A miopatia miotubular é uma doença genética congênita que afeta a musculatura esquelética e respiratória, causada por mutações no gene MTM1. Apresenta padrão de herança recessivo ligado ao cromossomo X e frequência estimada de 1/50.000 meninos nascidos vivos. O diagnóstico é geralmente realizado através de biopsia muscular, com presença de fibras pequenas com núcleo central, predominância de fibras do tipo I, concentração de miofibrilas na periferia da fibra e região central ocupada por acúmulos de mitocôndrias e glicogênio. O quadro clínico é bastante grave, com manifestação clínica no período neonatal e óbito nos primeiros meses, ou ano de vida. Os pacientes apresentam hipotonia e fraqueza muscular generalizadas, dificuldade de alimentação, ptose palpebral, oftalmoplegia, hérnia inguinal e criptorquidia. Mulheres portadoras das mutações são geralmente assintomáticas, mas diversos casos de heterozigotas sintomáticas têm sido relatados. Pacientes com miopatias congênitas estruturais vem sendo estudados nos últimos 20 anos no Centro de Pesquisa do Genoma Humano e Células Tronco (CPGH-CEL) da Universidade de São Paulo (USP). Atualmente, em razão do avanço das tecnologias de análise molecular do DNA, como o sequenciamento de nova geração (NGS - Next Generation Sequencing), o diagnóstico tem se tornado cada vez mais preciso. No presente trabalho, pacientes de 12 famílias estudadas no CEGH-CEL foram submetidos à triagem mutacional, utilizando técnica de NGS. Onze mutações foram identificadas (c.109 C>T; c.139_142 delAAAG; c.706 A>T; c.1010 G>A, c.1181 A>G, c.1262 G>A, c.1354 -1 G>C, c.1465_1465delC, c.1467 +1 G>A, c.1528 A>T; c.1528 A>T); entre elas 5 já descritas como patogênicas e 6 são novas. Em duas famílias, foram identificadas 4/8 e 2/4 mulheres portadoras apresentando algum nível de manifestação clínica. A análise de desvio de inativação do X revelou desvio aleatório em pelo menos 4 das heterozigotas manifestantes. Além disso, adicionando os casos deste trabalho aos relatados na literatura, a taxa de penetrância da doença foi estimada em 30% em mulheres heterozigotas, o que é compatível com um padrão de penetrância incompleta e poderia explicar a alta frequência de mulheres manifestantes. Uma análise de exomas foi realizada a fim de identificar possíveis genes modificadores que explicassem a variabilidade clínica observada. Foi identificada uma região de 4,2 Mb contendo genes contíguos no cromossomo 19 que pode estar relacionado à modulação do fenótipo / Myotubular myopathy is a rare congenital muscle genetic disease, caused by mutations in the MTM1 gene. With a X-linked recessive inheritance, the disease affects 1/50.000 living born males. The clinical picture is characteristic and very severe, with manifestation in the neonatal period, including generalized hypotonia and muscle weakness, feeding difficulty, palpebral ptosis, ophthalmoplegia, inguinal hernia, and cryptorchidism. Most affected die in the first few months or year of life, and those who survive often depend on care and assistance to perform activities of daily living, as well as require mechanical ventilation and enteral nutrition. Females carrying the mutations are generally asymptomatic, but several cases of symptomatic heterozygotes have been reported, compared to the low frequency of manifesting carriers in other X-recessive diseases. Patients with structural congenital myopathies have been studied in the last 20 years at the Human Genome and Stem Cell Research Center (HUG-CELL) at the University of São Paulo (USP). The diagnosis of myotubular myopathy is usually made with muscle biopsy findings, with small fibers with central nuclei, the predominance of type I fibers, the concentration of myofibrils in the periphery of the fiber and central region occupied by accumulations of mitochondria and glycogen. More recently, with the advancement of DNA molecular analysis technologies, such as Next Generation Sequencing (NGS), the diagnosis has become increasingly accurate. In the present study, patients from 12 families studied in the HUG-CEL were submitted to mutation screening using NGS techniques. Eleven mutations were identified (c.109 C> T; c.139_142 delAAAG; c.706 A> T; c.1010 G> A, c.1181 A> G, c.1262 G> A, c.1354-1 G> C, c.1465_1465delC, c.1467 +1 G> A, c.1528 A> T; c.1528 A> T); among them 6 are novel. In two families, 4/8 and 2/4 female carriers were identified, presenting some level of clinical manifestation. Inactivation skewing analysis of the X chromosome revealed random inactivation in at least 4 of the manifesting carriers. In addition, joining the cases of this work to those reported in the literature, the disease penetrance rate was estimated to be 30% in heterozygous women, which is compatible with an incomplete penetrance pattern and could explain the high frequency of manifesting females. An exome analysis was performed to identify possible modifying genes that explain the observed clinical variability. A region of 4,2 Mb containing contiguous genes was identified on chromosome 19 that may be related to phenotype modulation

