Les nouvelles exigences du diagnostic clinique et de la thérapeutique, particulièrement en termes d’examens au chevet du patient et en médecine de précision, ont conduit à une demande croissante d’analyses à la fois multiplexées et présentant un rendement important, et ce d’un grand nombre de biomolécules au sein d’un échantillon unique. La thèse se concentre sur le développement de biosenseurs multiplexés basés sur le transfert d’énergie par résonance de type Förster résolu en temps de complexes de lanthanide vers des colorants organiques ou des boîtes quantiques. Je présente plusieurs techniques novatrices permettant la détection simultanée et multiplexée de protéines biomarqueurs du cancer (récepteur du facteur de croissance épidermique) ou de microARNs (hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-20b-5p et hsa-miR-21-5p) avec de très faibles limites de détection. J’ai utilisé différentes stratégies afin d’obtenir des détections multiplexées telles la détection multiplexée spectrale basée sur les différents spectres d’émission de différents luminophores, et la détection multiplexée temporelle basée sur les durées de vie distinctes des états excités des luminophores. Ces travaux ne sont pas seulement une recherche appliquée qui peut être utilisée en diagnostic clinique, mais constituent également une recherche fondamentale sur le FRET résolu en temps qui ouvre de nouvelles perspectives de détection et augmente considérablement le nombre de biomarqueurs pouvant être détectés. / The new mission of clinical diagnostics and therapeutics, especially in point-of-care testing and precision medicine, has led to an increasing demand for multiplex and high throughput analyses of large numbers of biomolecules within a single sample. The thesis focuses on developing multiplexed biosensors based on time-resolved Förster resonance energy transfer from lanthanide complexes to organic dyes or quantum dots. I present several new techniques to simultaneously and multiplexed detect cancer related protein biomarkers (human epidermal growth factor receptor) or microRNAs (hsa- miR-20a-5p, hsa-miR-20b-5p and hsa-miR-21-5p) with very low limits of detections. I have used different strategies to achieve multiplexed detections such as spectral multiplexed detection based on different emission spectra of different luminophores, and temporal multiplexed detection based on distinguishable excited-state lifetimes of luminophores. The work is not only an applied research that can be used in clinical diagnostics but also a fundamental research of time-resolved FRET, which opens a new dimension of detection and greatly increases the number of biomarkers that can be detected.

This work describes an investigation into the solution-phase binding of anionic guests by bimacrocyclic lanthanide complexes. It outlines the preparation of different classes of complexes bearing two metallic domains, and the effects of association on both the complex and the guest. Chapter one provides a cursory introduction to the fundamental properties of the lanthanides with a focus on luminescence. A brief literature review is given on the use of emissive lanthanide probes for the sensing of analytes. Chapter two concerns the preparation and properties of a series of binuclear complexes in which the two centres are linked with a short spacer group, with the aim of selectively sequestering small anions such as the halides in solution. The concept of luminescence titration will be introduced and then used to assess the binding parameters of a selection of guests. Chapter three describes a related class of ditopic lanthanide complexes in which the two metal centres are separated by a semi-rigid butyne linking group. Luminescence studies are again used to evaluate the binding constants of homologous series of dianions to ascertain how the size, geometry and functionalization of the anionic guest impacts on binding. Chapter four explores the coordination of phosphate species and assesses the ability to bind biologically significant phosphates of some of the complexes from Chapter 3. Chapter five details an investigation into the effects on guest-selectivity of further lengthening the linking unit which separates the two macrocyclic binding domains. Chapter six summarises the work done throughout the thesis and draws some overarching conclusions, as well as highlighting areas for further study. Chapter seven describes the experimental procedures.

