La qualité de la prise en charge d’un patient repose sur la disponibilité d’outils diagnostiques performants. Le développement de biocapteurs s’appuyant sur le phénomène de transfert d’énergie par résonance de type Förster permet la détection de biomarqueurs spécifiques avec une grande précision et une bonne sensibilité. Le FRET (Förster Resonance Energy Transfer) est un processus de transfert d’énergie dépendant de la distance fréquemment utilisé dans les applications de biodétection, dans lesquelles les reconnaissances, fonctions et structures biologiques sont de l’ordre de 1 à 20 nm. Cette thèse de doctorat présente la mise en œuvre de procédés de fabrication et de fonctionnalisation pour la détection optique de molécules d’intérêt biologique par FRET, en particulier pour des applications en diagnostic clinique et en séquençage d’ADN.Ce travail présente une étude du phénomène de FRET sur des surfaces d’aluminium fonctionnalisées, première étape du développement d’une plateforme de séquençage par FRET exalté par effet plasmonique. La détection quantitative du phénomène de FRET sur des surfaces d’aluminium fonctionnalisées par silanisation est développée, et les résultats de caractérisation de la fonctionnalisation par différentes méthodes (angle de contact, spectroscopie FTIR, imagerie de fluorescence) sont discutés en détails.Ce manuscrit expose également le développement d’un dispositif microfluidique fonctionnalisé pour la réalisation d’un immunodosage par FRET multiplexé. Dans l’optique de concevoir un dispositif intégré fonctionnalisé pour la détection par FRET en conditions microfluidiques, j’ai développé une stratégie pour la réalisation d’un biocapteur optique microfluidique par FRET multiplexé. Les résultats préliminaires de FRET entre deux anticorps fluorescents dans un canal microfluidique démontrent la faisabilité d’une telle plateforme de biodétection. / Patient care quality relies on the availability of efficient diagnostics tools. Development of biosensors based on Förster resonance energy transfer (FRET) allows for the detection of specific biomarkers with high precision and sensitivity. FRET is a distance dependent energy transfer process that is frequently used in biosensing applications, in which biological recognition, functions or structures are within the 1 to 20 nm length scale. This PhD thesis presents the establishment of fabrication and functionalization processes for the optical FRET detection of molecules of biological interest, toward an application in clinical diagnostics and DNA sequencing.This work presents a FRET study on functionalized aluminum surfaces, which is the first step towards the development of a sequencing platform using plasmonics enhanced FRET. Quantitative FRET detection on silanized aluminum surfaces was extensively investigated and the results of different characterization methods (contact angle, FTIR spectroscopy, fluorescence imaging) are discussed in details.This manuscript also describes the development of a functionalized microfluidic device for the realization of a multiplexed FRET immunoassay. With the aim of designing a functionalized integrated device for FRET detection in microfluidic conditions, I developed a strategy for the realization of a microfluidic optical multiplexed FRET biosensor. Preliminary FRET results between two labeled antibodies in a microfluidic channel demonstrate the feasibility of such a biosensing platform.