Compreender a ecologia microbiana durante a ensilagem é fundamental para neutralizar pontos críticos relacionados à produção de silagens de qualidade por meio da prevenção do crescimento de bactérias oportunistas que possam comprometer a segurança da cadeia alimentar animal e o rendimento da forragem ensilada. Ensilar GSR de milho possibilita a compra estratégica em momentos de baixa nos preços do grão. O objetivo deste estudo foi avaliar por meio de sequenciamento massivo do gene 16S rRNA o efeito da reconstituição da umidade do grão de milho na dinâmica da comunidade bacteriana para confecção dessa silagem. Foram amostrados milhos plantados em dois distintos locais. As plantas usadas no estudo incluíram dois híbridos contrastantes, \"dent\" (AG 1051) e outro \"flint\" (IAC 8390) ensilados de duas maneiras: grão úmido (GU), com a umidade original e grãos secos reconstituídos (GSR) à 30 % U, ambos ensilados por 0 ou 120 dias. Utilizando a plataforma de sequenciamento Ion Torrent, foi possível observar uma redução significativa (P < 0,05) no número de OTUs ao se comparar silagens GSR aos 0 dias em relação aos 120 dias em ambos os híbridos e locais de cultivo do milho. As PCoAs evidenciaram variação na estrutura da comunidade bacteriana em função do período de estocagem do grão com separação nítida das comunidades provenientes de amostras recém colhidas daquelas provenientes de silagens estocadas por 120 dias. Também foi revelado que Proteobacteria (41,8 %), Firmicutes (41,6 %) e Actinobacteria (13,2 %) foram os filos mais abundantes nas silagens, tendo sido evidenciado a ocorrência de sucessão de um microbioma dominado por Proteobacteria e Actinobacteria (aos 0 dias) para um microbioma dominado por Firmicutes, representado principalmente pela ordem Lactobacillales nas silagens terminais (120 dias). Observamos o mesmo efeito ao considerar a amostra local, híbrido e maturidade fisiológica. Os fatores que apresentaram maior influência na distribuição da comunidade bacteriana foram o período de estocagem (36,16 %) e o estágio de maturação do milho (13,3 %). A ordem Lactobacillales foi diferencialmente abundante no milho estocado por 120 dias (70 % da variação) e Enterobacteriales (45 % da variação) aos 0 dias. Em relação ao estágio de maturação do grão observamos variação significativa na abundância relativa de Enterobacteriales em GU (25 % da variação) e Actinomycetales em GSR (21 % da variação). Houve correlação (P = 0,002) do pH com a estrutura da comunidade das silagens, sendo que as maiores variações de pH se deram comparando as amostras no tempo 0 - 120 dias de estocagem. A ordem Lactobacillales foi negativamente correlacionada com o pH (r = - 0,85), enquanto que Enterobacteriales (r = 0,58) e Actinomycetales (r = 0,46) foram positivamente correlacionadas com o pH. A reconstituição do grão de milho não exerceu efeito negativo sobre a população bacteriana das silagens terminais, destacando a viabilidade desta técnica. Até o momento, não há trabalhos publicados apresentando a estrutura e composição da comunidade bacteriana de silagens de GSR por meio de sequenciamento massivo do gene 16S rRNA, confirmando a importância e o ineditismo deste trabalho. / Understanding microbial ecology during ensiling is critical to neutralize critical points related to optimal silage making by preventing the growth of opportunistic bacteria that may compromise the safety of the animal food chain and the yield of silage fodder. Ensiling GSR makes it possible to buy strategically at times of low grain prices. The objective of this study was to evaluate the effect of reconstitution of corn grain on the dynamics of the bacterial community aiming high moisture corn silage processing by means of a massive sequencing of the 16S rRNA gene. Harvest was performed in two different locations. The plants used in the study included two contrasting hybrids, dent (AG 1051) and another flint (IAC 8390) hybrids, ensiled in two ways: wet grain (GU), ensiled with the original moisture or rehydrated dry grains (GSR) ensiled with 30 % of moisture, both ensiled for 0 or 120 days. Using the Ion Torrent sequencing platform, a significant reduction (P <0.05) in the number of OTUs was observed when comparing GSR silages at day 0 versus 120 days in both hybrids and maize growing sites. The PCoAs evidenced variation in the structure of the bacterial community as a function of the storage period of the grain with clear separation of the communities coming from freshly harvested samples from silage stored for 120 days. It was also revealed that Proteobacteria (41,8 %), Firmicutes (41,6 %) and Actinobacteria (13,2 %) were the most abundant phyla in the silages, evidencing the occurrence of succession of a microbiome dominated by Proteobacteria and Actinobacteria (at 0 day) for a microbiome dominated by Firmicutes, represented mainly by the order Lactobacillales in the terminal silages (120 days). We observed the same effect when considering the local sample, hybrid and physiological maturity. The factors that had the greatest influence on the distribution of the bacterial community were the storage period (36,16 %) and the stage of maturity of the plant (13,3 %). The Lactobacillales order was differentially abundant in the corn stored for 120 days (70% of the variation) and Enterobacteriales (45 % of the variation) at day 0. In relation to the stage of maturity we observed a significant variation in the relative abundance of Enterobacteriales in GU (25 % of the variation) and Actinomycetales in GSR (21 % of the variation). There was a correlation (P = 0.002) of the pH with the community structure of the silages, and the highest pH variations were obtained by comparing the samples in the 0 - 120 days of storage. The order Lactobacillales was negatively correlated with pH (r = -0.85), while Enterobacteriales (r = 0.58) and Actinomycetales (r = 0.46) were positively correlated with pH. The reconstitution of the corn grain did not have a negative effect on the bacterial population of the terminal silages, highlighting the viability of this technique. To date, there are no published papers presenting the structure and composition of the bacterial community of GSR silages by means of massive sequencing of the 16S rRNA gene, confirming the importance and novelty of this work.

