Research suggests that specific compositions of gut microbiota can directly affect energy harvesting and fat storage, which may indicate a potential role of intestinal bacteria in the regulation of body weight (i.e., obesity). The purpose of the current study was to determine if prebiotic- and probiotic-based diets modify gut microbiota in genetically obese rodents. For this, female Zucker diabetic fatty (ZDF) rats were assigned diets containing fructooligosaccharides (FOS), Bifidobacterium (BIF), or Lactobacillus (LAC) for three weeks. qPCR was then used to measure levels of colonic Bifidobacterium, Lactobacillus, and total bacteria. At termination, there was no significant difference in Lactobacillus levels between diets. However, there was significantly less Bifidobacterium in BIF vs. FOS or LAC-fed rats. The evidence in this study shows there were no significant differences in Lactobacillus levels between any of the feeding groups and the control group, supporting the conclusion that ingestion of any of the tested supplemented feed does not statistically modulate Lactobacillus numbers in female ZDF rats. However, the rats from the Bifidobacterium and FOS feeding groups had significantly higher colonic Bifidobacterium levels than the control group from ingesting the supplemented feed, indicating that the presence of the probiotic Bifidobacterium animalis subspecies lactis and the prebiotic FOS stimulated the growth of Bifidobacterium.

Une consommation de fibres alimentaires adéquate semble protéger du risque de développer un diabète de type 2 dont a contrario la prévalence ne cesse de progresser à travers le monde. Parmi les mécanismes d'action pouvant expliquer comment les fibres contribuent à l'homéostasie du glucose et à la sensibilité à l'insuline, l'implication du microbiote intestinal semble aujourd'hui très probable. Cependant il n'est pas toujours aisé de différencier ses effets de ceux pouvant découler d'une réduction de l'indice glycémique voir de ceux induits par des micronutriments parfois associés aux fibres. Les travaux de cette thèse ont permis de confirmer que les fructo-oligosaccharides (FOS), fibres prébiotiques peu visqueuses, peuvent améliorer la sensibilité à l'insuline de différents modèles animaux d'obésité induite par le régime alimentaire. La réduction de la sensibilité à l'insuline induite par le surpoids n'est pas complètement contrebalancée par les FOS mais leurs effets sont visibles même sans perte de poids associée. D'autre part une corrélation directe entre les modifications de la composition et des activités du microbiote intestinale induites par les FOS et le métabolisme de l'hôte a pu être mise en évidence. Au-delà d'une augmentation des bifidobactéries déjà bien documentée, les travaux de cette thèse ont révélé la modulation par les FOS d'autres clusters bactériens plus prépondérants au sein de l'écosystème digestif comme ceux des Clostridium leptum et Clostridium coccoides – Eubacterium rectale. En modulant ces populations, les FOS influencent le métabolisme des acides biliaires et le niveau d'hydroxylation d'acides gras monoinsaturés. / An adequate intake of dietary has proven to protect against the risk to develop type 2 diabetes, for which the prevalence is currently increasing all around the world. Among the different mechanisms that could explain how dietary fibres can contribute to insulin sensitivity and glucose homeostasis, involvement of the gut microbiota seems more than likely. However it is not always possible to differentiate the effects that linked to the microbiota from those induced a reduction of the glycaemic index or those induced by some micronutrients sometimes closely associated to dietary fibres. The experiments conducted during this PhD validate that fructo-oligosaccharides (FOS), poorly viscous prebiotic fibres, can enhance insulin sensitivity if different animal models of diet-induced obesity. Reduction of insulin sensitivity resulting from overweight status is not completely solved by FOS but their effect is not linked to weight loss. Moreover, a direct correlation between the modifications of the composition and activities of the intestinal microbiota triggered by FOS and metabolism of the host has been highlighted. This work reveals that more than a single increase of Bifidobacteria already well documented, FOS can alter other bacterial clusters more predominant within the digestive ecosystem like Clostridium leptum and Clostridium coccoides – Eubacterium rectale. By modulating these populations, FOS will alter the metabolism of biliary acids and the level of monounsaturated fatty acids hydroxylation.

