Le but de ce travail était d’accroitre notre connaissance des mécanismes qui gouvernent la formation, la spécification et la différentiation des cellules souches, à l’aide du modèle métazoaire non-bilatérien Clytia hemisphaerica. Clytia possède une population particulière de cellules multipotentes appelées cellules interstitielles (i-cells). Ces cellules, présentes au cours du développement larvaire et chez la méduse adulte, sont capables de donner naissances a des cellules somatiques et aux gamètes. Chez les bilatériens, la signalisation Wnt/β-caténine (Wntβc) régule les processus développementaux fondamentaux ainsi que la prolifération, la spécification et la différenciation des cellules souches. Mon travail s’est porté sur l’implication de la signalisation Wntβc dans les dynamiques des i-cells. Mes résultats suggèrent que la signalisation Wntβc est impliquée dans la dernière étape de la différenciation de certains neurones, mais pas pour la spécification du destin cellulaire. D’autre part, j’ai aussi observé qu’en condition contrôle, la formation des i-cells est Wntβc-indépendante et probablement entraînée par le héritage de plasma germinatif contenant les ARNm localisées au pôle animal. Cependant, suite à des expériences de microdissection, j’ai observe que la reformation des i-cells dans la moitie végétative des embryons requérait l’activation de la voie Wntβc. En conclusion, deux mécanismes distincts peuvent conduire à la formation des i-cell pendant l'embryogenèse. Globalement, les résultats obtenus ont fourni une meilleure idée de la façon dont i- cellules et leurs dérivés se posent lors de l'embryogenèse et le développement larvaire. / The aim of this work was to extend our understanding of the mechanisms regulating stem cell formation, specification and differentiation by studies in the non-bilaterian metazoan model Clytia hemisphaerica. Clytia, like other hydrozoan cnidarians, possess a particular population of multipotent stem cells called interstitial cells (i-cells), present during larval development and in the adult medusa, which are able to give rise both to somatic cell types and to gametes.In bilaterian animals Wnt/β-catenin signalling regulates fundamental developmental processes such primary body axis specification, but also regulates stem cell proliferation, lineage specification and differentiation. I investigated the role of Wnt/β-catenin signalling in i-cell specification and differentiation. The results obtained suggest that Wnt/β-catenin signalling is involved in the last step of differentiation for certain neuronal cell types, but not for somatic cell fate choice. In the second part of my study I investigated the role of Wnt/β-catenin signalling in i-cell formation during embryogenesis. The results indicated that during normal development i-cell formation is Wnt/β-catenin independent and probably driven by inheritance of germ plasm containing localised mRNAs from the egg animal pole. In contrast in embryo re-patterning following embryo bisection, Wnt/β-catenin signalling appears to be necessary for de novo i-cell formation in the absence of germ plasm. Thus two distinct mechanisms can lead to i-cell formation during embryogenesis. Overall the results obtained provided a better picture of how i-cells and their derivatives arise during embryogenesis and larval development.

Fra-1 appartient à la famille des facteurs de transcription AP-1. Son expression est particulièrement élevée dans les cellules de cancer du sein qui n'expriment pas le récepteur aux œstrogènes (RE-), c'est-à-dire les cellules les plus agressives. L'inhibition de Fra-1 dans ces cellules entraîne une diminution de la motilité, de l'invasion et de la prolifération, mais elle entraîne aussi de profonds changements de morphologie. Les cellules RE-, qui présentent un phénotype mésenchymateux s'arrondissent et établissent un plus grand nombre de contacts cellule-cellule après l'inhibition de Fra-1. Dans les cellules RE-, la β-caténine est localisée au noyau ou dans le cytoplasme, ce qui est un marqueur de mauvais pronostic. Au cours de cette thèse, j'ai montré que Fra-1 régule la localisation nucléaire de la β-caténine et ainsi régule son activité transcriptionelle en agissant très tardivement sur la voie Wnt. J'ai également mis en évidence une interaction physique directe entre Fra-1 et la β-caténine qui pourrait être responsable de cet effet. De plus, l'analyse de microarrays par RT-QPCR a révélé la régulation d'autres gènes comme la mœsine, la fibronectine et l'extracellular matrix protein 1, qui pourraient également jouer un rôle dans la régulation de l'agressivité tumorale par Fra-1. Par ailleurs, Fra-1 est une protéine instable et nous avons montré qu'elle est phosphorylée et stabilisée par PKCθ. Fra-1 est d'ailleurs nécessaire à l'effet de la kinase sur la motilité cellulaire. / Fra-1 is a member of the AP-1 transcription factor family. It is aberrantly expressed in breast cancer cells lacking Estrogen Receptor (ER-) expression, which are the most aggressive ones. Fra-1 inhibition in these cells leads to a decreased in motility, invasion and proliferation, but also to deep morphologic changes. ER- cells, which present a mesenchymal phenotype, become rounder and establish a greater