INTRODUÇÃO: A doença de Chagas é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi) e ainda hoje representa um grande problema de saúde pública tendo infectado mais de oito milhões de pessoas. A patogênese da cardiomiopatia chagásica ainda não é completamente compreendida. A inflamação no miocárdio é intensa em relação ao número de parasitos presentes e também se observa um dano progressivo em outros órgãos como esôfago e cólon em 30% a 40% dos casos em que se diagnosticou a doença. Alguns estudos começaram a mostrar que a resposta imunológica a um parasita pode depender da microbiota intestinal; porém, ainda não existem estudos com a tecnologia de sequenciamento de nova geração (NGS) que descrevam a microbiota intestinal em doença de Chagas. É possível que uma pequena alteração do peristaltismo intestinal, decorrente da infecção por T. cruzi possa alterar a colonização de algumas bactérias as quais podem causar mudanças na reatividade do sistema imune como aumentar a resposta autoimune, gerando maior dano ao coração. OBJETIVO: Este trabalho objetivou descrever a microbiota intestinal de acordo com a forma clínica da doença de Chagas, através da amplificação do gene 16s RNA ribossomal e avaliar seu papel na patogênese da doença. MÉTODO: Foram selecionados 114 indivíduos, sendo 30 portadores da forma cardíaca da doença, 11 com a forma digestiva (megacólon), 32 com a indeterminada e 31 indivíduos saudáveis (controles). De cada um deles, foram coletadas amostras de fezes para a análise da microbiota por meio de técnicas de sequenciamento de nova geração Ion Torrent. Os resultados obtidos foram analisados pelo software QIIME para determinar a população de bactérias presentes nas amostras. A análise estatística foi realizada utilizando-se os testes não paramétricos de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney U-test. RESULTADOS: A frequência relativa do filo Verucomicrobia foi significantemente menor no grupo cardíaco em comparação ao grupo controle e as outras formas clínicas: indeterminada e digestiva. Apesar da abundância relativa desse filo ser menor do que 1%, a diferença observada se manteve significante, mesmo após a correção de Bonferroni. CONCLUSÕES: Nosso estudo sugere que uma menor proporção do filo Verrucomicrobia possa estar relacionada ao processo inflamatório na forma cardíaca; porém, ainda pouco se conhece sobre este grupo de bactérias e seus componentes, que nos permita afirmar o seu efetivo papel na forma cardíaca da doença de Chagas / INTRODUCTION: Chagas disease is caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi (T.cruzi) and still represents a major public health problem with more than eight million people infected. Chagas cardiomyopathy pathogenesis is still not completely understood. Inflammation in the myocardium is intense in relation to the number of parasites present and progressive damage is also observed in other organs such as the esophagus and colon in 30% to 40% of the cases. Some studies are beginning to show that the immune response to a parasite may depend on the intestinal microbiota. However, there are no studies using NGS technology that describes the intestinal microbiota of Chagas disease. It is possible that a small change in intestinal peristalsis due to T cruzi infection may alter the colonization of some bacteria. These changes could cause changes in the reactivity of the immune system such as increasing the autoimmune response causing greater damage to the heart. OBJECTIVE: This study aimed to describe the intestinal microbiota according to the clinical form of Chagas disease, through amplification of the 16s ribosomal RNA gene and to evaluate its role in the pathogenesis of the disease. METHODS: A total of 114 individuals were selected, 30 of cardiac form of the disease, 11 with the digestive form (megacolon), 32 with indeterminate form and 31 healthy individuals (controls). Stool samples were collected and analysed for the microbiota using Ion Torrent sequencing technique. The results were analyzed by the QIIME software to determine the population of bacteria present in the samples. Statistical was performed using Kruskal-Wallis non-parametric test and Mann-Whitney U-test. RESULTS: The relative frequency of the Verrucomicrobia phylum was significantly lower among the cardiac group when compared to control, indeterminate and digestive form. Our study suggest that the phylum Verrucomicrobia may play a role in the miocardio inflammation process in Chagas disease, however little is known about these bacteria to infer the mechanism