Thesis (PhD)--Stellenbosch University, 2015. / ENGLISH ABSTRACT: β-fructofuranosidases are hydrolytic enzymes that act on sucrose to yield the products glucose and fructose. Under high substrate conditions these enzymes display fructosyltransferase activity which results in the synthesis of fructooligosaccharides (FOS). Some enzymes display higher propensities for FOS synthesis than others, with the determinants of this activity remaining unclear. The consumption of FOS produces a prebiotic effect that positively alters the composition of the colonic microflora, and as a result is linked to improved human and animal health. The increased demand for FOS has necessitated the industrial production of these nutraceuticals. In enzymatic sucrose biotransformation processes operating at high substrate loading and temperatures between 50 and 60°C, β-fructofuranosidase activity is negatively influenced by glucose product inhibition and thermal instability. The aim of this study was therefore to engineer the Aspergillus japonicus β-fructofuranosidase, FopA, to improve a FOS synthesis bioprocess. A dual approach was employed to engineer FopA so as to increase the probability of obtaining an improved enzyme variant(s). A random mutagenesis approach was applied to harness the potential of the randomness of introduced mutations as precise structural knowledge of the enzyme regions involved in the phenotypic presentation of product inhibition, specific activity and thermal stability was unavailable. A semi-rational approach afforded the additional opportunity to reduce the number of variants to be screened, yet theoretically increased the functional content of the library. This study details the development of a method to rapidly quantify FOS using Fourier transform mid infrared attenuated total reflectance spectroscopy and multivariate data analysis. The method offers improvements over conventionally used high performance liquid chromatography in terms of reduced sample analysis times and the absence of toxic waste products. This is the first report on the direct screening of an enzyme variant library for FOS synthesis to identify improved variants and will significantly support future engineering of β-fructofuranosidases using random mutagenesis approaches. The random mutagenesis approach yielded a variant displaying limited relief from glucose inhibition. At the peak difference in performance, the variant produced 28% more FOS from the same amount of sucrose, when compared to the parent. The semi-rational approach, using a combined crystal structure and evolutionary-guided approach, yielded a four amino acid combination variant displaying improved specific activity and thermostability that was able to reduce the time to completion of an industrial-like FOS synthesis reaction by 26%. The positive outcome of the semi-rational approach showed that engineering loops regions in an enzyme is a feasible strategy to improve both specific activity and thermostability, most probably due to the modification of enzyme structural flexibility. A bioinformatic tool that enables the identification of β-fructofuranosidases displaying high-level FOS synthesis from protein sequence alone was also developed during the study. These investigations revealed conserved sequence motifs characteristic of enzymes displaying low- and high-level FOS synthesis and a structural loop, unique to the latter group, that were readily applicable identifiers of FOS synthesis capacity. The tool presented may also be useful to improve the understanding of the structure-function relationships of β-fructofuranosidases by facilitating the identification of variations in groups of enzymes that have been functionally sub-classified. / AFRIKAANSE OPSOMMING: β-fruktofuranosidases is hidrolitiese ensieme wat op sukrose inwerk en glukose en fruktose as produkte vorm. Onder toestande met hoë substraatkondisies vertoon hierdie ensieme fruktosieltransferase-aktiwiteit wat tot die sintese van frukto-oligosakkariede (FOS) lei. Sommige ensieme neig na ʼn hoër FOS-sintese as ander, maar die bepalende faktore vir hierdie aktiwiteit is nog onbekend. Die verbruik van FOS veroorsaak ʼn prebiotiese effek wat die samestelling van kolon mikroflora positief beïnvloed en met verhoogde mens- en dieregesondheid verbind word. Die verhoogde aanvraag vir FOS het die industriële produksie van hierdie nutraseutiese middel genoodsaak. Tydens ensiemgedrewe sukrose-biotransformasieprosesse by hoë substraatladings en temperature tussen 50 en 60 °C, word β-fruktofuranosidase-aktiwiteit negatief deur glukose produkonderdrukking en termiese onstabiliteit beïnvloed. Die doel van hierdie studie was dus om die Aspergillus japonicus β-fruktofuranosidase, FopA, vir ʼn verbeterde FOS-sintese bioproses te manipuleer. ʼn Tweeledige benadering is vir FopA manipulasie gevolg om die waarskynlikheid van verbeterde variant(e) te verhoog. ʼn Lukrake mutagenese benadering, wat die potensiaal van ingevoegde mutasie ewekansigheid inspan, is in die lig van onvoldoende akkurate kennis van die strukturele gedeeltes betrokke by produkinhibisie-, spesifieke aktiwiteit- en termiese stabiliteit fenotipes gevolg. Die toepassing van ʼn semi-rasionele benadering het ook geleentheid vir die sifting van ʼn kleiner variantbibioloteek geskep, terwyl die funksionele inhoud teoreties verhoog word. Die studie beskryf die ontwikkeling van ʼn metode vir die vinnige kwantifisering van FOS, gebaseer op Fourier transform middel infrarooi geattenueerde totale refleksie spektroskopie en meerveranderlike data-analise. Dit is die eerste melding van ʼn direkte sifting van ʼn ensiemvariantversameling vir FOS-sintese om verbeterde variante te identifiseer, en kan die toekomstige manipulasie van β-fruktofuranosidases deur middel van lukrake mutagenese-benaderings beduidend ondersteun. Die lukrake mutagenese-benadering het ʼn variant met beperkte opheffing van glukose-onderdrukking gelewer. By die punt waar die prestasie die meeste verskil, het die variant 28% meer FOS vanaf dieselfde hoeveelheid sukrose geproduseer in vergelyking met die ouer-ensiem. Die semi-rasionele benadering, gegrond op ʼn kombinasie van kristalstruktuur en evolusionêre-geleide benaderings, het ʼn vier-aminosuurkombinasie variant met hoër spesifieke aktiwiteit en termostabiliteit gelewer wat die voltooiingstyd van ʼn tipiese industriële FOS sintesereaksie met 26% kon verkort. Die positiewe uitkoms van die semi-rasionele benadering het aangedui dat manipulasie van die lusgedeeltes in ʼn ensiem ʼn lewensvatbare strategie is om beide spesifieke aktiwiteit en termostabiliteit te verbeter, moontlik as gevolg van wysigings in die buigsaamheid van die ensiemstruktuur. ʼn Bioïnformatika-hulpmiddel vir die identifikasie van β-fruktofuranosidases met hoë vlakke van FOS-sintese op grond van proteïenvolgordes is ook tydens die studie ontwikkel. Motiewe met gekonserveerde volgordes kenmerkend van lae- en hoë-vlak FOS-produserende ensieme en ʼn strukturele lus, uniek tot die laasgenoemde groep, is tydens die ondersoek onthul wat as maklike identifiseerders van FOS-sintesekapasiteit kan dien. Die voorgestelde hulpmiddel kan ook nuttig wees om die struktuur-funksie-verwantskap van β-fruktofuranosidases beter te verstaan deur die identifikasie van variasie in ensiemgroepe wat funksioneel gesubklassifiseer is.