Les protéines modifiées ont suscité un grand intérêt en raison de leur taille extrêmement petite par rapport à l'anticorps entier. Ces petites protéines de liaison ont démontré de nombreux avantages tels qu'une bio distribution rapide, une bonne pénétration dans le tissu tumoral et une élimination rapide du sérum et des tissus non-infectés. Ainsi, ces protéines devraient être d'excellentes alternatives aux anticorps pour les applications cliniques. Cette thèse présente le développement de biocapteurs basés sur des anticorps synthétiques et le transfert d'énergie par résonance de type Förster (FRET) résolu en temps par la détection de biomarqueurs. Les tests immunologiques à base de FRET sont établis en utilisant des complexes de terbium (Tb) comme donneurs de FRET et des boîtes quantiques semi-conducteurs (QDs) comme accepteurs de FRET. Les propriétés photophysiques exceptionnelles de ce couple de FRET Tb-QD permettent une détection quantitative ultrasensible. Des anticorps monocaténaires (single-domain antibody, sdAb) et des petites protéines d’affinité synthétiques (albumin-binding domain-derived affinity protein, ADAPT) sont utilisés pour étudier différentes stratégies de conjugaison d'anticorps, et quantifier des biomarqueurs cliniques (EGFR, HER2). Ce travail peut être considéré comme une condition préalable à l’utilisation des QDs en diagnostic clinique. / Engineered affinity proteins have raised great interest due to their extremely small size compared to full length antibodies. Such small binding proteins have demonstrated many advantages such as quick biodistribution, good penetration into tumor tissue, and fast elimination from serum and nondiseased tissues. Thus, they are expected to be excellent alternatives to antibodies for clinical applications. This thesis focuses on the development of biosensors based on engineered antibodies and time-resolved Förster resonance energy transfer (FRET) through biological recognition of biomarkers. FRET-based immunoassays are established using terbium complexes (Tb) as FRET donors and semiconductor quantum dots (QDs) as FRET acceptors. The exceptional photophysical properties of the Tb-QD FRET pair allow for ultrasensitive quantitative biosensing. Single-domain antibodies (sdAb) and small engineered scaffold antibodies (ADAPT) are used to investigate different antibody-conjugation strategies for quantifying human epidermal growth factor receptors (EGFR, HER2) as clinical biomarkers. This work can be considered as a prerequisite to implementing QDs into applied clinical diagnostics.

Cette thèse concerne le développement de complexes de lanthanide et leur utilisation pour résoudre les structures de macromolécules biologiques par diffraction des rayons X, en particulier celles de protéines membranaires et de complexes protéiques de grande taille. Les complexes de lanthanide sont formés d’un atome de lanthanide et d’un ligand chimique qui assure une liaison non-covalente avec les surfaces protéiques. Introduits dans les cristaux de protéine, ces derniers constituent une sous-structure qui, déterminée par les méthodes de phasage de novo courantes, permet de résoudre la structure de la macromolécule d’intérêt. La première partie de ce travail de thèse est une étude menée sur la grande famille des complexes picolinates de lanthanide, complexes luminescents dont la fixation au sein des cristaux est aisément décelable. En premier lieu, nous avons défini les conditions dans lesquelles le complexe tris-dipicolinate de lanthanide peut être utilisé ainsi que ses éventuelles capacités à promouvoir la cristallisation (effet supramoléculaire). En second lieu, un nouveau complexe, dérivé du précédent, a été développé au cours de cette thèse : le tris-hydroxymethyltriazoledipicolinate de lanthanide (« [Ln(TDPA)3]3- »). Il nous a permis de réaliser un phasage de novo très précis conduisant à la détermination des structures du lysozyme de blanc d’œuf de poule et de la thaumatine de Thaumatococcus daniellii à haute résolution. Par ailleurs, différents ligands pour ce nouveau complexe ont été synthétisés par chimie-click, nous permettant de créer une panoplie de complexes uniques et des complexes hybrides. Nous avons montré que cette nouvelle famille de complexes présente une meilleure affinité pour les protéines permettant leur utilisation à de faibles concentrations. Les essais menés avec ces LnTDPA ont aussi permis d’entrevoir l’importance de la charge globale pour expliquer l’effet supramoléculaire. En troisième lieu, un tripicolinate cagé, le LnTNTPA, a également été évalué. Constitué d’une cage chimique de charge globale nulle, nous avons montré que ce nouveau complexe luminescent est le seul de cette famille picolinate qui puisse être utilisé en présence d’ions divalents. Dans la seconde partie de cette thèse, nous décrivons l’utilisation des complexes de lanthanide pour le phasage de protéines multimériques de grandes tailles par les méthodes de phasage de novo. Premièrement, la structure de l’aminopeptidase dodécamérique PhTET1-12s de 480 kDa a été déterminée à 4 Å de résolution à l’aide du tris-dipicolinate d’europium. Ceci nous a permis de démontrer que les complexes de lanthanide peuvent être utilisés pour obtenir un phasage précis, même à basse résolution. Deuxièmement, les complexes de lanthanide issus de l'imagerie médicale ont aussi permis de déterminer la structure de trois nouvelles enzymes homotétramériques