O zika é um arbovírus emergente. Há evidências para a relação entre o zika e a microcefalia congênita e também com a síndrome de Guillain-Barre. Várias características do vírus são importantes, como a persistência do vírus no sêmen por vários meses, transmissão sexual e evidência de transmissão pré-natal. As mães grávidas infectadas com zika podem dar à luz crianças aparentemente saudáveis que podem apresentar manifestações e complicações tardias. Existe uma clara necessidade de diagnosticar e sequenciar amostras clínicas do ZIKV que circulam na América do Sul, especificamente no Brasil. No entanto, as baixas cargas virais observadas que são observadas comumente em amostras humanas constituem um fator complicador para detecção, amplificação e sequenciamento. Neste projeto, propor projetar um fluxo de trabalho otimizado para o sequenciamento completo do genoma com base no pré-enriquecimento por PCR (reação em cadeia da polimerase) e pools de amplicons. / Zika is an emerging arbovirus. There is enough evidence for the relation between Zika and congenital microcephaly and also with the Guillain-Barre syndrome. Several characteristics of the virus are important, such as persistence of the virus in semen for several months, sexual transmission and evidence of prenatal transmission. Zika infected pregnant mothers may give birth to apparently healthy children that may show late manifestations and complications. There is a clear necessity of diagnosing and sequencing clinical samples of ZIKV circulating in South America, specifically in Brazil. Nevertheless, the observed low viral loads that are commonly in human samples constitute a complicating factor for detection, amplification and sequencing. In this project, we aim to design an optimized workflow for full genome sequencing based on pre-enrichment by PCR (polymerase chain reaction) and amplicon pools.

Os hormônios tireoidianos (HTs) desempenham um papel importante em diversos processos, tais como o crescimento, desenvolvimento e metabolismo dos tecidos em geral. Embora estudos tenham demonstrado que os HTs agem diretamente nas células foliculares da tireoide reduzindo sua resposta ao TSH, pouco se sabe, a nível molecular, sobre essa e outras ações dos HTs na própria glândula tireoide. Nesse sentido, o objetivo do presente trabalho foi avaliar alterações no perfil de expressão gênica nas células foliculares tireoidianas (células PCCl3) em reposta ao tratamento com triiodotironina (T3). Após atingir confluência desejada, as células PCCl3 foram mantidas em meio depletado de HTs (grupo Hipo) por 24h. Após esse período, parte das células foi tratada com 10-7M de T3 (grupo T3) por 24 h. As células foram, então, lisadas para extração de RNA total para análise do transcriptoma, por RNAseq. Foi obtido como resultado, uma lista de genes diferencialmente expressos da qual foram selecionados cinco genes para validação in vitro (novo lote de células PCCl3 submetidas às mesmas condições descritas acima) e in vivo [ratos Wistar (250g), tratados por 4 semanas com T3 (1,5 &mu;g/100g de peso corporeo; grupo hipertireoideo) ou PTU (10 &mu;g/100g de peso corporeo; grupo hipotireoideo): o Slc16a1, que codifica o MCT8, responsável pelo transporte de T3 através da membrana, o Snrpd1, 9-March, Pfdn1 e Fam103a1, que codificam proteínas envolvidas no controle pós-transcricional e pós-traducional da expressão gênica. O tratamento com T3 estimulou a expressão dos genes Snrpd1, Pfdn1 e Fam103a1, enquanto reduziu a expressão de 9-March e Slc16a1. Juntos esses resultados demonstram a existência de um efeito autócrino exercido pelo T3 sobre o controle do seu próprio turnover proteico. / Thyroid hormones (HTs) play an important role in many processes, such as growth, development and metabolism of tissues in general. Although studies have shown that HTs act directly on follicular thyroid cells reducing their response to TSH, little is known, at the molecular level, about this and other actions of HTs in the thyroid gland itself. In this sense, the aim of the present study was to evaluate changes in the gene expression profile in the thyroid follicular cells (PCCl3 cells) in response to triiodothyronine (T3) treatment. After reaching 60% confluence, PCCl3 cells were maintained in HT depleted medium (Hypo group) for 24h. After this time, part of the cells was treated with 10-7M T3 (T3 group) for 24 h. Cells were then lysed for total RNA extraction for transcriptome analysis by RNAseq. As a result, a list of differentially expressed genes from which five genes for in vitro validation (PCCl3 cells under the same conditions described above) and in vivo [Wistar rats (250g), treated for 4 weeks with T3 (1.5 &um;g / 100 g body weight, hyperthyroid group) or PTU (10 &um;g / 100 g body weight; hypothyroid group): Slc16a1, which encodes MCT8, responsible for the transport of T3 through the membrane, Snrpd1, 9-March, Pfdn1 and Fam103a1, which encode proteins involved in post-transcriptional and post-translational control of gene expression. T3 treatment stimulated the expression of the Snrpd1, Pfdn1 and Fam103a1 genes, while reducing the expression of 9-March and Slc16a1. Together these results demonstrate the existence of an autocrine effect exerted by T3 on the control of its own protein turnover.