Frutanos, frutooligossacarídeos (FOS) e inulina, são carboidratos constituídos de moléculas de frutose, ligadas ou não a uma molécula terminal de sacarose e, devido aos efeitos fisiológicos do seu consumo, são incluídos na categoria das fibras alimentares. Estudos têm demonstrado que os frutanos são intensamente fermentados no intestino grosso proporcionando, desta forma, um ambiente favorável para a absorção dos minerais. No presente trabalho, os efeitos dos FOS, provenientes da Raftilose e da raiz tuberosa do yacón, foram avaliados sobre a biodisponibilidade do Ca e do Mg em ratos em crescimento. Foram realizados dois ensaios biológicos, sendo o 1º de 23 dias (n=16) e o 2º de 27 dias (n=24). Ratos machos da linhagem Wistar Hannover, recém-desmamados, foram submetidos, no 1º ensaio, a dietas suplementadas com Raftilose (5% de FOS) e, no 2º ensaio, com uma farinha de yacón (5 e 7,5% de FOS). Em ambos, os ensaios a ração controle foi elaborada segundo a AIN-93G. Todas as rações foram suplementadas com 7,5g de cálcio/kg de ração. Ração e água foram fornecidas ad libitum. Fezes (1º e 2º ensaios) e urina (2º ensaio) foram coletadas ao longo de 3 períodos experimentais (4º, 10º e 16º dias de experimento) de 5 dias cada. Os animais foram sacrificados e o fígado, o baço e os rins foram removidos e pesados. O ceco foi removido e seu conteúdo e sua parede foram pesados. Após centrifugação do conteúdo, as frações resíduo (R) e sobrenadante (S) foram pesadas e o pH foi determinado na fração S com uma fita indicadora. No 2º ensaio uma porção da parede do ceco e do cólon proximal foram fixados em solução alcoólica de Bouin e posteriormente transferidos para uma solução de etanol a 70%, para análises histológicas. Os ossos (fêmur e tíbia) foram removidos para análises da densidade mineral óssea (DMO), do conteúdo mineral e das propriedades mecânicas (somente o fêmur). As análises de Ca e Mg também foram realizadas nas fezes (absorção aparente), na urina (balanço mineral) e no conteúdo cecal. Os resultados foram avaliados através de análises de variância (ANOVA), sendo considerado um nível de significância de 95%. Foram observados aumentos significativos no peso e no teor de umidade das fezes, e no peso do ceco (conteúdo e parede). O consumo dos FOS estimulou significativamente a absorção e o balanço mineral. Tal efeito ocorreu de maneira menos pronunciada para o Mg. Este aumento foi refletido em maior retenção mineral nos ossos, confirmada pelas análises por espectrofotometria de absorção atômica. Foi observado efeito positivo nas propriedades mecânicas (carga máxima e rigidez) nos fêmures dos animais que consumiram FOS, em relação às dos grupos controles. Não foram observadas diferenças significativas na DMO, em quaisquer das regiões analisadas nos ossos (proximal, medial e distal), entre os grupos experimentais. As análises histológicas demonstraram um pronunciado aumento na profundidade e no número de criptas no ceco, bem como no número de criptas em bifurcação. Os efeitos positivos na absorção intestinal, na retenção mineral e no comportamento mecânico do osso observado no presente estudo, indicam um papel importante dos FOS na manutenção de ossos hígidos. / Fructans, fructooligosaccharides (FOS) and inulin, are carbohydrates comprising fructose molecules linked or not to a terminal sucrose molecule. Because of the biological effects of its consumption, they are considered as fibers. Studies have demonstrated that fructans are intensely fermented in the large intestine, thus rendering a favorable environment to mineral absorption. In the present work, the effects of FOS from Raftilose and from yacon tuberous roots on the bioavailability of Ca and Mg in growing rats were evaluated. Two biological assays were carried out, the first one lasting 23 days (n=16) and the second one lasting 27 days (n=24). In the first assay, weanling male Wistar Hannover rats were fed diets supplemented with Raftilose (5% FOS). In the second assay, they were fed diets supplemented with yacon flour (5 and 7.5% FOS). In both assays, the control diet followed AIN-93G. All diets were supplemented with 7.5g calcium/kg diet. Diet and water were given ad libitum. Feces (first and second assays) and urine (second assay) were collected along the 3 experimental periods (4th, 10th and 16th days of experiment), each period lasting 5 days. The animals were sacrificed and their livers, spleens and kidneys were removed and weighed. The cecum was removed and its contents and wall were weighed. After centrifuging the contents, residues (R) and supernatant (S) were weighed and the pH of S was determined using a chemical tape. In the second assay, portions of the cecum and proximal colon walls were fixed in Bouin’s alcoholic solution and then transfered to a 70% ethanol solution, aiming histological analyses. The bones (femur and tibia) were removed for bone mineral density (BMD) analyses, mineral contents and mechanical properties (only the femur). Ca and Mg analyses were also performed on the feces (apparent absorption), urine (mineral balance) and cecal contents. The results were evaluated using analysis of variance (ANOVA), considering a significance of 95%. Significant increases in the weight and moisture of feces and in the weight of the cecum (contents and wall) were observed. Besides, the consumption of FOS significantly stimulated the absorption and mineral balance, although such an effect was not so evident for Mg. That increase was reflected in a greater bone mineral retention, confirmed through atomic absorption spectrophotometry analyses. A positive effect on mechanical properties (maximum load and hardness) was observed in the femur of animals feeding on FOS, relatively to the control groups. On the other hand, no significant differences in BMD were observed in any of the bone regions analysed (proximal, midshaft and distal) among the experimental groups. Histological analyses demonstrated a noticeable increase in the depth and number of cecum crypts, as well as in the number of bifurcated crypts. The positive effects on intestinal absorption, mineral retention and mechanical behavior of the bones, observed in the present study, show an important role of FOS in healthy bones.