number of cell-cell contacts after Fra-1 inhibition. In ER- cells, β-catenin is nuclear or cytoplasmic, which is considering as a poor prognosis marker. During this PhD, I demonstrate that Fra-1, which acts very downstream in the Wnt/β-catenin signaling pathway, regulates the nuclear localization of β-catenin leading to up-regulation transcriptional activity of β-catenin. I also found that Fra-1 directly interacts with β-catenin. In addition, RT-QPCR microarrays analysis has revealed the regulation of other genes such as mœsin, fibronectin and extracellular matrix protein 1, which might also take part in the tumoral aggressiveness regulated by Fra-1. Moreover, we show that Fra-1, which is an unstable protein, is phosphorylated and stabilized by PKCθ. Furthermore, Fra-1 is necessary to mediate the kinase effect on cell motility.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est une des principales causes de mortalité par cancer dans le monde. Dans environ 50% des tumeurs, on observe les signes d’une activation de la voie Wnt/β-caténine, causée par une mutation de l’exon 3 du gène CTNNB1 ou par stimulation du récepteur FRZD. Des études transcriptomiques du CHCs ont montré que ces deux modes d’activation étaient associés à des sous-types de tumeurs différents. Nous avons cherché à mieux comprendre les caractéristiques cliniques et le phénotype moléculaire de ces deux sous-types de CHCs. Dans un premier temps, nous avons fait le lien entre l'activation Wnt extracellulaire, un phénotype de cellules cancéreuses souches ou progénitrices et la présence de foyers de fibrose discrète intra-tumorale, observable par examen histopathologique, que nous avons appelés "nids fibreux". Nous avons également mis en évidence HAPLN1, une protéine de la matrice extracellulaire dont l’expression est stimulée par Wnt3a dans un modèle de cellules hépatiques progénitrices HepaRG, comme un nouveau marqueur d’agressivité du CHC. Ces résultats montrent une association entre l’activation Wnt extracellulaire et une agressivité tumorale passant par un remodelage matriciel. Dans un second temps, une Méta-analyse de données publiques de transcriptomique a permis de mettre évidence 4 sous-types de CHCs. La mutation CTNNB1, prédite par l’expression de 5 marqueurs par une méthode développée durant la thèse, était associée à un de ces sous-types et à un bon pronostic clinique. Nous avons également isolé un nouveau sous-type de CHC de bon pronostic exprimant un phénotype de tumeur différenciée et des signatures de métabolisme hépatique périportales. Ce sous-type a probablement été un facteur confondant dans les études précédentes mesurant l’association de la mutation CTNNB1 avec un bon pronostic. Enfin, nous avons mis en évidence une forte association négative entre la mutation CTNNB1 et l’inflammation ainsi que la fibrose tumorale dans trois cohortes indépendantes. Cet effet pourrait être provoqué par une inhibition de NF-κB par la β-caténine mutée, comme suggérée par des résultats préliminaires issue d’un modèle in vitro d’HepaRG mutés T41 stimulés par LPS. Nos résultats suggèrent donc que les deux modes d’activation de la voie Wnt/β-caténine sont associés à des mécanismes moléculaires, des profils d’expression, des phénotypes et des pronostics cliniques très différents. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the third cause of cancer-related death worldwide. Half of them show activation of Wnt/β-catenin pathway, caused by activating CTNNB1 exon 3 mutation of by stimulation of FRZD receptor. Transcriptomic based HCC classifications showed that this two types of activation were associated with distinct tumor subtypes. We tried to better understand the molecular phenotypes and the clinical features associated with these subtypes. In a first part, we linked extracellular Wnt activation with a stem/progenitor phenotype and with fibrous hotspot in HCC. Fibrous hotspot, which were called “fibrous nest”, can be detected by routine anatomic pathology analyses. We also showed that HAPLN1, an extracellular matrix protein induced by Wnt3a in progenitor HepaRG cells, was a new marker of stemness and bad outcome in HCC. Those results shows the associations between extracellular Wnt activation, extracellular matrix remodeling and tumor aggressiveness. In a second part, a transcriptome meta-analysis of 1133 HCCs highlighted 4 robust subclasses. CTNNB1 mutation, predicted by a 5-genes score based method, was associated with one of these subclasses and with good clinical features. We also highlighted a new subclass of CTNNB1 wild type HCCs associated with tumor differentiation, signatures of periportal metabolism and good outcome. This subclass was probably a confounding factor in survival studies comparing HCCs carrying mutant versus those carrying wild-type CTNNB1. Finally, we highlighted strong negative associations between CTNNB1 mutation and inflammation as well as tumor fibrosis in three independent cohorts. Preliminary results of in vitro HepaRG cells mutated for CTNNB1 in T41 and stimulated by LPS suggest an inhibitory effect of β-caténine on NF-κB. In conclusion, our results show that the two types of Wnt activation in HCC are associated with very distinct molecular phenotypes and clinical features.