de la famille des malate déshydrogénases. Ces structures permettent d’apporter de nouveaux éclaircissements sur l'adaptation halophile. Enfin, en utilisant ces enzymes en tant que bibliothèque de fonctions chimiques, nous avons pu mettre en place une nouvelle approche méthodologique pour comprendre finement les modes d'interaction des complexes de lanthanide. / This thesis aims to develop lanthanide complexes for solving biological macromolecular structures, especially membrane proteins and large protein complexes. Lanthanide complexes are composed of a lanthanide atom and a chemical ligand, which provides non-covalent binding to protein surfaces. Incorporated in protein crystals, they make up the substructure, determined by the widely-used de novo phasing methods, needed for solving the whole protein structure. The first part of the present work shows a study of the luminescent lanthanide picolinate complexes family, easily detectable in protein crystals. First, we defined the conditions in which the known lanthanide tris-dipicolinate can be used and we examined its possible ability to promote protein crystallization (supramolecular effect). Secondly, a newly developed lanthanide tris hydroxymethyltriazoledipicolinate complex "[Ln(TDPA)3]3-", derived from this previous complex, allowed us to obtain a very precise de novo phasing for solving the high-resolution structure of the hen egg white lysozyme and the thaumatin from Thaumatococcus daniellii. Besides, various ligands for these new complexes were synthetized by click chemistry, enabling us to create both unique complexes outfit and hybrid complexes. We have shown that this new complexes family presents a better affinity for proteins allowing their use at very low concentrations. Tests conducted with those LnTDPA have also evidenced the importance of complex global charge to explain the supramolecular effect. Third, a caged tripicolinate, the LnTNTPA, was evaluated. Characterized by a neutrally charged chemical cage, we have shown that this new luminescent complex is the only one of the picolinate complexes family that can be used in the presence of divalent ions. In the second part of this thesis, we describe the use of lanthanide complexes for phasing large multimeric proteins by de novo phasing methods. First, the structure of the 480 kDa dodecameric aminopeptidase PhTET1-12s was solved at 4 Å resolution by using the europium tris-dipicolinate which demonstrates that the lanthanide complexes can be used to obtain an accurate phasing, even at low resolution. Secondly, the lanthanide complexes from medical imaging also helped to solve the structures of three new homotetrameric enzymes from the malate dehydrogenases family. Those structures provide new insights into halophilic adaptation. Finally, by using these enzymes as a library of chemical functions, we developed a new methodological approach for a better understanding of the precise binding modes of those lanthanide complexes.

Le transfert d'énergie par résonance de type Förster (FRET) est un transfert d'énergie non radiatif d'un donneur à un accepteur à proximité. En raison de sa dépendance de la distance extrêmement sensible entre env. 1 et 20 nm, FRET joue un rôle important dans la nanobiotechnologie. Ainsi FRET peut être utilisé comme système de transduction du signal, mais aussi pour l'estimation de la distance entre le donneur et l'accepteur.Les accepteurs de FRET utilisés dans ce travail étaient des nanocristaux semi-conducteurs (quantum dots, QD). Ce type de luminophore est bien connu pour ses propriétés photophysiques supérieures. Leur absorption forte et spectralement large, et leur photoluminescence (PL) brillante et spectralement fine et de l'accordabilité spectrale de la PL sont idéalement adaptés aux applications de FRET. La combinaison des QDs comme accepteurs de FRET avec des complexes luminescents de terbium (CLT) comme donneurs permet des grandes distances de FRET (> 10 nm). La distance de FRET est caractéristique d'une paire FRET et décrit la distance à laquelle l'efficacité de FRET est égale à 50%. CLT sont idéal comme donneurs de FRET parce qu'ils fournissent des longues durées de vie des états excités à l'ordre de la milliseconde. Cette longue période de décroissance de PL permet de mesurer en temps décalé pour une répression d’autofluorescence et la PL des QDs directement excités, ce qui augmente fortement la sensibilité de détection. Les bandes d'émission de PL structurés de CLT et la PL accordable de QDs sont idéales pour l'application dans le diagnostic multiplexé.La thèse se compose de deux parties. Dans la première le couple FRET CLT-QD a été utilisé dans des immunodosages de FRET homogènes pour la détection de marqueurs biologiques antigène prostatique spécifique (TPSA), énolase specifique des neurones (NSE), antigène carcino-embryonnaire (CEA), et le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR). La sensibilité du dosage immunologique a été optimisé en utilisant des différents types d'anticorps IgG, F (ab')2, F (ab), et pour EGFR un anticorps de chaîne lourde unique. Des limites de détection picomolaires étaient réalisées en utilisant des échantillons de sérum de petit volume et des mesures sur des lecteurs de microplaques cliniques. Une étude détaillée des différents systèmes de FRET en utilisant la spectroscopie résolue en temps a été réalisée pour étudier l'influence des différents anticorps