Les nouvelles exigences du diagnostic clinique et de la thérapeutique, particulièrement en termes d’examens au chevet du patient et en médecine de précision, ont conduit à une demande croissante d’analyses à la fois multiplexées et présentant un rendement important, et ce d’un grand nombre de biomolécules au sein d’un échantillon unique. La thèse se concentre sur le développement de biosenseurs multiplexés basés sur le transfert d’énergie par résonance de type Förster résolu en temps de complexes de lanthanide vers des colorants organiques ou des boîtes quantiques. Je présente plusieurs techniques novatrices permettant la détection simultanée et multiplexée de protéines biomarqueurs du cancer (récepteur du facteur de croissance épidermique) ou de microARNs (hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-20b-5p et hsa-miR-21-5p) avec de très faibles limites de détection. J’ai utilisé différentes stratégies afin d’obtenir des détections multiplexées telles la détection multiplexée spectrale basée sur les différents spectres d’émission de différents luminophores, et la détection multiplexée temporelle basée sur les durées de vie distinctes des états excités des luminophores. Ces travaux ne sont pas seulement une recherche appliquée qui peut être utilisée en diagnostic clinique, mais constituent également une recherche fondamentale sur le FRET résolu en temps qui ouvre de nouvelles perspectives de détection et augmente considérablement le nombre de biomarqueurs pouvant être détectés. / The new mission of clinical diagnostics and therapeutics, especially in point-of-care testing and precision medicine, has led to an increasing demand for multiplex and high throughput analyses of large numbers of biomolecules within a single sample. The thesis focuses on developing multiplexed biosensors based on time-resolved Förster resonance energy transfer from lanthanide complexes to organic dyes or quantum dots. I present several new techniques to simultaneously and multiplexed detect cancer related protein biomarkers (human epidermal growth factor receptor) or microRNAs (hsa- miR-20a-5p, hsa-miR-20b-5p and hsa-miR-21-5p) with very low limits of detections. I have used different strategies to achieve multiplexed detections such as spectral multiplexed detection based on different emission spectra of different luminophores, and temporal multiplexed detection based on distinguishable excited-state lifetimes of luminophores. The work is not only an applied research that can be used in clinical diagnostics but also a fundamental research of time-resolved FRET, which opens a new dimension of detection and greatly increases the number of biomarkers that can be detected.

Le multiplexage optique basé sur des nanoparticules offre de nombreux avantages pour la biodétection et l'imagerie à multiparamètres. Toutefois, les modifications apportées à un paramètre entraînent également la modification d’autres paramètres. Par conséquent, la couleur, la durée de vie ou l’intensité ne peuvent pas être utilisées, respectivement, comme paramètre indépendant. Cette thèse peut être divisée en deux aspects. Le premier concerne le développement d'un multiplexage à une seule nanoparticule avec un temps résolu, basé sur le transfert d'énergie par résonance de type Förster (FRET) des complexes de lanthanides aux points quantiques (QD) et ensuite aux colorants fluorescents. Une investigation systématique de toutes les différentes combinaisons avec une large gamme de donneurs et d'accepteurs sur le QD est présentée, et les résultats expérimentaux sont comparés à la modélisation théorique. Le résultat ne contribue pas seulement à une compréhension complète de ces voies de transfert d'énergie compliquée entre multi donneurs / accepteurs sur des nanoparticules, mais offre également la possibilité d'utiliser les modèles pour développer de nouvelles stratégies permettant de préparer le QD avec une couleur, une durée de vie et une intensité réglables de manière indépendante. Le deuxième aspect porte sur le mécanisme de transfert d'énergie du Tb à la nanoparticule d'or (AuNP). Le transfert d'énergie par nanosurface (NSET) s'est révélé être un mécanisme opérationnel pour l'extinction des PL par les AuNP, une information importante pour le développement, la caractérisation et l'application de nanobiocapteurs basés sur l'extinction des PL par les AuNP. / Optical multiplexing based on nanoparticles provides many advantages for multiparameter biosensing and imaging. However, the changes in one parameter also lead to changing of other parameters, and thus, color, lifetime, or intensity could not be used as an independent parameter, respectively. This thesis can be divided into two aspects. The first one focuses on developing time-resolved single-nanoparticle multiplexing based on Förster resonance energy transfer (FRET) from lanthanide complexes to quantum dot (QD) to fluorescent dyes. Systematical investigation of all different combinations with a broad range of numbers of donors and acceptors on QD are presented, and the experimental results are compared with theoretical modelling. The result do not only contribute to a full understanding of such complicated multi donor-acceptor energy transfer pathways on nanoparticles but also open the opportunity to use the models for developing new strategies to achieve the QD with independent tunable color, lifetime and intensity. The second aspect focuses on the energy transfer mechanism from Tb to gold nanoparticle (AuNP). Nanosurface energy transfer (NSET) proved to be an operational mechanism in PL quenching by AuNPs, which is important information for the development, characterization, and application of nanobiosensors based on PL quenching by AuNPs.