Contexte: Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est la plus fréquent des tumeurs primitives du foie. Près de 50% des CHC sont causés par une infection par le virus de l'hépatite B (VHB). Au cours des différents stades de l’infection par le VHB, des multiples altérations génétiques et/ou chromosomiques s'accumulent et favorisent ainsi le développement tumoral. Objectives: a) étudier, in vitro et in vivo, le rôle potentiel d’un nouveau gène susceptible d’être impliqué dans la carcinogénèse hépatique : IRF-2 (Interferon regulatory factor 2). Ce gène a été identifié comme fréquemment délété par analyse CGH-SNP dans les CHC liés à l’infection par le VHB. b) caractériser une série de CHC liés au VHB en étudiant le statut viral, les altérations génétiques et l’expression de différents gènes afin de mieux comprendre le rôle du VHB dans l’hépato-carcinogenèse et comparer ces différents paramètres avec une série de CHC non liés au VHB. Résultats : a) Dans une série de 125 CHC, Sandrine Imbeaud, au sein du laboratoire, a effectué une analyse CGH-SNP microarray et a identifié une région commune de délétion homozygote localisée en 4q34.3-35 comprenant le gène IRF-2 dans 4 échantillons. Nous avons ensuite mis en évidence par séquençage des mutations somatiques inactivatrices dans 2 autres tumeurs. In vitro, la sousexpression d’IRF-2 a entrainé une augmentation de la prolifération cellulaire et sa sur-expression a induit une promotion de l'apoptose cellulaire. In vivo, l’extinction d’IRF-2 était responsable de la formation de tumeurs de grande taille. Les 6 tumeurs inactivées pour IRF-2 étaient associées au VHB (p = 0.0003), et les mutations de TP53 et d’IRF-2 étaient mutuellement exclusives. La sousexpression de IRF-2 induisait une sous-expression de TP53 et une forte corrélation entre les expressions protéiques de p53 et de IRF-2 a été observée (r2 = 0,72, p = 0,004). En plus, on a observé que l’expression des gènes cibles directs de TP53 était modulée par le niveau d‘expression d’IRF-2. Nous avons émise l'hypothèse que IRF-2 pourrait altérer la fonction de p53 car IRF-2 est connue pour se lier à MDM2, un régulateur négatif de l’expression de p53. Le traitement des cellules inactivées pour IRF-2 avec MG132, un inhibiteur du protéasome, a induit la restauration de l'expression de p53. In vivo, le traitement avec bortézomib, un inhibiteur du proteasome utilisé en oncologie, a entrainé une régression des tumeurs inactivées pour IRF-2. b) Nous avons caractérisé sur le plan clinique et moléculaire une série de CHC liés au VHB et, ensuite, nous avons comparé nos résultats avec ceux d’une série de CHC liés à autres étiologies. Nous avons montré que les CHC liés au VHB présentaient des caractéristiques cliniques et pathologiques différentes de celles des CHC non liés au VHB : ils survenaient chez des patients plus jeunes (P < 0.0001), d'origine Africaine ou Asiatique (P < 0.0001), avec un taux sérique d'alpha-foeto protéine élevé (P = 0.008) et étaient sur le plan histologique des tumeurs peu différenciés (P = 0.04). Nous avons identifié des mutations inactivatrices du gène HBX dans 71% des tumeurs et dans 33% des tissus non tumoraux adjacents (P < 0.0001). Dans 63% des cas, le nombre de copies virales dans les tumeurs était plus faible que dans les tissus non tumoraux adjacents (P < 0.0001). Le gène TP53 était le gène le plus fréquemment muté dans les CHC liés au VHB (41%, P = 0.0002), avec des mutations R249S présentes dans 14 échantillons (16%, p < 0.0001). Ce type de mutation est classiquement associé à l'aflatoxine B1. Nous avons observé que les mutations de TP53 étaient un prédicteur indépendant de survie uniquement pour les patients infectés par le VHB. Enfin, ... / Pas de résumé en anglais / Introduzione: Il carcinoma epatocellulare (HCC) è il tumore primitivo più comune del fegato. Nel mondo, quasi il 50% di tutti gli HCC sono causati dal virus dell'epatite B (HBV). Durante le fasi dell’ infezione da HBV, si possono accumulare alterazioni genetiche e / o cromosomiche e quindi promuovere lo sviluppo del tumore. Obiettivi: a) analizzare in vitro e in vivo il ruolo potenziale di un nuovo gene potenzialmente coinvolto nella carcinogenesi epatica: IRF-2 (Interferon regulatory factor 2). Questo gene è stato identificato mediante l’analisi CGH-SNP come frequentemente deleto negli HCC correlati all’ HBV. b) caratterizzare una cohorte di HCC correlati all’HBV studiandone lo stato virale, le alterazioni genetiche e l’espressione di differenti geni al fine di comprendere meglio il ruolo di HBV nella carcinogenesis epatocellulare e confrontare questi parametri con una cohorte di HCC a diversa eziologia. Risultati: a) In laboratorio, Sandrine Imbeaud ha condotto un'analisi SNP-CGH microarray su una cohorte di 125 HCC che ha evidenziato una regione deleta in maniera omozigote localizzata sul braccio lungo del cromosoma 4 (4q34.3-35) in 4 campioni tumorali. La regione comprende un unico gene: IRF2. In altri due campioni sono state identificate mutazioni somatiche inattivatrici mediante sequenziamento della regione codante di IRF-2. In vitro, la soppressione di IRF-2 ha indotto un aumento della proliferazione cellulare, al contrario, la sua sovra-espressione ha causato un aumento dell’apoptosi cellulare. In vivo, la soppressione di IRF-2 è responsabile della formazione di tumori più grandi nei topi nude. I 6 tumori mutati per IRF2 sono tutti correlati all’ HBV (p = 0,0003. Nella cohorte di tumori studiati, le mutazioni di TP53 e di IRF-2 erano vicendevolmente esclusive. Inoltre, la soppressione dell’espressione della proteina IRF-2 induceva una riduzione dell’espressione della proteina p53 ed una stretta correlazione tra l’espressione delle due proteine è stata osservata (r2 = 0,72, p = 0,004). Inoltre, abbiamo dimostrato che il livello di espressione di IRF-2 è in grado di modulare l'espressione di alcuni geni target di TP53. Abbiamo, quindi, ipotizzato che IRF2 possa alterare la funzione di p53. Come è noto IRF2 può legarsi a MDM2, un regolatore negativo di p53 che induce la sua degradazione proteasomica. Il trattamento di cellule inattivate per IRF2 con MG132, un inibitore del proteasoma, induceva il restauro dell’espressione di p53. In vivo, il trattamento con bortezomib, chemioterapico inibitore del proteasoma, ha determinato la regressione del tumore inattivato per IRF2. b) 86 HCC correlati all’HBV sono stati caratterizzati dal punto di vista clinico e molecolare ed in seguito sono stati confrontati una serie di 90 HCC correlati ad altre eziologie. Gli HCC correlati all’HBV hanno delle caratteristiche cliniche e patologiche diverse da quelle degli HCC d’altra eziologia: insorgenza in pazienti più giovani (p <0,0001), di origine africana o asiatica (P <0.0001), alfa-fetoproteina sierica elevata (P = 0.008) e scarsa differenziazione istologica (P = 0,04). Mutazioni inattivatrici del gene HBX sono state identificate nel 71% dei tumori e il 33% dei tessuti non tumorali adiacenti (P <0.0001). Nel 63% dei casi, il numero di copie virali nel tessuto tumorale era inferiore rispetto al tessuto non tumorale adiacente (p <0,0001). Il gene TP53 è stato il gene più frequentemente mutato nella serie di HCC correlati a HBV (41%, p = 0,0002), con una considerevole presenza di mutazioni al codone 249 (R249S) (16%, p <0,0001). Questo tipo di mutazione è associate classicamente all’ aflatossina B1. Abbiamo osservato, inoltre, che TP53 mutato era un predittore indipendente di sopravvivenza solo per i pazienti infetti da HBV. Infine, ...