sur la distance, la fonctionnalité, et la sensibilité des immunodosages. L'étude a été complétée par la mesure de NSE et CEA dans un format duplexé et des échantillons réels de patients.Dans la deuxième partie le FRET pour des mesures de distance nanométriques (réglette moléculaire ou spectroscopique) étaient étudiés. FRET en résolution temporelle a permis de calculer la distance entre le donneur et l’accepteur. Par conséquent, deux stratégies de liaisons différentes ont été étudiées pour établir une proximité entre le CLT et le QD : la reconnaissance biotine-streptavidine et l’auto-assemblage médié par polyhistidine. Une étude en résolution temporelle détaillée a été effectuée avec des QDs de différentes tailles, formes et revêtements de surface combiné avec des CLT liés à trois différentes biomolécules. L'analyse des courbes de décroissance multiexponentielle des donneurs et accepteurs permettait à obtenir des informations sur la taille, la forme et la biofonctionnalité des bioconjugués CLT-QD. Les résultats étaient en accord avec d'autres méthodes d'analyse de structure, telles que la microscopie électronique à transmission (MET) ou la diffusion de lumière dynamique (DLS), mais avec l'avantage d'une mesure homogène à la résolution 3-dimensionelle (impossible pour le MET), sans l'inclusion d'une couche d'hydratation (l’inconvénient de DLS) et en faible concentration dans le même environnement que celui utilisé pour l'application biologique. / Förster resonance energy transfer (FRET) is a non-radiative energy transfer from a donor to an acceptor in close proximity. Due to its extremely sensitive distance dependence in the 1 – 20 nm range, FRET plays an important role in nanobiotechnology. Thereby FRET can be used as signal transduction system but also for the distance estimation between donor and acceptor. The selected FRET acceptors in this work were semiconductor nanocrystals (quantum dots, QDs). This type of luminophore is well known for its superior photophysical properties. Their strong and broad absorption and their bright, narrow-band, and size-tunable photoluminescence (PL) emission make QDs ideally suited for FRET application. Combing QDs as FRET acceptors with luminescent terbium complexes (LTC) as FRET donors offers exceptionally large Förster distances of more than 10 nm. The Förster distance is characteristic of a FRET pair and is the distance at which the FRET efficiency equals 50 %. A large Förster distance is desirable as it offers the detection of biological interactions over large distances. LTC are suitable FRET donors for QDs because they provide long excited-state lifetimes in the millisecond range. This long PL decay time enables time-gated measurements for the suppression of autofluorescence and PL of directly excited QDs, which strongly increases the detection sensitivity. Additionally, the structured PL emission bands of LTCs together with the size-tunable PL emission bands of QDs make this FRET pair ideal for the application in multiplexed diagnostics, which is the measurement of multiple biomarkers in a single sample.The PhD thesis consists of two parts. In the first part the LTC-QD FRET pair was used within homogeneous FRET immunoassays for the detection of the biomarkers prostate specific antigen (TPSA), neuron-specific enolase (NSE), carcinoembryonic antigen (CEA), and epidermal growth factor receptor (EGFR). The immunoassay sensitivity was optimized using different types of antibodies IgG, F(ab’)2,F(ab), and for EGFR single heavy chain antibodies, which differ largely in their size. The use of small-volume serum samples and measurements on clinical as well customized fluorescence plate readers result in picomolar detection limits for all measured biomarkers. In addition to these QD-based in vitro diagnostic tests, a detailed study of the different FRET-systems using time-resolved spectroscopy was performed. The investigation revealed the influence of the different antibodies on distance, functionality, and sensitivity of the FRET immunoassays. The study was completed by the measurement of NSE and CEA in a duplexed format and real patient samples were investigated.The second part was to use FRET for nanometric distance measurements as molecular or spectroscopic ruler. Time-resolved FRET measurements enabled the calculation of the distance between donor and acceptor. Therefore two different binding strategies were investigated to establish a close proximity between the LTC-donor to the QD-acceptor, namely biotin-streptavidin recognition and polyhistidine mediated self-assembly. A detailed time-resolved study was performed of QDs with different sizes, shapes, and surface coatings in combination with LTC bound to three different host biomolecules, which also possessed different sizes, shapes, orientations, and binding conditions. The analysis of the multi-exponential decay curves of donor and acceptor allowed to obtain information about the size, shape, and biofunctionality of the investigated QD bioconjugates. The results were in agreement with other structural analysis methods, such as transmission electron microscopy (TEM) or dynamic light scattering (DLS), but with the advantage of a homogeneous measurement with three-dimensional resolution (not possible for TEM), without the inclusion of a hydration shell (drawback for DLS), and at low concentration in the same environment as used for the biological application.