<p>FRET-enabled optical computing is a new computing paradigm that uses the energy of incident photons to perform computation in molecular-scale circuits composed of inter-communicating photoactive molecules. Unlike conventional computing approaches, computation in these circuits does not require any electric current; instead, it relies on the controlled-migration of energy in the circuit through a phenomenon called Förster Resonance Energy Transfer (FRET). This, coupled with other unique features of FRET circuits can enable computing in new domains that are unachievable by the conventional semiconductor-based computing, such as in-cell computing or targeted drug delivery. In this thesis, we explore novel FRET-based multiplexing techniques to significantly increase the storage density of optical storage media. Further, we develop analysis algorithms, and computer-aided design tools for FRET circuits.</p><p>Existing computer-aided design tools for FRET circuits are predominantly ad hoc and specific to particular functionalities. We develop a generic design-automation framework for FRET-circuit optimization that is not limited to any particular functionality. We also show that within a fixed time-budget, the low-speed of Monte-Carlo-based FRET-simulation (MCS) algorithms can have a potentially-significant negative impact on the quality of the design process, and to address this issue, we design and implement a fast FRET-simulation algorithm which is up to several million times faster than existing MCS algorithms. We finally exploit the unique features of FRET-enabled optical computing to develop novel multiplexing techniques that enable orders of magnitude higher storage density compared to conventional optical storage media, such as DVD or Blu-Ray.</p> / Dissertation

Vers la fin des années 1990 et au début des années 2000, l’idée que l’ARN puisse interagir directement avec de petits métabolites pour contrôler l’expression de certains gènes devient de plus en plus acceptée. Des recherches menées à cette époque ont permis la découverte de plusieurs structures d’ARN hautement conservées nommées riborégulateurs. La structure de ces ARN leur permet de reconnaître spécifiquement un ligand. La reconnaissance du ligand entraîne ensuite un changement de conformation dans l’ARN responsable du contrôle de l’expression génétique. Le but de cette thèse est d’étudier la structure et les changements de conformation du riborégulateur associé au gène add liant l’adénine chez Vibrio vulnificus. Ce riborégulateur étant relativement simple, les informations recueillies lors de cette étude pourront servir à comprendre le fonctionnement de riborégulateurs plus complexes. Dans l’introduction, la découverte des riborégulateurs sera décrite en plus des caractéristiques particulières et de l’importance de ces ARN. Par la suite, quelques exemples démontrant l’importance des structures d’ARN seront abordés. Ensuite, les techniques de fluorescence utilisées pour étudier les structures d’ARN au cours de cette thèse seront présentées. Enfin, les recherches effectuées sur les riborégulateurs adénine seront détaillées afin d’aider le lecteur à bien comprendre le type de riborégulateur au centre de cette thèse. Le chapitre 1 traite du repliement de l’aptamère suite à la liaison avec l’adénine. Dans ce chapitre, il est démontré que l’aptamère peut adopter trois conformations. Une modification de la séquence de l’aptamère de type sauvage a permis d’isoler ces trois conformations. Il a ensuite été possible d’identifier les caractéristiques propres à chacun des états. Le chapitre 2 s’intéresse à une région précise du riborégulateur adénine. Dans ce chapitre, la conformation du cœur de l’aptamère est étudiée plus en profondeur. Il y est possible de constater que le repliement du cœur de l’aptamère influence l’interaction boucle-boucle en présence de magnésium et de ligand. De plus, la présence de ligand, en concentration suffisante, permet le repliement du cœur et favorise le rapprochement des tiges P2 et P3 dans un aptamère muté pour empêcher la formation de l’interaction boucle-boucle. Il semble donc que le repliement du cœur de l’aptamère influence la structure globale de l’aptamère. Finalement, les travaux présentés dans les chapitres 1 et 2 seront mis en contexte avec la littérature scientifique disponible. Cette discussion tentera de réconcilier certaines observations contradictoires. Il sera ensuite question de l’impact que les travaux présentés dans cette thèse peuvent avoir dans le domaine de l’ARN. Enfin, quelques études à réaliser en continuité avec ces travaux seront proposées.