Orientadores: Gláucia Maria Pastore, Luiz Carlos Basso / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-10-02T14:43:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_JulianaBuenoDa_D.pdf: 2310696 bytes, checksum: 9ca677c093828e2fa9bdd9720ae5939c (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Os frutooligossacarídeos (FOS) são ingredientes de grande importância na indústria de alimentos e têm despertado muita atenção nos últimos anos por possuírem aplicações variadas e apresentarem propriedades prebióticas. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a produção biotecnologica de FOS a partir de micro-organismos osmofílicos em um proceso de biotransformação utilizando células íntegras microbianas. As linhagens de Bacillus sp. e Aureobasidium sp, previamente isoladas de favo-de-mel e identificadas, foram primeiramente avaliadas quantos aos principais parâmetros de produção utilizando a metodologia de Superfície de Resposta, precisamente pelo Placket-Burman (PB), nos quais foram analisados 12 parâmetros para cada um dos microrganismos, dentre eles, a concentração da sacarose, inóculo, extrato de levedura, K2HPO4, (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, ZnSO4, MnSO4.7H2O, pH, temperatura e agitação. O Bacillus sp. apresentou 5 fatores significativos, sendo o pH, temperatura e agitação com efeitos negativos e o extrato de levedura e sulfato de amônia com efeitos positivos. Já o Aureobasidium sp. apresentou efeito positivo apenas para os parâmetros concentração de sacarose e sulfato de magnésio, sugerindo que o melaço de cana-de-açúcar, o qual era utilizado apenas para este microrganismo na etapa de cultivo do inóculo, poderia estar carreando nutrientes essenciais ao processo. A partir desta etapa, o trabalho teve continuidade apenas com a linhagem Aureobasidium sp. utilizando planejamentos experimentais sequenciais, a fim de se obter a faixa ótima de produção de FOS totais para esse processo. O estudo realizado para avaliar o efeito do melaço como meio de cultivo para o crescimento e obtenção do inóculo microbiano para o processo, demonstrou que a suplementação com nutrientes, avaliados na etapa do PB, era desnecessária, e o meio para síntese de FOS foi definido em apenas sacarose sem suplementação de nutrientes, com o inóculo na forma de suspensão celular cultivado previamente em meio a base de melaço. A produção neste momento atingia valores de 287,6 e 251,5 g/L de FOS totais e rendimentos de 72% e 63% em 24 e 48 horas respectivamente, com uma produtividade de 12 g/L.h às 24 horas de incubação. Em seguida foi realizado o planejamento fatorial fracionado para 4 variáveis definidas em tempo de cultivo e concentração do melaço, na etapa do cultivo do inóculo, e concentração de sacarose e de inóculo para a síntese de FOS, cujos apresentaram-se positivos com exceção ao tempo de cultivo que não demonstrou efeito nas condições avaliadas. Os valores de produção atingidos na etapa do fatorial foram de 333 g/L e 354 g/L de FOS totais e rendimentos de 60,5% e 64% em 24 e 48 horas respectivamente, e produtividade de 13,8 g/L.h às 24 horas de incubação. Após esses resultados, fixou-se a concentração do melaço em 10% de açúcares redutores totais, permanecendo apenas a concentração de sacarose e inóculo como variáveis para prosseguir o planejamento. A otimização desses dois fatores por Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR), possibilitou definir 4 modelos significativos ao processo, atingindo faixas ótimas de produção para cada FOS como o GF2, GF3 e GF4, e revelou a condição ótima para o processo em 600 a 650 g/L de sacarose e de 20 a 23% de inóculo, resultando em uma produção de 351 e 374 g/L de FOS e rendimentos de 53,5% e 57% em 24 e 48 horas respectivamente, atingindo uma produtividade de 14,7 g/L.h às 24 horas de incubação. Após definida a condição ótima do processo, o xarope de cana-de-açúcar, que é o caldo concentrado, foi utilizado como substrato alternativo à substituição da sacarose pura na produção de FOS. Os valores de rendimentos obtidos foram de 54%, entretanto as concentração de FOS totais foram de 110 g/L uma vez que a concentração inicial de sacarose no xarope era de apenas 203 g/L. A maioria dos experimentos revelou que o micro-organismo manteve-se viável e em crescimento durante o período de incubação, de acordo com os valores de biomassa e atividade enzimática avaliados nos experimentos. Sendo assim, foi proposto avaliar o processo em um biorreator de bancada de 7L, cujo foi conduzido inicialmente em sistema de batelada e após as 48 horas o processo passou a ser contínuo com taxa de diluição de 0,04.h-1 por mais 72 horas, totalizando 120 horas de cultivo. A concentração média de FOS totais produzidos foi de 228 g/L e uma produtividade média foi de 9 g/L.h / Abstract: Fructooligosaccharides (FOS) are considered food ingredients with very significance for food industry that has receiving attention in the last few years, because of their functional properties for the health as prebiotics and industrial application. The objective of the present work was evaluate the biotechnological production of FOS by osmophilics microorganisms in a biotransformation process using free whole cells. Firstly the effects of production parameters using Bacillus sp. and Auerobasidium sp. strains. was employed by the Response Surface Methodology (RSM) exactly Plackett-Burman Design with 12 variables: concentration of sucrose, inoculum, yeast extract, K2HPO4, (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, ZnSO4, MnSO4.7H2O, pH, temperature