Submitted by Livia Mello (liviacmello@yahoo.com.br) on 2016-10-14T19:44:04Z No. of bitstreams: 1 TeseBGR.pdf: 2376550 bytes, checksum: 4ee6a0f02e589ae693965093fa4f2f42 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-11-08T18:48:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseBGR.pdf: 2376550 bytes, checksum: 4ee6a0f02e589ae693965093fa4f2f42 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-11-08T18:48:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseBGR.pdf: 2376550 bytes, checksum: 4ee6a0f02e589ae693965093fa4f2f42 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-08T18:48:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseBGR.pdf: 2376550 bytes, checksum: 4ee6a0f02e589ae693965093fa4f2f42 (MD5) Previous issue date: 2016-03-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / The Human Papiloma Virus (HPV) is a Sexually Transmitted Disease (STD) very common in the world. It infects the human epithelium may persisting of asymptomatic form or causing some neoplasia. Many studies report the association between HPV and many kinds of cancer such as: lap utero, anus, penis, vagina and vulva. According to INCA data for the year of 2016 are expected 16.340 new cases of lap utero cancer, being the second most frequent case in the female population in Brazil. For the recognition of the virus, there`s a lots of tracking methods, as morphological test (pap test), that observes cytopathic effects caused by the virus on human cells, suggesting the existence of infection, however this type of test presents low results and has shown high taxes of false negative and positive results. To overcome this problems, countless studies has shown the effect of molecular techniques utilization to increase the sensibility and especially, getting recognize and genotyping the HPV virus. On this recent studies, were tested distinct molecular techniques for typing the HPV virus, as Conventional PCR followed by Sanger Sequencing , Real time PCR (SYBRGreen® e Taqman ®) and Sequencing of New Generation. Altogether were collected 318 samples pf cervix grated, and from this material were collected the DNA using an adapted protocol (POWELL; GANNON, 2002). Using the conventional PCR technique followed by Sanger Sequencing we obtained 65 positives samples for the HPV(21%), in 49 samples(75,3%) it was possible to identify the HPV type, in the other 16 samples(24,7%) it was not possible the identification, probably because the infection was formed for two or more types of the virus. With the real time PCR technique using SYBRGreen®, were accomplished an experimente with 30 samples, which was possible to confirm the results in 28 of it, using Sanger Sequencing. In two samples the results are not confirmed, being possible to positive the sample, showing high sensibility of the real time PCR technique. The methodology of New Generation Sequencing (NGS) it showed useful for HPV identification, being one of the first studies published for routine use. And it has great prospects because besides HPV can identify other microorganisms in the sample and quantifies them as well. / O Papilomavírus humano conhecido como HPV é uma doença sexualmente transmissível frequente em todo mundo, ele infecta o epitélio de seres humanos, podendo persistir de forma assintomática ou causar neoplasias. Diversos estudos relatam a associação entre o HPV (Alto Risco) e diversos tipos de câncer como: colo de útero, ânus, orofaringe, pênis, vagina e vulva. Segundo dados do INCA para o ano de 2016, são esperados 16.340 novos casos de câncer de colo de útero, sendo de maior frequência na população feminina no Brasil. Para a identificação do vírus existem inúmeros métodos de rastreio como testes morfológicos (exame do Papanicolau), que observam os efeitos citopáticos que o vírus provoca nas células sugerindo a existência da infecção, mas este tipo de teste apresenta baixa especificidade e vem apresentando altas taxas de falsos-negativos e positivos. Para contornar estes problemas inúmeros estudos têm demostrando a eficácia da utilização de técnicas moleculares, para aumentar a sensibilidade e especificidade, conseguindo identificar e genotipar o vírus do HPV. No presente estudo foram testadas diferentes técnicas moleculares para a identificação do vírus do HPV como: PCR convencional seguida por sequenciamento Sanger, PCR em tempo real (SYBRGreen® e Taqman®) e sequenciamento de nova geração. Ao todo foram coletadas 318 de amostras de raspado do colo cervical. Deste material foi extraído o DNA utilizando um protocolo adaptado (POWELL, GANNON, 2002). Utilizando a técnica da PCR convencional seguida por sequenciamento Sanger obtivemos 65 amostras positivas para o HPV (21%), destas 49 amostras (75,3%) foi possível identificar o tipo do HPV e em 16 casos (24,7%) não foi possível identificar o vírus, sendo possivelmente uma infecção formada por dois ou mais tipos do vírus. Com a técnica de PCR em tempo real utilizando SYBRGreen® foi realizado um experimento com 30 amostras sendo possível confirma o resultado destas com o sequenciamento Sanger em 28 casos. Em duas amostras os resultados não corroboraram, sendo possível positivar a amostra. Mostrando a maior sensibilidade da técnica de PCR em tempo real. A metodologia de sequenciamento de nova geração (NGS) se mostrou útil para identificação do HPV, demonstrada neste trabalho de maneira inédita. O uso do NGS apresenta boas perspectivas pois além do HPV pode identificar outros microrganismos na amostra e quantifica-los.

