pelo próprio paciente pela escovação dentária. O controle químico do biofilme dentário deve ser empregado de forma suplementar, quando o controle mecânico não puder ser realizado diariamente ou se for realizado de forma inadequada acarretando o risco do acúmulo do biofilme dentário e como consequência, a ocorrência de lesões de cárie dentária e/ou da doença periodontal. O ideal seria associar ambos os métodos, para que um compense a deficiência do outro. É nesta direção que inúmeros estudos são feitos nos últimos anos. Para o controle químico, são relatadas na literatura inúmeras substâncias antimicrobianas. Dentre os agentes químicos recomendados, a clorexidina (CLX) tem se mostrado eficiente para esta finalidade, porém, sua aplicação apresenta limitações como: manchamento de áreas desmineralizadas dos dentes e perda do paladar, condições estas que limitam seu uso por tempo prolongado. Sendo assim, a busca de alternativas para o controle microbiano do biofilme dentário é de grande relevância para se somar aos esforços ora empreendidos neste sentido. Nas últimas décadas o emprego da luz associada a corantes surgiu como um tratamento alternativo ao uso de agentes antimicrobianos tradicionais. Este tratamento é chamado terapia fotodinâmica (TFD), sendo recentemente também chamado de Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (TFDA). Na TFDA, a luz interage com o corante que está associado ao microorganismo, sendo capaz de inibir sua proliferação ou eliminá-lo completamente. Poucos são os estudos que avaliam a ação antimicrobiana da TFD sobre biofilmes cariogênicos. A comprovação da eficácia dessa terapia sobre o biofilme dentário humano poderá ter um impacto positivo para a Odontologia, favorecendo a implantação de novos protocolos de controle químico do mesmo. Este estudo teve como objetivo analisar comparativamente o efeito da clorexidina e da TFDA (com dois tipos de fotossensibilizadores: Azul de Toluidina O (TBO) e Clorofila Líquida (CL)) sobre biofilmes dentários humanos formados in situ. Voluntários utilizaram um dispositivo intrapalatino contendo espécimes de esmalte dental, sobre os quais biofilme dentário foi formado. Após 48 horas, diferentes terapias foram aplicadas sobre o biofilme: (1) água destilada: controle negativo; (2)CLX; (3) irradiação por laser; (4) TBO; (5) TBO +laser; (6) CL; (7) CL + laser. O biofilme então foi coletado e solubilizado. Em seguida, amostras foram semeadas em placas de Petri com diferentes meios de cultura, para contagem do número de microrganismos totais, estreptococos totais, Streptococcos mutans, Lactobacilos e Candida albicans. Amostras também foram coradas com Laranja de Acridina e visualizadas em microscopia de fluorescência, para análise da viabilidade das células presentes. Os resultados dos plaqueamentos apenas nos deram informações sobre os microrganismos totais e estreptococos totais, mostrando que a única redução significante dos microorganismos em relação ao grupo (1) ocorreu no grupo tratado por CLX (2). As outras terapias mostraram uma sensível redução. A viabilidade por microscopia por fluorescência se mostrou semelhante em todos os grupos. A clorexidina, portanto, comprovou seu efeito antimicrobiano, porém mais estudos precisam ser realizados para verificar o real papel da TFD sobre biofilme dentário humano. / The mechanical and chemical controls of dental plaque are important methods of caries prevention. The mechanical control is efficient if its run properly and daily. It can be made by a dentist (professional cleaning) or by patients themselves (toothbrushing). The chemical control should be used additionally, when the mechanical control cant be performed properly, them the biofilm can accumulate and in consequence, there are risks of dental caries or periodontal disease. For chemical control, many antimicrobial substances are related in literature. Several studies have shown that chlorexidine (CLX) is an effective antimicrobial substance against dental plaque. However, it presents some limitations like: tooth staining, loss of taste, conditions that limit its use by prolonged periods. Therefore, the search by new alternatives in microbial control of plaque is very important for improvement the treatment. In last decades, the use of light for activation of a photosensitizer appears like an alternative treatment with antimicrobial function. This treatment is called Photodynamic Therapy (PDT), recently Photochemotherapy (PACT). In PACT, the light activates a photosensitizer that is bond in microorganism and it can kill it or inhibit its growing. If this treatment is effective on human dental plaque, it will have positive impact for Dentistry and new protocols of chemical control will be developed. The present study aim was analyze the chlorexidine effect and the PDT effect (using Toluidine blue (TBO) and Liquid Chlorophyll (LC) like photosensitizer) in human natural dental plaque formed in situ. Volunteers wore a palatal appliance containing bovine enamel blocks, where the biofilm was formed. After 48 hours, different therapies were performed on plaque: (1) distilled water: negative control; (2) CLX; (3) Laser irradiation; (4) TBO; (5) TBO + Laser; (6) CL; (7) CL + Laser. The plaque samples were collected and dispersed. Next, serial dilutions were prepared and seeded onto different culture broth for the determination of the number of colony-forming units per gram (CFU/g) of total microorganisms, total Streptococcus, Streptococcus mutans, Lactobacillus and C. albicans. Samples were stained with acridine orange to analyze cells viability. The results can reveal only information about total microorganism and total Streptococcus. When the groups (2-7) were compared with the group (1), significant microbial reduction was observed only in group treated with CLX (3). The other therapies showed only a discrete reduction in relation of group (1). The cell viability showed similar results in all groups. Therefore, the CLX proved its antimicrobial effect. More studies are necessary for exact evaluation of effect of TFD on dental plaque human.