and agitation. The Bacillus sp. showed 5 significant parameters, as pH, temperature and agitation with negative effect and yeast extract and ammonium sulfate with positive effect. The Aureobasidium sp. presents positive effect only for sucrose and magnesium sulfate concentration, which suggested the inoculum culture was caring nutrients from sugar cane molasses, that was the base of the inoculum cultivation for Aureobasidium sp. The work has continued only with Aureobasidum sp. applying sequential planning experiments to optimize the process. The experiment for evaluate the molasses effect as inoculum cultivation medium on process showed that nutrients supplementation, used in the PB design, wasn¿t necessary, consequently, the FOS synthesis medium was defined as sucrose, without nutrients supplements and the inoculum as cellular suspension previously cultivated in molasses medium. Total FOS data, at this point, reached 287.6 and 251.5 g/L with 72% and 63% of yield data at 24 and 48 hours respectively, with 12 g/L.h of productivity at 24 hours. Subsequently, the factorial planning was realized with 4 parameters as cultivation time and molasses concentration, in the inoculum cultivation step, and sucrose and inoculum concentration for the FOS synthesis. Almost all these factors showed positive effect, exception of inoculum cultivation time. The total FOS data, at this point, was 333 and 354 g/L with 60.5% and 64% of yield data at 24 and 48 hours respectively, with 13.8 g/L.h of productivity at 24 hours. Regarding these data, the molasses concentration was fixed at 10% of total reduce sugars, remaining only sucrose and inoculum concentration as variables to continue the planning. The two factors optimization was proceed by Central Composite Rotational Design (CCRD) that allowed defined 4 significant process model, aimed optimum production scales for which one FOS, as GF2, GF3 and GF4, that reveals the optimum process condition in 600 to 650 g/L of sucrose and 20 to 23% of inoculum, resulting in 351 and 354 g/L of total FOS data and 53.5% e 57% of yield data at 24 and 48 hours respectively, with 14.7 g/L.h of productivity at 24 hours. After defined the optimum process condition, the sugar cane syrup was evaluated as alternative substrate to pure sucrose for FOS production. The yield data reached was 54%, however the total FOS concentration was 110 g/L due to the small initial sucrose concentration on syrup that was 203 g/L. All the experiments showed significant microorganism growth and increase enzyme activity during the process. For this reason, the process was conducted in a 7L bioreactor, using initially batch system and after 48 hours the system was changed to continuous process with 0.04. h-1 for more 72 hours, with 120 total hours process. Data values showed the 9 g/L.h of productivity and 228 g/L of total FOS concentration / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutora em Ciência de Alimentos

A low, but significant, fraction of the carbohydrate portion of herbaceous biomass may be composed of fructose/fructosyl-containing components (“fructose equivalents”); such carbohydrates include sucrose, fructo-oligosaccharides, and fructans. Standard methods used for the quantification of structural-carbohydrate-derived neutral monosaccharide-equivalents in biomass are not particularly well suited for the quantification of fructose equivalents due to the inherent instability of fructose in conditions commonly used for hemicellulose/cellulose hydrolysis (> 80% degradation of fructose standards treated at 4% sulfuric acid, 121oC, 1 hr). Alternative time, temperature and acid concentration combinations for fructan hydrolysis were considered using model fructans (inulin, β-2,1 and levan, β-2,6) and a grass seed straw (Tall Fescue, Festuca arundinacea) as representative feedstocks. The instability of fructose, relative to glucose and xylose, at higher acid/temperature combinations is demonstrated, all rates of fructose degradation being acid and temperature dependent. Fructans are shown to be completely hydrolyzed at acid concentrations well below that used for the structural carbohydrates, as low as 0.2%, at 121oC for 1 hr. Lower temperatures are also shown to be effective, with corresponding adjustments in acid concentration and time. Thus, fructans can be effectively hydrolyzed under conditions where fructose degradation is maintained below 10%. Hydrolysis of the β-2,1 fructans at temperatures ≥ 50oC, at all conditions consistent with complete hydrolysis, appear to generate difructose dianhydrides. These same compounds were not detected upon hydrolysis of levan, sucrose, or straw components. It is suggested that fructan hydrolysis conditions be chosen such that hydrolysis goes to completion, fructose degradation is minimized, and difructose dianhydride production is accounted for. / Graduation date: 2009