Submitted by Simone Souza (simonecgsouza@hotmail.com) on 2018-05-02T17:09:56Z No. of bitstreams: 1 DISS_2015_Mayara Inácio Vincenzi da Silva.pdf: 1467868 bytes, checksum: 1589e777267d83f74d5b55da57e6a5db (MD5) / Approved for entry into archive by Jordan (jordanbiblio@gmail.com) on 2018-05-16T15:13:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISS_2015_Mayara Inácio Vincenzi da Silva.pdf: 1467868 bytes, checksum: 1589e777267d83f74d5b55da57e6a5db (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-16T15:13:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISS_2015_Mayara Inácio Vincenzi da Silva.pdf: 1467868 bytes, checksum: 1589e777267d83f74d5b55da57e6a5db (MD5) Previous issue date: 2015-08-07 / CAPES / Ferro (Fe) é um elemento essencial e a capacidade de adquiri-lo in vivo têm sido descrita em diversos agentes patogênicos através de fatores de virulência. Análises globais de transcritos durante a privação de ferro tem sido descritos através da técnica de “microarray”, entretanto através da técnica de RNA-seq recentemente tem demonstrado resultados superiores. O isolado de Pasteurella multocida (Pm 16759) altamente patogênica em suínos foi cultivado em duas condições com diferentes concentrações de Fe (controle e privação) com o objetivo de analisar transcritos diferencialmente expressos. O RNA total das duas condições foi extraído e sequenciado através da plataforma de nova geração Ion Torrent. Os dados foram analisados no Software Ion Reporter™ e processados no programa Rockhopper. Foram obtidas 1.341.615 leituras com tamanho médio de 81pb, com 96% de alinhamento com o genoma de Pasteurella multocida subsp. multocida 3480 e 98,8% de acurácia. No mapeamento das leituras das duas condições, observou-se 2,652 transcritos e destes, 177 (6,7%) foram diferencialmente expressos, sendo 93 na condição controle (Fe+) e 84 na condição de privação (Fe-). Na condição de privação de ferro, o perfil de transcritos foram associados a função de transporte celular (fbpABC, high-affinity Fe2+/Pb2+ permease e periplasmic protein probably involved in hight-affinity Fe2+), reguladores transcricionais e proteínas hipotéticas. O perfil na condição controle (Fe+) apresentou transcritos diferencialmente expressos associados ao RNAs anti-sense (asRNA) e genes do metabolismo energético (fructose-1,6-bisfosfatase). A técnica de RNA-seq mostrou-se eficiente na identificação de transcritos diferencialmente expressos por P. multocida em condições de privação de Fe, o que pode auxiliar nos estudos de patogenicidade. / Iron (Fe) is an essential element and the ability to acquire it, in vivo, have been described in several pathogens such as virulence factors. Global analyses of transcripts during iron deprivation have been described by microarray studies, however, recently RNA-seq analysis shows superior results. The high pathogenic swine strain of Pasteurella multocida (BRMSA 1113) was grown in the two conditions with different concentrations of Fe (control and deprivation) in order to analyze the differentially expressed transcripts. The total RNA of the two conditions was extracted and sequenced by new generation Ion Torrent plataform. Data were analyzed in Ion Reporter ™ Software and processed in Rockhopper software. Sequence analysis shows 1,341,615 readings with median length of 81pb, with 96% of alignment to the reference genome Pasteurella multocida strain 3489, and 98.8% accuracy. Reads mapping to genome of P. multocida in these two conditions, detected 2,652 transcripts, which , 177 (6.7%) were differentially expressed, with 93 in the control condition (Fe +) and 84 provided with iron deprivation condition (Fe-). In condition (Fe-), differential expressed transcript profile were associated to function of cellular transport (fbpABC,, high-affinity Fe2+/Pb2+ permease and periplasmic protein probably involved in hight-affinity Fe2+), transcptional regulators and hypothetical proteins. The control condition (Fe+) shows differential expressed transcripts profile associated to RNA anti-sense (asRNA) energetic metabolism genes (fructose-1,6-bisphosphatase). The technique of RNA-seq proved effective in identifying novel differentially expressed transcripts by P. multocida (BRMSA 1113) under conditions of Fe deprivation, which can assist in pathogenicity studies.