Le projet de recherche de cette thèse a pour ambition la conception de nouveaux récepteurs moléculaires artificiels exploitant les propriétés complexantes des calixarènes, des éther-couronnes et des complexes insaturés de lanthanides liées aux propriétés photophysiques et photochimiques de photochromes spiropyraniques. L’alliance supramoléculaire ainsi formée doit permettre d’exploiter les processus de photoéjection et ensuite de détection par un site distant, c’est-à-dire d’établir une communication à l’échelle moléculaire grâce à la lumière. Un récepteur moléculaire employant le calix[4]arène substitué sur un bord par une aza-éther-couronne et sur l’autre bord par des groupements pyrène a été synthétisé et ses capacités à complexer différents cations ont été étudiées ; la migration des ions à travers la cavité du calix[4]arène provoquée par protonation a également été examinée. De même, des aza-éther-couronnes substituées par des spiropyranes ont été synthétisées et ont été étudiées dans le but d’établir une communication avec un récepteur fluorescent. Enfin, un exemple de complexe d’europium(III) dont la luminescence est photocontrôlée est montré. La stratégie de photoncontrôle est démontrée et optimisée dans les milieux organisés que sont les micelles. / The research project of this thesis focuses on the development of new artificial molecular receptors based on the complexation properties of calix[4]arenes, crown ethers and coordinatively unsaturated lanthanide complexes as well as photochromic spiropyrane derivatives : while the fluorescent receptors detect the presence of ions, the photochromes can reversibly release protons and metal ions. The supramolecular alliance of these moieties should allow processes such as photoejection and then detection, thus setting up molecular communication induced by light. A molecular receptor based on a calix[4]arene which one of the rims is substituted by an azacrown ether and the other one by pyrenes was synthetised and its ability to complexe several cations was studied ; the cation migration through the calix[4]arene cavity provoked by protonation was also investigated. Equally, two azacrown ethers substituted by spiropyrans were synthetised and studied in order to establish communication between them and fluorescent receptors. In a different approach, a proof-of-principle example of an Europium(III) complex whose luminescence is photocontrolled via the intermediacy of a molecular messenger is given, proving optimal in micellar domains.

Les biomarqueurs à base d’acides nucléiques, qui sont impliqués dans le contrôle de l'expression génétique, sont spécifiques de nombreux types de cancers. Les applications basées sur le transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET) sont parmi les plus prometteuses pour la biodétection d’acides nucléiques. Comme la détection simultanée de plusieurs acides nucléiques est très demandée et que le multiplexage spectral est limité par des interférences (optical crosstalk), le multiplexage temporel est utilisé ici pour ajouter de nouvelles possibilités de multiples détections simultanées. La thèse porte sur le développement de systèmes comprenant différentes distances entre molécules donneuses et acceptrices de FRET (Terbium vers fluorophores) pour créer des signaux d'intensité spécifiques correspondant à différentes séquences d'acides nucléiques. Les distances Tb-to-dye peuvent être arrangées en positionnant spécifiquement le donneur Tb sur des molécules d’ADN de différentes longueurs. Les technologies d'amplification d’acides nucléiques, telles que la réaction d'hybridation en chaîne (HCR) et l’amplification circulaire de l’ADN (RCA), ont été utilisées pour obtenir simplicité, rapidité, sélectivité et sensibilité dans la détection d’acides nucléiques. Le multiplexage temporel du signal de FRET a également été combiné avec le multiplexage spectral (couleur) pour le démultiplier. De plus, la possibilité d'un multiplexage temporel à base de nanoparticules a été démontrée. / Nucleic acid biomarkers, which involve in gene expression control, are found specific for many kinds of cancers. Förster Resonance Energy Transfer (FRET) based applications are one of the most promising for nucleic acid biosensing. As parallel detection of multiple nucleic acids is highly demanded and spectral multiplexing is limited by optical crosstalk, temporal multiplexing is used for opening another dimension of the multiplexing. The thesis focuses on developing different Tb-to-dye FRET distances to create specific intensity signals corresponding to different nucleic acid sequences. The Tb-dye distances can be tuned by specific location of the Tb donor using different lengths of DNA. Amplification technologies, such as hybridization chain reaction (HCR) and rolling circle amplification (RCA), are used to achieve simplicity, rapidity, selectivity, and sensitivity of nucleic acid detection. Temporal multiplexing FRET was also combined with spectral (color) multiplexing for higher order multiplexed detection. Moreover, a single Tb-QD FRET modeling demonstrated the possibility of nanoparticle-based temporal multiplexing.