Bladder cancer is one of the commoner malignancies in humans and current treatments for invasive disease typically give a five year survival rate of around fifty percent. Current chemotherapeutic agents increase survival by a small amount; clearly there is the need for improved treatments and for this, novel targets need to be identified. One putative target is the Fos family member Fos-related antigen-1 (Fra-1), which form part of the AP-1 transcription factor complex. Fra-1 is elevated in numerous human malignancies and regulates the transcription of genes involved in many aspects of the malignant process, such as migration and invasion. Regulatory control of Fra-1 has been incompletely studied to date; it is known that MAP Kinase dependent signalling can influence Fra-1 accumulation but other aspects of control are only now being elucidated. This thesis demonstrates that Fra-1 is present in the majority of bladder cancers, that it is regulated by the structure of the C-terminus and MAP Kinase dependent phosphorylation of the amino acids Ser[superscript 252] and Ser[superscript 265], and undergoes proteasomal degradation. This highlights the potential role of Fra-1 as a novel therapeutic target and provides more information on the regulation of Fra-1 which may be targeted with novel agents.

Les cancers du sein triple négatifs (TNBC) ne bénéficient d’aucune thérapie ciblée et restent incurables. L’identification de nouvelles cibles moléculaires diagnostiques et surtout, thérapeutiques constitue donc un enjeu majeur pour le traitement de ces cancers. Fra-1 et Fra-2, deux constituants du complexe transcriptionnel AP-1, sont surexprimés dans les TNBC où ils participent à l’agressivité tumorale et/ou la métastatisation. Les gènes cibles de Fra-1 et Fra-2, ainsi que les mécanismes moléculaires via lesquels ils gouvernent la transcription de leurs gènes cibles sont très peu caractérisés. Dans ce contexte, l’objectif général de ma thèse à été d’identifier les gènes codants sous contrôle de Fra-1 et/ou Fra-2 et de caractériser les sites de fixation de Fra-1 et Fra-2 sur la chromatine pour identifier des cibles directes, en combinant des approches transcriptomiques et génomiques combinées à l’interférence à l’ARN dans la lignée modèle MDA-MB231. Les résultats obtenus, associés à l’analyse de banques de données humaines, ont permis la sélection de gènes cibles pour les études mécanistiques et fonctionnelles. Le gène HMGA1, choisi en raison de son rôle maintenant bien établi dans l’agressivité des tumeurs épithéliales, a fait l’objet d’une étude portant sur les mécanismes transcriptionnels gouvernés par Fra-1 et/ou Fra-2 pour sa régulation. L’étude fonctionnelle a été focalisée sur CD68 dont l’expression est fortement induite par Fra-1 et Fra-2. CD68 code pour une protéine transmembranaire dont la fonction n’est pas clairement établie et dont l’implication dans le phénotype tumoral n’a jamais été étudiée. / Triple negative breast cancers (TNBC) are characterized by a poor prognosis and no targeted therapy is currently available. The identification of new diagnostic and therapeutic targets is crucial for the treatment of these cancers. Fra-1 and Fra-2, two members of the AP-1 transcriptional complex, are frequently overexpressed in TNBC, where they contribute to the tumorigenic phenotype. The panel of genes under the control of Fra-1 and/or Fra-2 in TNBC, as well as the molecular mechanisms by which they control their target gene expression are mostly unknown. The aim of my thesis was to identify the panel of genes controlled by Fra-1 and/or Fra-2 in TNBC and to characterize the binding sites of Fra-1 and Fra-2 on chromatin to select direct targets for further studies, by using transcriptomic and ChIP-seq approaches combined to RNAi in the model cell line MDA-MB231. The results allowed us to select target genes for transcriptional and functional studies. The study of the transcriptional mechanisms governed by Fra-1 and/or Fra-2 was carried out on the HMGA1 gene, already known for its crucial role in the aggressiveness of epithelial tumours. The fonctional study was focused on CD68, as its expression in highly induced by Fra-1 and Fra-2. CD68 encodes a transmembrane protein which cellular fonction is still not known and its potential role in tumorigenesis has not been studied yet.