INTRODUÇÃO: A doença de Chagas é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi) e ainda hoje representa um grande problema de saúde pública tendo infectado mais de oito milhões de pessoas. A patogênese da cardiomiopatia chagásica ainda não é completamente compreendida. A inflamação no miocárdio é intensa em relação ao número de parasitos presentes e também se observa um dano progressivo em outros órgãos como esôfago e cólon em 30% a 40% dos casos em que se diagnosticou a doença. Alguns estudos começaram a mostrar que a resposta imunológica a um parasita pode depender da microbiota intestinal; porém, ainda não existem estudos com a tecnologia de sequenciamento de nova geração (NGS) que descrevam a microbiota intestinal em doença de Chagas. É possível que uma pequena alteração do peristaltismo intestinal, decorrente da infecção por T. cruzi possa alterar a colonização de algumas bactérias as quais podem causar mudanças na reatividade do sistema imune como aumentar a resposta autoimune, gerando maior dano ao coração. OBJETIVO: Este trabalho objetivou descrever a microbiota intestinal de acordo com a forma clínica da doença de Chagas, através da amplificação do gene 16s RNA ribossomal e avaliar seu papel na patogênese da doença. MÉTODO: Foram selecionados 114 indivíduos, sendo 30 portadores da forma cardíaca da doença, 11 com a forma digestiva (megacólon), 32 com a indeterminada e 31 indivíduos saudáveis (controles). De cada um deles, foram coletadas amostras de fezes para a análise da microbiota por meio de técnicas de sequenciamento de nova geração Ion Torrent. Os resultados obtidos foram analisados pelo software QIIME para determinar a população de bactérias presentes nas amostras. A análise estatística foi realizada utilizando-se os testes não paramétricos de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney U-test. RESULTADOS: A frequência relativa do filo Verucomicrobia foi significantemente menor no grupo cardíaco em comparação ao grupo controle e as outras formas clínicas: indeterminada e digestiva. Apesar da abundância relativa desse filo ser menor do que 1%, a diferença observada se manteve significante, mesmo após a correção de Bonferroni. CONCLUSÕES: Nosso estudo sugere que uma menor proporção do filo Verrucomicrobia possa estar relacionada ao processo inflamatório na forma cardíaca; porém, ainda pouco se conhece sobre este grupo de bactérias e seus componentes, que nos permita afirmar o seu efetivo papel na forma cardíaca da doença de Chagas / INTRODUCTION: Chagas disease is caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi (T.cruzi) and still represents a major public health problem with more than eight million people infected. Chagas cardiomyopathy pathogenesis is still not completely understood. Inflammation in the myocardium is intense in relation to the number of parasites present and progressive damage is also observed in other organs such as the esophagus and colon in 30% to 40% of the cases. Some studies are beginning to show that the immune response to a parasite may depend on the intestinal microbiota. However, there are no studies using NGS technology that describes the intestinal microbiota of Chagas disease. It is possible that a small change in intestinal peristalsis due to T cruzi infection may alter the colonization of some bacteria. These changes could cause changes in the reactivity of the immune system such as increasing the autoimmune response causing greater damage to the heart. OBJECTIVE: This study aimed to describe the intestinal microbiota according to the clinical form of Chagas disease, through amplification of the 16s ribosomal RNA gene and to evaluate its role in the pathogenesis of the disease. METHODS: A total of 114 individuals were selected, 30 of cardiac form of the disease, 11 with the digestive form (megacolon), 32 with indeterminate form and 31 healthy individuals (controls). Stool samples were collected and analysed for the microbiota using Ion Torrent sequencing technique. The results were analyzed by the QIIME software to determine the population of bacteria present in the samples. Statistical was performed using Kruskal-Wallis non-parametric test and Mann-Whitney U-test. RESULTS: The relative frequency of the Verrucomicrobia phylum was significantly lower among the cardiac group when compared to control, indeterminate and digestive form. Our study suggest that the phylum Verrucomicrobia may play a role in the miocardio inflammation process in Chagas disease, however little is known about these bacteria to infer the mechanism

