Introduction: Hemostasis is a complex system in the body that maintains blood flow and prevents bleeding. Patients with platelet disorders are at the risk of mucocutaneous bleedings and at Clinical chemistry in Linköping platelet function is measured with flow cytometry. The platelet response to various agonists is measured with fluorescently labeled platelet antibodies. The aim of this study was to evaluate the stability of the frozen reagents used for platelet function testing. Further the durability of platelet antibodies after freezing and freeze-drying was tested.   Method: Platelet antibodies were prepared for freezing/freeze-drying in buffer and were analyzed at three different occasions using blood from 2 to 3 individuals with flow cytometry. Agonists and blood were added on the day of analysis. The reagent stability test was evaluated statistically using one-way ANOVA with Bonferronis post-hoc test. Results: The slight drop in percent positive platelets and median fluorescence intensity (MFI) seen over time in the reagent stability test was not statistically significant (p>0,05). All platelet antibodies could be used after freezing/freeze-drying. The results are showing a declining trend, especially for MFI values. Conclusion: The frozen reagents used for platelet function testing is stabile up to 36 months. The results from the freeze-drying/freezing indicate that all platelet antibodies keep some activity but that some are more sensitive than others. Some antibodies could not be evaluated due to concentration of agonist in the sample being too low to induce activation. Due to individual variations further studies with more participants and more agonists in their optimal concentrations are needed. / Bakgrund: Hemostas är ett komplext system i kroppen som upprätthåller blodflödet och förhindrar blödning. Mukokutana blödningar kan uppstå hos patienter som har problem i den primära hemostasen vilket kan bero på trombocydefekter. På Klinisk kemi i Linköping mäts trombocytfunktion med flödescytometri. Trombocyterna aktiveras med olika agonister och svaret på stimuli mäts genom detektion av fluoroforkonjugerade antikroppar. Syftet med denna studie var att utvärdera långtidsstabiliteten av de frysta reagens som används för trombocytfunktionsutredningen, att testa om nya trombocytantikroppar klarar att frysas och att utvärdera reagensens hållbarhet för frystorkning. Metod: Antikroppar frystorkades/frystes i buffert och analyserades vid tre tillfällen med blod från 2 till 3 personer med flödescytometri. Agonist och blod tillsattes på analysdagen. Långtidsstabilitetstestet utvärderades statistiskt med  one-way ANOVA med Bonferronis post-hoc test. Resultat: En svag nedgång över tid i procent positiva trombocyter och MFI i långtidsstabilitetstestet var inte statistiskt signifikant (p>0,05). Alla antikroppar gav signal efter frysning och frystorkning. Främst för MFI syns en nedåtgående trend över tid. Slutsats: Reagenset för trombocytfunktionsutredningen är stabilt upp till 36 månader. Resultat från frystorkningen tyder på att alla antikroppar klarar att frystorkas/frysas men vissa är känsligare än andra. Vissa antikroppar kunde inte utvärderas p.g.a. för låg agonistkoncentration för att inducera aktivering. Ytterligare försök måste göras med fler individer och fler agonister i optimal koncentration p.g.a. individuella skillnader i svar för agonister. Frystorkningsprocessen kan optimeras.

Vattenhalten i ett frystorkat proteinläkemedel bestämdes med KF och LOD som är två primära och traditionella metoder som används för bestämning av vattenhalten i produkter inom flera industrier. Istället för KF och LOD, som är tidskrävande och destruktiva, kan den sekundära, snabba och icke-destruktiva metoden NIR användas. För att kunna implementera NIR måste en kalibrering gentemot en primär metod ske. Syftet med detta projekt var att med en kvantitativ analys finna ett samband mellan NIR och KF samt mellan NIR och LOD för den frystorkade produkten. Det initiala steget var att upprätta en kalibreringsuppsättning och samla in spektrum med NIR. Därefter gjordes försök att bestämma vattenhalten med KF och LOD för den frystorkade proteinprodukten med inledande tester som verifierades genom att spetsa prover med vatten. LOD utfördes i en exsickator och KF-analyserna utfördes kolometriskt på två olika sätt, med och utan extraktion av proverna med metanol. Det slutgiltiga steget var att korrelera insamlat spektrum från NIR med bestämda referensvärden genom att skapa en kalibreringsmodell. Data från insamlat spektrum förbehandlades med multiple scatter correction (MSC), andra derivatan och Savitzy Golay, innan en kalibreringsmodell skapades med partial least square (PLS). Resultatet från LOD-analyserna med exsickator tydde på att tillvägagångssättet som användes inte var lämpligt för produkten och en kalibreringsmodell upprättades inte. Vattenhalten bestämdes med KF med extraktion av åtta prover till 