Fluorescence spectroscopy and imaging have a very broad spectrum of applicationswithin the life sciences, in particular for detection and characterization ofbiomolecular dynamics and interactions in different environments. This thesis comprisesprojects that strive to further expand the information content extracted fromthe detected fluorescence, leading to sensitive readout parameters for studies ofbiomolecular dynamics and interactions. Two major strategies are presented toachieve this aim. The first strategy is based on the expansion of the availablereadout parameters beyond the "traditional" fluorescence parameters: intensity,wavelength, polarization and fluorescence lifetime. The additional parameters arebased on blinking properties of fluorescent labels. In particular on transitions betweensinglet and triplet states, and transitions between the trans- and cis-isomersof fluorophores. Two publications in the thesis are based on this strategy (paperI and IV). The second strategy is based on the utilization of fluorescence intensityfluctuations in order to detect the oligomerization mechanisms of fluorescentlylabeled peptides and proteins. This strategy combines the intensity fluctuationanalysis and the readout of distance dependent energy transfer between fluorescentmolecules together with the correlation analysis of fluorescence from two labeledproteins emitting at different wavelengths. Another two publications presented inthe thesis are based on the second comprehensive strategy (papers II and III).The work presented in this thesis shows that the blinking kinetics of fluorescentlabels contain significant information that can be exploited by a combination of fluctuationsanalysis with distance dependent excitation energy transfer between thefluorescent molecules, or by analysis of fluorescence covariance between moleculesthat emit at different wavelengths. These fluorescence-based methods have a significantpotential for molecular interaction studies in the biomedical field. / <p>QC 20160527</p>

The molecular cloning and subsequent engineering of the green fluorescent protein (GFP) of the jellyfish Aequoria victoria allowed a novel approach to the investigation of cell signalling. GFP and its mutants can now not only be used to target specific organelles in living cells but also function as a basis for a variety of sensors for biologically important ions and molecular interactions. GFP-based Ca2+- sensors have been successfully used for studies in mammalian and plant cells. In filamentous fungi, however, they have not yet been reported to work. Since only little is known about calcium signalling in filamentous fungi, this project aimed to improve existing GFP-based Ca2+- sensors by exchanging the original fluorophores for improved versions and expressing those in the filamentous fungus Aspergillus niger. During this project, the donor and acceptor fluorophores of 3 existing Ca2+-FRETprobes based on cameleons and troponin C-sensors, have been changed, 2 novel positive FRET controls have been designed and these , as well as donor and acceptor fluorophores alone, have been expressed in the filamentous fungus Aspergillus niger. The probes were assessed using different imaging techniques, such as conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM), fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) and spectral imaging using a Leica TSC SP5 confocal and IRIS, a novel spectral imaging device designed at Heriot Watt University. Problems were encountered that prevented FRET analysis using CLSM and IRIS. These were due mainly to the difference in expression level of the constructs and the distribution of the emission bandpasses of the IRIS system. Analysis of the spectral data obtained on the Leica confocal system and analysis of the FLIM results, however, revealed significant differences between the donor only and the positive FRET controls. Spectra of the positive FRET controls and the Ca2+-sensitive probes showed emission peaks of both the donor and the acceptor fluorophores upon excitation of the donor fluorophore alone while analysis of the FLIM results revealed an additional decay component in the positive FRET controls. Both results are very strong indicators that we can detect FRET in living hyphae of Aspergillus niger transformed with the probes designed during this project.