Fra-1 appartient à la famille des facteurs de transcription AP-1. Son expression est particulièrement élevée dans les cellules de cancer du sein qui n'expriment pas le récepteur aux œstrogènes (RE-), c'est-à-dire les cellules les plus agressives. L'inhibition de Fra-1 dans ces cellules entraîne une diminution de la motilité, de l'invasion et de la prolifération, mais elle entraîne aussi de profonds changements de morphologie. Les cellules RE-, qui présentent un phénotype mésenchymateux s'arrondissent et établissent un plus grand nombre de contacts cellule-cellule après l'inhibition de Fra-1. Dans les cellules RE-, la β-caténine est localisée au noyau ou dans le cytoplasme, ce qui est un marqueur de mauvais pronostic. Au cours de cette thèse, j'ai montré que Fra-1 régule la localisation nucléaire de la β-caténine et ainsi régule son activité transcriptionelle en agissant très tardivement sur la voie Wnt. J'ai également mis en évidence une interaction physique directe entre Fra-1 et la β-caténine qui pourrait être responsable de cet effet. De plus, l'analyse de microarrays par RT-QPCR a révélé la régulation d'autres gènes comme la mœsine, la fibronectine et l'extracellular matrix protein 1, qui pourraient également jouer un rôle dans la régulation de l'agressivité tumorale par Fra-1. Par ailleurs, Fra-1 est une protéine instable et nous avons montré qu'elle est phosphorylée et stabilisée par PKCθ. Fra-1 est d'ailleurs nécessaire à l'effet de la kinase sur la motilité cellulaire. / Fra-1 is a member of the AP-1 transcription factor family. It is aberrantly expressed in breast cancer cells lacking Estrogen Receptor (ER-) expression, which are the most aggressive ones. Fra-1 inhibition in these cells leads to a decreased in motility, invasion and proliferation, but also to deep morphologic changes. ER- cells, which present a mesenchymal phenotype, become rounder and establish a greater number of cell-cell contacts after Fra-1 inhibition. In ER- cells, β-catenin is nuclear or cytoplasmic, which is considering as a poor prognosis marker. During this PhD, I demonstrate that Fra-1, which acts very downstream in the Wnt/β-catenin signaling pathway, regulates the nuclear localization of β-catenin leading to up-regulation transcriptional activity of β-catenin. I also found that Fra-1 directly interacts with β-catenin. In addition, RT-QPCR microarrays analysis has revealed the regulation of other genes such as mœsin, fibronectin and extracellular matrix protein 1, which might also take part in the tumoral aggressiveness regulated by Fra-1. Moreover, we show that Fra-1, which is an unstable protein, is phosphorylated and stabilized by PKCθ. Furthermore, Fra-1 is necessary to mediate the kinase effect on cell motility.

Le complexe transcriptionnel AP-1 est une famille ubiquitaire de facteurs de transcription dimériques. Ses composants les mieux étudiés sont les membres des familles multigéniques Fos et Jun. Les mécanismes transcriptionnels gouvernés par ce complexe sont encore mal caractérisés, en raison du grand nombre de dimères AP-1 possibles, de l’abondance et de l’activité finement régulées de ses constituants qui dépendent des contextes cellulaires et physiopathologiques. De plus, les limitations techniques ont longtemps donné l'impression que AP-1 régule l’expression de ses gènes cibles en se fixant principalement à proximité de leurs promoteurs. Fra-1 est la protéine de la famille Fos la plus souvent impliquée dans les cancers épithéliaux. En particulier, elle est surexprimée dans les cancers du sein triple négatifs (TNBCs) où elle contribue à la tumorigenèse et à l'agressivité tumorale par des effets pléiotropes. Dans ce contexte, l’objectif de mes travaux de thèse était d’aboutir à une meilleure compréhension des actions transcriptionnelles de Fra-1 au niveau du génome dans une lignée cellulaire TNBC de référence, la lignée MDA-MB-231. Pour ce faire, j'ai combiné des données transcriptomiques avec des données de ChIP-seq et de NG-Capture C (technique à haute résolution et à haut débit dérivée du 3C). J'ai également inclus dans ces études le membre Fra-2, de la famille Fos, qui présente la même spécificité de fixation à l’ADN et est également exprimé dans les TNBCs, bien qu'à un niveau beaucoup plus bas, où il contribue aussi au phénotype tumoral. En accord avec leurs effets pléiotropes, Fra-1 et Fra-2 activent ou répriment, soit individuellement soit de façon redondante ou complémentaire, l’expression de nombreux gènes associés à une large gamme de processus biologiques. Il est intéressant de noter que la régulation des gènes cibles est rarement due à la liaison de Fra-1 et/ou Fra-2 au niveau des régions promotrices de ces gènes mais fait intervenir leur liaison sur des enhancers distaux. Mes résultats de NG-Capture C suggèrent la présence d’interactions chromatiniennes à longue distance enhancer/promoteur, ainsi que des réseaux d’enhancers. Ces réseaux contiennent des enhancers liés par Fra-1 et d’autres indépendants de celui-ci. Aucune preuve d’un rôle de Fra-1 dans le contrôle des interactions chromatiniennes au niveau de ces réseaux n'a été trouvée en utilisant un panel de 35 gènes régulés par ce facteur. En parallèle, j'ai abordé les mécanismes de la répression transcriptionnelle médiée par Fra-1, mécanismes très rarement étudiés dans la littérature, en utilisant deux gènes modèles, TGFB2 et SMAD6. Ces études ont mis en évidence des mécanismes différents mis en jeu par Fra-1 pour la répression de ces deux gènes, ce qui montre la complexité des mécanismes de la régulation