Frutanos, frutooligossacarídeos (FOS) e inulina, são carboidratos constituídos de moléculas de frutose, ligadas ou não a uma molécula terminal de sacarose e, devido aos efeitos fisiológicos do seu consumo, são incluídos na categoria das fibras alimentares. Estudos têm demonstrado que os frutanos são intensamente fermentados no intestino grosso proporcionando, desta forma, um ambiente favorável para a absorção dos minerais. No presente trabalho, os efeitos dos FOS, provenientes da Raftilose e da raiz tuberosa do yacón, foram avaliados sobre a biodisponibilidade do Ca e do Mg em ratos em crescimento. Foram realizados dois ensaios biológicos, sendo o 1º de 23 dias (n=16) e o 2º de 27 dias (n=24). Ratos machos da linhagem Wistar Hannover, recém-desmamados, foram submetidos, no 1º ensaio, a dietas suplementadas com Raftilose (5% de FOS) e, no 2º ensaio, com uma farinha de yacón (5 e 7,5% de FOS). Em ambos, os ensaios a ração controle foi elaborada segundo a AIN-93G. Todas as rações foram suplementadas com 7,5g de cálcio/kg de ração. Ração e água foram fornecidas ad libitum. Fezes (1º e 2º ensaios) e urina (2º ensaio) foram coletadas ao longo de 3 períodos experimentais (4º, 10º e 16º dias de experimento) de 5 dias cada. Os animais foram sacrificados e o fígado, o baço e os rins foram removidos e pesados. O ceco foi removido e seu conteúdo e sua parede foram pesados. Após centrifugação do conteúdo, as frações resíduo (R) e sobrenadante (S) foram pesadas e o pH foi determinado na fração S com uma fita indicadora. No 2º ensaio uma porção da parede do ceco e do cólon proximal foram fixados em solução alcoólica de Bouin e posteriormente transferidos para uma solução de etanol a 70%, para análises histológicas. Os ossos (fêmur e tíbia) foram removidos para análises da densidade mineral óssea (DMO), do conteúdo mineral e das propriedades mecânicas (somente o fêmur). As análises de Ca e Mg também foram realizadas nas fezes (absorção aparente), na urina (balanço mineral) e no conteúdo cecal. Os resultados foram avaliados através de análises de variância (ANOVA), sendo considerado um nível de significância de 95%. Foram observados aumentos significativos no peso e no teor de umidade das fezes, e no peso do ceco (conteúdo e parede). O consumo dos FOS estimulou significativamente a absorção e o balanço mineral. Tal efeito ocorreu de maneira menos pronunciada para o Mg. Este aumento foi refletido em maior retenção mineral nos ossos, confirmada pelas análises por espectrofotometria de absorção atômica. Foi observado efeito positivo nas propriedades mecânicas (carga máxima e rigidez) nos fêmures dos animais que consumiram FOS, em relação às dos grupos controles. Não foram observadas diferenças significativas na DMO, em quaisquer das regiões analisadas nos ossos (proximal, medial e distal), entre os grupos experimentais. As análises histológicas demonstraram um pronunciado aumento na profundidade e no número de criptas no ceco, bem como no número de criptas em bifurcação. Os efeitos positivos na absorção intestinal, na retenção mineral e no comportamento mecânico do osso observado no presente estudo, indicam um papel importante dos FOS na manutenção de ossos hígidos. / Fructans, fructooligosaccharides (FOS) and inulin, are carbohydrates comprising fructose molecules linked or not to a terminal sucrose molecule. Because of the biological effects of its consumption, they are considered as fibers. Studies have demonstrated that fructans are intensely fermented in the large intestine, thus rendering a favorable environment to mineral absorption. In the present work, the effects of FOS from Raftilose and from yacon tuberous roots on the bioavailability of Ca and Mg in growing rats were evaluated. Two biological assays were carried out, the first one lasting 23 days (n=16) and the second one lasting 27 days (n=24). In the first assay, weanling male Wistar Hannover rats were fed diets supplemented with Raftilose (5% FOS). In the second assay, they were fed diets supplemented with yacon flour (5 and 7.5% FOS). In both assays, the control diet followed AIN-93G. All diets were supplemented with 7.5g calcium/kg diet. Diet and water were given ad libitum. Feces (first and second assays) and urine (second assay) were collected along the 3 experimental periods (4th, 10th and 16th days of experiment), each period lasting 5 days. The animals were sacrificed and their livers, spleens and kidneys were removed and weighed. The cecum was removed and its contents and wall were weighed. After centrifuging the contents, residues (R) and supernatant (S) were weighed and the pH of S was determined using a chemical tape. In the second assay, portions of the cecum and proximal colon walls were fixed in Bouin’s alcoholic solution and then transfered to a 70% ethanol solution, aiming histological analyses. The bones (femur and tibia) were removed for bone mineral density (BMD) analyses, mineral contents and mechanical properties (only the femur). Ca and Mg analyses were also performed on the feces (apparent absorption), urine (mineral balance) and cecal contents. The results were evaluated using analysis of variance (ANOVA), considering a significance of 95%. Significant increases in the weight and moisture of feces and in the weight of the cecum (contents and wall) were observed. Besides, the consumption of FOS significantly stimulated the absorption and mineral balance, although such an effect was not so evident for Mg. That increase was reflected in a greater bone mineral retention, confirmed through atomic absorption spectrophotometry analyses. A positive effect on mechanical properties (maximum load and hardness) was observed in the femur of animals feeding on FOS, relatively to the control groups. On the other hand, no significant differences in BMD were observed in any of the bone regions analysed (proximal, midshaft and distal) among the experimental groups. Histological analyses demonstrated a noticeable increase in the depth and number of cecum crypts, as well as in the number of bifurcated crypts. The positive effects on intestinal absorption, mineral retention and mechanical behavior of the bones, observed in the present study, show an important role of FOS in healthy bones.