An important goal of biology is to understand the key mechanisms of evolution underlying the diversity of living organisms on Earth. In that respect, the recent innovations in the field of new generation sequencing technologies (NGS) are bringing new and exciting opportunities. This thesis presents results obtained with these tools in the specific context of the study of two sister species of cold-adapted leaf beetles, Gonioctena intermedia and G. quinquepunctata. More specifically, this work is focused around four research directions: the two first explore methods of statistical inference using a spatially explicit model of coalescence, by (1) evaluating the potential of various summary statistics to discriminate phylogeographic hypotheses, and (2) investigating the dispersal abilities of a montane leaf beetle, G. quinquepunctata, using an original method that avoids using summary statistics. The third research direction focuses on the adaptation to cold conditions in this montane leaf beetle, by testing the association between genetic polymorphism across tens of thousands of genetic markers and altitude in samples collected at various elevation levels in the Vosges (France). Finally, the fourth, and last, research axis presents the discovery of mitochondrial heteroplasmy, i.e. the presence in an individual of multiple copies of the mitochondrial genome, in natural populations of G. intermedia. We illustrate, here, how NGS technologies could help identify this phenomenon, probably underestimated in animals, on a large scale. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les corticostéroïdes inhalés (ICs) utilisés dans le traitement de l'asthme ont un effet sur le microbiome pulmonaire. Il est toutefois difficile de séparer leurs effets sur les communautés bactériennes via leur rôle immunomodulateur, de leurs effets indirects via l’amélioration de la ventilation. Notre objectif est de déterminer si les ICs altèrent le microbiote pulmonaire indépendamment de leurs effets sur la fonction pulmonaire. Douze chevaux atteints d’asthme en exacerbation ont reçu des bronchodilatateurs à longue durée d'action (LABA, salmétérol) ou une combinaison ICs/LABA (fluticasone/salmétérol) pendant deux semaines. Des tests de fonction pulmonaire et des lavages broncho-alvéolaires (LBA) ont été effectués avant et après traitement. La quantification par PCR et le séquençage du gène codant pour l’ARNr 16S via une plateforme MiSeq-Illumina ont été réalisés sur les LBA. Les données ont été analysées avec mothur. La fonction pulmonaire s’est améliorée dans les deux groupes. Les abondances relatives de familles et genres appartenant au phylum Bacteroidetes ont augmenté suite au traitement ICs/LABA, tandis que les phyla Verrucomicrobia et Actinobacteria se sont appauvris avec les LABA. Une modification de la β-diversité et une diminution de la charge bactérienne ont été observées seulement après le traitement LABA. L’α-diversité n’a en revanche pas varié dans les deux groupes. Les différences observées entre les groupes ICs/LABA et LABA suggèrent que les changements au sein des communautés bactériennes ne sont pas seulement dus à l’amélioration de la ventilation. Il reste toutefois difficile de trancher quant à un effet positif ou bien néfaste des ICs sur le microbiote pulmonaire. / Inhaled corticosteroids (ICs) affect the respiratory microbiome in asthma. It remains difficult to separate the immunomodulatory effects of ICs on bacterial communities from their indirect effects via improvement of ventilation. Our objective was to determine if ICs alter the lung microbiota independently from their effects on lung function. Twelve horses with equine asthma in exacerbation were assigned to receive a long-acting bronchodilator (LABA, salmeterol) or the combination ICs/LABA (fluticasone/salmeterol) for 2 weeks. Lung function and bronchoalveolar lavages (BAL) were performed before and after treatment. 16S rRNA gene quantification and sequencing were performed on BAL fluid, using PCR and the Illumina MiSeq platform. Data were processed using the software package mothur. Lung function improved with both treatments. The relative abundances of families and genera belonging to the Bacteroidetes phylum increased with ICs/LABA, while the Verrucomicrobia and the Actinobacteria phyla decreased with LABA. Furthermore, β-diversity differed from baseline and the bacterial load decreased after LABA only. On the contrary, α-diversity indices did not vary in both groups. The differences observed between the ICs/LABA and LABA groups suggest that the changes in bacterial communities are not only due to improved ventilation. However, it remains difficult to clarify if the effects of ICs are positive or detrimental to the lung environment.