transcriptionnelle médiée par Fra-1. / The AP-1 transcription complex is a ubiquitous family of dimeric transcription factors. Its best-studied components are the members of the Fos and Jun multigene families. The mechanisms whereby AP-1 exerts its transcriptional actions are still ill-understood due to the wide number of possible AP-1 dimers and the exquisitely regulated abundance and activity of its constituents, that all depend on the cell types and physiopathological contexts. Moreover, technical limitations have long given the impression that AP-1 mostly operates in the vicinity of gene promoters. Fra-1 is the Fos family protein that is most often implicated in epithelial cancers. In particular, it is overexpressed in triple negative breast cancers (TNBCs) where it contributes to tumorigenesis and tumor aggressiveness through pleiotropic effects. Based on this, the aim of my thesis was to gain a more comprehensive view of Fra-1 transcriptional actions at the genome-wide level in the MDA-MB-231 reference TNBC cell line, . To this aim, I have combined transcriptomic data with ChIP-seq and NG-Capture C (high resolution, high throughput 3C-derived technique) data. I have also included in my studies its Fos family kin Fra-2, as it displays the same DNA binding specificity and is also expressed in TNBCs, albeit at a much lower level, where it also contributes to the tumor phenotype. Consistently with their pleiotropic effects, Fra-1 and Fra-2 were found to up- or down-regulate either individually, together or redundantly many genes associated with a wide range of biological processes. Interestingly, the regulation of target genes is rarely due to Fra-1 and Fra-2 binding at gene promoters, but involves their binding to distal enhancers. My NG-Capture C results imply the presence of long-range chromatin interactions in Fra-1 modes of action, as well as enhancer hubs containing Fra-1- and non-Fra-1-binding enhancers. No evidence for a role for Fra-1 in the control of chromatin looping was however found using a panel of 35 Fra-1-regulated genes. Moreover, I have addressed the mechanisms of transcriptional repression mediated by Fra-1, as these have practically never been studied, using two model genes, TGFB2 and SMAD6. These studies underlined different mechanisms employed by Fra-1 for the repression of these genes, embodying the complexity of Fra-1 transcriptional regulation mechanisms.

Le cancer du sein est la principale cause de mortalité par cancer chez la femme. Deux des facteurs de transcription de la famille Fos, Fra-1 et Fra-2, sont surexprimés dans les cancers du sein agressifs et contribuent au phénotype tumoral en favorisant entre autres, la prolifération, la motilité et l'invasivité. De façon surprenante, les mécanismes moléculaires via lesquels Fra-1 et Fra-2 (et plus généralement le complexe transcriptionnel AP-1 dont ils sont des constituants) gouvernent la transcription de leurs gènes cibles sont quasi-inconnus. Dans ce contexte, en combinant diverses approches (immunoprécipitation de chromatine, interférence à l'ARN…), j'ai étudié les mécanismes moléculaires par lesquels Fra-1 et Fra-2 contrôlent la transcription dérégulée du gène de l'urokinase ou uPA (sérine protéase cruciale dans la progression tumorale et l'établissement de métastases) qui est l'un des nouveaux marqueurs utilisés en clinique pour la mise en place des choix thérapeutiques. Mes travaux montrent de façon originale que (i) Fra-1 et Fra-2 agissent de façon non redondante et coopèrent pour réguler l'expression d'uPA via leur fixation sur un enhancer AP-1 localisé à -1,9 kb du site d'initiation de la transcription (TSS), (ii) Fra-2 est nécessaire au recrutement de RNA Pol II au niveau de l'enhancer, tandis que Fra-1 stimule le passage de RNA Pol II de sa forme initiatrice à sa forme élongatrice et (iii) que la polymérase recrutée à l'enhancer rejoint le TSS par un mécanisme de « tracking », très rarement décrit dans la littérature, en produisant de petits ARNs non codants, bidirectionnels et instables. / Breast cancer is the most frequent malignant disease among women. Two transcription factors, Fra-1 and Fra-2, belonging to the Fos family members, are overexpressed in aggressive breast cancers and contribute to the tumorigenic phenotype by favoring proliferation, motility and invasion. Surprisingly, the molecular mechanisms governed by Fra-1 and Fra-2 (and more generally by the AP-1 transcriptional complex, which they are components of) for the transcription of their target genes are still largely unknown. In this context, by combining different approaches (chromatin immunoprecipitation, RNA interference…), I studied the molecular mechanisms orchestrated by Fra-1 and Fra-2 for the expression of the urokinase (or uPA) gene (encoding a serine protease crucial for tumor progression and metastasis), which is one of the new diagnostic markers now taken into consideration for deciding therapeutic strategies. Interestingly, my results show that (i) Fra-1 and Fra-2 have non redundant functions and cooperate for the transcriptional regulation of uPA through their binding to AP-1 enhancer located 1.9 kb upstream of the transcriptional start site (TSS), (ii) Fra-2 is required for the recruitment of RNA Pol II on this enhancer while Fra-1 allows the conversion of RNA Pol II initiating form into its elongating form and (iii) enhancer-recruited RNA Pol II reaches the TSS by a tracking mechanism, mechanism very rarely described in the literature, during which it synthetizes small, unstable bidirectional, non coding RNAs.