Orientadores: Pedro Eduardo de Felício, Expedito Facco Silveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-19T05:51:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Abreu_LarissaWeissheimerde_M.pdf: 3531090 bytes, checksum: 653a23f59bd2bc7c449fe6c68f12bea6 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O presente trabalho de pesquisa consistiu na avaliação dos efeitos da adição de fibra solúvel, do tipo frutooligossacarídeo de cadeia curta, sobre os atributos de qualidade, física, físico-químicas microbiológicas e sensoriais de presunto cozido cook-in. Os presuntos cozidos foram processados no frigorífico Marba, em São Bernardo do Campo ¿ São Paulo. Elaborou-se uma formulação padrão de presunto cozido (¿cook in¿) para 170% de rendimento sobre o peso da matéria prima, e a partir desta balancearam-se as formulações adicionadas de fibra solúvel, do tipo frutooligossacarídeo de cadeia curta (ScFOS) marca NutraFlora®. Realizaram-se quatro tratamentos, F0 ¿ padrão ou controle sem adição de fibra, F3 ¿ adição de 3% de fibra solúvel, F6 ¿ adição de 6% de fibra solúvel, F9 ¿ adição de 9% de fibra solúvel. Os produtos assim obtidos foram avaliados (em cinco pontos - aos 7, 20, 41, 62 e 93 dias) ao longo da estocagem refrigerada a 2±2ºC, quanto ao valor de pH, atividade de água (Aa), composição centesimal, teores de nitrito e nitrato, cor, força de cisalhamento, fatiabilidade, qualidade microbiológica e parâmetros sensoriais através de uma equipe treinada. Aos 45 dias de estocagem refrigerada, realizou-se um teste laboratorial de ordenação por preferência com consumidores, avaliando-se os atributos de cor, odor, sabor e firmeza (textura). Os resultados das determinações físicas, físico-químicas e sensoriais foram submetidos à análise de variância (ANOVA) para se avaliar o efeito dos tratamentos e tempo de estocagem, sendo a diferença entre as médias determinada pelo teste de Tukey com um intervalo de confiança de 95%. Para a avaliação sensorial de ordenação por preferência de consumidores foram utilizados os testes de Friedman e de Fisher. Os produtos apresentaram uma tendência no incremento dos valores de pH em função do tempo de estocagem. O aumento do teor de fibra solúvel adicionado resultou uma redução significativa (p<0,05) na atividade de água dos produtos. Para os parâmetros de cor avaliados, observou-se que a adição de níveis crescentes de fibra solúvel promoveu a diminuição dos valores de luminosidade (L*) e aumento no teor de vermelho (a*). Os maiores valores do teor de amarelo (b*) ao longo do período de estocagem foram observados no tratamento F0 ¿ sem adição de fibras. Os tratamentos F0 e F9 apresentaram nos primeiros 40 dias de estocagem, uma queda acentuada nos valores obtidos dos parâmetros C* (Chroma) e h (hue), enquanto os tratamentos F3 e F6 demonstraram a tendência de estabilidade ao longo da estocagem. Os resultados das avaliações microbiológicas indicaram que a adição de fibra solúvel não afetou a estabilidade microbiológica dos presuntos cozidos, uma vez que as contagens de micro-organismos deteriorantes e patogênicos mantiveram-se dentro dos limites estabelecidos pela legislação vigente ao longo do período de estocagem. A avaliação sensorial com equipe treinada evidenciou para os tratamentos contendo fibra solúvel, maior intensidade da cor rósea característica tanto na superfície das peças inteiras como nas fatias do produto. Por outro lado, para os atributos descoloração, exsudação, coesividade, sabor e odor, a equipe treinada não reportou influência da adição da fibra solúvel. A avaliação realizada com consumidores revelou preferência pelos tratamentos F3 e F6 para todos os atributos avaliados, entretanto o tratamento F9 foi o menos preferido em relação ao sabor e firmeza, evidenciando que a adição até o nível de 6% de fibra solúvel melhora a aceitação das características sensoriais avaliadas neste estudo do presunto cozido / Abstract: The present research aims the evaluation of the effects of addition of soluble fiber of short chain fructooligosaccharides (ScFOS - NutraFlora ®) over the physical, physical-chemical, microbiological and sensorial quality attributes of cook-in cooked ham. The processing of cooked hams was conducted at Marba industry, Sao Bernardo do Campo - São Paulo, Brazil. There was elaborated a standard formula of cook-in cooked ham, for 170% yield over weight of raw material, from which were balanced other formulas with soluble fiber addition:F0, F3, F6 e F9; standard (without fiber addition, 3%, 6% and 9% of fiber addition, respectively). The hams were evaluated through refrigerated storage at 2 ± 2 º C at five points (7, 20, 41, 62 and 93 days) for pH, water activity (Aw) values, centesimal composition, contents of nitrite and nitrate, colour, shear force, sliceability measurement, microbiological and sensory parameters using a trained judges. At the 45th day of storage there was processed a ranking preference test with regular consumers, assessing colour, characteristic odor, characteristic taste and firmness (texture) attributes. Physical measurements, physical-chemical and sensory results were analyzed for variance (ANOVA) to survey soluble fiber addition effects over considered parameters. The difference between means was ascertained through Tukey test at 95 % of confidence. For the ranking test there were used Friedman and Fisher tests. The hams exhibited a tendency of increasing pH values according to storage. The increasing content of soluble fiber (NutraFlora ®) added resulted in a significant reduction (p <0.05) water activity of products. For colour parameters, the rising of soluble fiber resulted in reduction of luminosity (L*) and addition of redness (a*) values. The highest yellowness (b*) values during the storage were observed at F0 treatment - without the fiber addition. The treatments F0 and F9 had at the first 40 days of storage, a sharp drop for C * (chroma) and h (hue) values while F3 and F6 treatments remained stable during that period. Microbiological evaluations pointed that the addition of soluble fiber did not affected the microbiological stability of cooked hams as the spoilage and pathogenic microorganisms counts remained within Brazilian official limits throughout the storage period. Sensory