<p>Multiple lines of evidence reveal that activation of the tropomyosin related kinase B (TrkB) receptor is a critical molecular mechanism underlying status epilepticus (SE) induced epilepsy development. However, the cellular consequences of such signaling remain unknown. To this point, localization of SE-induced TrkB activation to CA1 apical dendritic spines provides an anatomic clue pointing to Schaffer collateral-CA1 synaptic plasticity as one potential cellular consequence of TrkB activation. Here, we combine two-photon glutamate uncaging with two photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM) of fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based sensors to specifically investigate the roles of TrkB and its canonical ligand brain derived neurotrophic factor (BDNF) in dendritic spine structural plasticity (sLTP) of CA1 pyramidal neurons in cultured hippocampal slices of rodents. To begin, we demonstrate a critical role for post-synaptic TrkB and post-synaptic BDNF in sLTP. Building on these findings, we develop a novel FRET-based sensor for TrkB activation that can report both BDNF and non-BDNF activation in a specific and reversible manner. Using this sensor, we monitor the spatiotemporal dynamics of TrkB activity during single-spine sLTP. In response to glutamate uncaging, we report a rapid (onset less than 1 minute) and sustained (lasting at least 20 minutes) activation of TrkB in the stimulated spine that depends on N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR)-Ca2+/Calmodulin dependent kinase II (CaMKII) signaling as well as post-synaptically synthesized BDNF. Consistent with these findings, we also demonstrate rapid, glutamate uncaging-evoked, time-locked release of BDNF from single dendritic spines using BDNF fused to superecliptic pHluorin (SEP). Finally, to elucidate the molecular mechanisms by which TrkB activation leads to sLTP, we examined the dependence of Rho GTPase activity - known mediators of sLTP - on BDNF-TrkB signaling. Through the use of previously described FRET-based sensors, we find that the activities of ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1) and cell division control protein 42 (Cdc42) require BDNF-TrkB signaling. Taken together, these findings reveal a spine-autonomous, autocrine signaling mechanism involving NMDAR-CaMKII dependent BDNF release from stimulated dendritic spines leading to TrkB activation and subsequent activation of the downstream molecules Rac1 and Cdc42 in these same spines that proves critical for sLTP. In conclusion, these results highlight structural plasticity as one cellular consequence of CA1 dendritic spine TrkB activation that may potentially contribute to larger, circuit-level changes underlying SE-induced epilepsy.</p> / Dissertation

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Thesis advisor: Abhishek Chatterjee / Förster Resonance Energy Transfer (FRET) offers a powerful approach to study biomolecular dynamics in vitro as well as in vivo. The ability to apply FRET imaging to proteins in living cells provides an excellent tool to monitor important dynamic events such as protein conformational changes, protein-protein interactions, and proteolysis reactions. However, selectively incorporating two distinct fluorophores into the target protein(s) that are capable of FRET interaction within the complex cellular milieu is challenging. Consequently, terminal fusion to genetically encoded fluorescent proteins has emerged as the predominant labeling strategy for FRET studies in vivo. However, a major limitation of this strategy stems from the large size of the fluorescent proteins, which may perturb the native properties of the target, and restricted attachment only to the termini of the target. We reasoned that using genetically encoded fluorescent unnatural amino acids would overcome several of these challenges associated with currently available labeling strategies owing to their small size and the ability to introduce them site- specifically and co-translationally. Here, we report the use of the fluorescent unnatural amino acid “Anap” as a FRET donor with green and yellow fluorescent protein acceptors. We demonstrate the utility of this labeling strategy using proteolysis and conformational change models, and step towards in vivo studies by further developing a proteolysis system in cell lysates. / Thesis (MS) — Boston College, 2016. / Submitted to: Boston College. Graduate School of Arts and Sciences. / Discipline: Chemistry.