evaluation with trained judges pointed that the characteristic pink colour of whole ham and slices had higher intensity in the samples with soluble fiber addition. On the other hand, attributes of discoloration, exudation, cohesiveness, taste and odor, had no influence over the different treatments. The assessment carried out with consumers submitted comments similar to those obtained with the trained judges. The ranking preference test revealed higher preference for F3 and F6 for all the considered traits, meanwhile F9 was the least preferred regarding characteristic taste and firmness, pointed that the addition as high as 6% of soluble fiber NutraFlora ® increase the cooked ham acceptance / Mestrado / Tecnologia de Alimentos / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Francisco Maugeri Filho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-07T18:40:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hernalsteens_Saartje_D.pdf: 2071351 bytes, checksum: 1b18d6d6f4088be5bdd8d6168a5c2d5b (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Devido ao aumento da demanda por alimentos saudáveis e ao aumento da aplicação, de oligossacarídeos prebióticos, na indústria cosmética, agro-química, farmacêutica e na indústria de alimentos, a pesquisa visando a utilização de diferentes enzimas na produção dos oligossacarídeos se tornou algo necessário. O objetivo deste trabalho foi obter linhagens de leveduras, produtoras de frutooligossacarídeos a partir da sacarose. As linhagens foram isoladas de flores e frutos de diversas eco-regiões do Brasil. A partir da gama de microrganismos isolados foram selecionadas 4 cepas potencialmente aplicáveis na produção de frutooligossacarídeos: Candida sp. LEB-I3; Rhodotorula sp. LEB-U5; Cryptococcus sp. LEB-V2 e Rhodotorula sp. LEB-V10. Os quatro microrganismos estudados produzem enzimas semelhantes em relação a algumas características bioquímicas. As condições ótimas para a atividade de transferência de frutose foram pH entre 4,0 e 5,0 e temperaturas entre 65 e 70ºC, enquanto que para a atividade de frutofuranosidase o pH ótimo foi de 3,0 a 4,0 e a temperatura ótima entre 55 e 75ºC. A cinética enzimática (em relação à atividade de transferência de frutose) da enzima I3 seguiu o modelo de Michaelis-Menten, enquanto que U5 e V2 seguiram o modelo de inibição pelo substrato e a enzima V10 apresentou uma cinética de ¿cooperatividade¿. O estudo da síntese de FOS mostrou que o microrganismo Rhodotorula sp. LEB-V10 foi o único cuja enzima promoveu uma síntese constante de FOS, não apresentando nenhum indício de hidrólise dos frutooligossacarídeos, sendo devido a esta característica que tanto a produção da enzima quanto a síntese de frutooligossacarídeos foram otimizadas. Neste caso a produção de enzima foi máxima nas seguintes condições: 9% ± 1% de AMM e 7,5% ± 0,7% de açúcares redutores totais (melaço), com uma agitação de 250 rpm, a 30-35ºC, pH inicial do meio de 4,5. A produção de frutooligossacarídeos por esta enzima também foi otimizada chegando-se a 55-65% de rendimento nas seguintes condições: 50% de sacarose (P.A, comercial ou melaço), 6,5 (± 0,5) UTF.ml-1, temperatura entre 50 ºC (± 1ºC) e pH 5,0 (± 0,5). Desta forma foi alcançado o rendimento dos processos comerciais, com a vantagem de estarmos trabalhando com enzimas e não células. Além disso, a produção da enzima utilizando meios industriais, e o uso de açúcar cristal e mesmo melaço na síntese enzimática resultam em uma diminuição dos custos de produção. Desta forma há uma chance de que a continuação destes estudos resulte em um processo economicamente viável / Abstract: In response to the increasing demand for healthier foods and as a result of the expanding applications of oligosaccharides in the cosmetic, agrochemical, pharmaceutical and food industries, the search for ¿new¿ enzymes concerning the oligosaccharides production, became necessary. The present study reports on the screening for high transfructosylating enzymes in yeasts strains isolated from fruits and flowers obtained from tropical Brazilian biomass. The efforts made to screen for high extra-cellular transfructosylating enzyme producing yeasts provided very promising results. Although the enzymes from the strains Candida sp. LEB-I3, Rhodotorula sp. LEB-U5 and Cryptococcus sp. LEB-V2 showed high hydrolytic activity, the production of fructooligosaccharides (FOS) by the Rhodotorula sp. LEB-V10 enzyme was successful, showing a continuous increase in FOS concentration up to the end of the synthesis reaction. The best operational conditions for these enzymes, considering the transfructosylating activities, were determined to be in the pH range from 4.0 to 5.0 and temperatures from 65 to 70°C. While the fructofuranosidase activities had shown the optimum activity on pH values from 3.0 to 4.0 and temperatures between 55 and 75°C. The enzymatic kinetic (fructosyl transferase activity) of the Candida sp. LEB-I3 showed a Michaellis-Mentem behavior, while the Rhodotorula sp. LEB-U5 and Cryptococcus sp. LEB-V2 showed a substrate inhibitory kinetic and the Rhodotorula sp. LEB-V10 showed a sigmoid shape, similar to that of allosteric enzymes. Considering that the Rhodotorula sp. LEB-V10 process was the only one that may be regarded as economically possible, the response surface methodology was employed to study the fermentation and the synthesis condition aiming the process optimization. On basis of the experimental results, the optimum conditions to obtain high fructosyl transferase activity were: 250 rpm, 30-35°C, 9% ± 1% (w/v) corn steep liquor and 7.5% ± 0.7% (w/v) of total reducing sugar from sugar cane molasses. The synthesis of FOS was also optimized (55 to 65% of yield), being the optimum conditions: 50% sucrose (P.A., commercial or from sugar cane molasses), 50°C (± 1°C), pH 5.0 (± 0.5) and 6.5 FTA.ml-1 (± 0.5). This data is very similar to those from the commercial process, and the use of commercial sucrose and sugar cane molasses led to a reduction on the production cost, consequently, further studies on the enzyme and fructooligosaccharides production conditions may show its potential for commercial application / Doutorado / Doutor em Engenharia de Alimentos

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