0,144 – 0,558 % [w/w], och med KF utan extraktion till 2,34– 2,972 % [w/w] för åtta prover. Det förväntade värdet var 0,62-1,61 % [w/w]. En kalibreringsmodell upprättades för KF med och utan extraktion samt för det förväntade referensintervallet. Detta resulterade i en korrelationsfaktor på 0,9496 för KF med extraktion, 0,97418 för KF utan extraktion och 0,9932 för de förväntade värdena. Metoderna KF med och utan extraktion var inte lämpliga för produkten i detta projekt, utan fler försök behöver utföras med större kalibreringsuppsättningar för att kunna dra en slutgiltig slutsats. / The water content of a lyophilized protein drug is determined using KF and LOD which are two primary and traditional methods used by several industries for determination of water content in products. Instead of KF and LOD, which are time consuming and destructive, the secondary, fast and non-destructive method near infrared spectroscopy (NIR), can be used. To implement NIR, a calibration towards a primary method must be performed. The purpose of this study was to find a relation between NIR and KF and between NIR and LOD for the lyophilized product with a quantitative analysis. The initial step was to establish a calibration set and collect a spectrum with NIR. Attempts to determine the water content of KF and LOD for the lyophilized protein product were made with initial tests which later were verified by spiking samples with water. LOD was performed in a desiccator and the KF analyses were performed calorimetrically in two different ways: with and without extraction of the samples with methanol. The last step was to correlate the collected spectrum from NIR with determined reference values by creating a calibration model with partial least square (PLS). Prior to model development, data from collected spectrum was pre-treated with multiple scatter correction (MSC), second derivative and Savitzy-Golay filter. The result of the LOD analyses with a desiccator indicated that the method used was not suitable for the product and a calibration model was not established. The water content was determined by KF with extraction of eight samples to 0.144 - 0.558 % [w/w], and with KF without extraction of eight samples to 2.34-2.972 [w/w]. The expected value was 0.62-1.61 % [w/w]. A calibration model was established for KF with extraction of the samples, KF without extraction of the samples and for the expected reference interval. The developed calibration models resulted in a correlation factor of 0.9496 for KF with extraction, 0.97418 for KF without extraction and 0.9932 for the expected values. KF with and without extraction of the samples was not suitable for the product in this project. More experiments are needed with bigger calibration sets to be able to make a conclusion.

I denna metodstudie jämfördes Thermo Fishers bevarande lösningar RNAlater och RNAlater-ICE med frystorkning som bevaring av skelettmuskulatur från människa. Studien gjordes med syftet att avgöra om RNAlater och/eller RNAlater-ICE kan ersätta frystorkning, i hopp om att underlätta dissekering av muskelvävnad. De molekylärbiologiska analyser som utfördes var proteinbestämning; Western Blot inriktad på proteinerna mTor, S6, S6K1, eEF2, myosin typ II och aktin; samt mätning av glykogen och citratsyntasaktivitet. Därtill påbörjades även en aminosyraanalys. Studien utfördes hos William Apró på Åstrandlaboratoriet på Gymnastik- och idrottshögskolan i Stockholm. Resultaten visade att både RNAlater och RNAlater-ICE är olämpliga att använda i studier som innefattar samtliga av de genomförda analyserna. Detta då analysresultaten från de alternativa bevaringsmetoderna och de från frystorkningen inte var likvärdiga. Därmed drogs slutsatsen att varken RNAlater eller RNAlater-ICE kan ersätta frystorkning som bevaringsmetod i Aprós vidare studier. / In this method study Thermo Fisher’s preserving solutions RNAlater and RNAlater-ICE were compared to lyophilization for preservation of human skeletal muscle. The study was conducted with the aim of determining whether RNAlater and / or RNAlater-ICE can replace lyophilization, in the hope of facilitating dissection of muscle tissue. The molecular biological analyzes performed were protein assay; Western Blot focused on the proteins mTor, S6, S6K1, eEF2, myosin type II and actin; alongside of measurments on glycogen and citrate synthase activity. In addition, an amino acid analysis was initiated. The study was executed with William Apró at the Åstrand Laboratory at The Swedish School of Sport and Health Science in Stockholm. The results showed that both RNAlater and RNAlater-ICE are unsuitable for use in studies that include all of the analyzes performed. This is because the analysis results from the alternative preservation methods and those from lyophilization were not equivalent. Thus, it was concluded that neither RNAlater nor RNAlater-ICE can replace lyophilization as a preservation method in Apró’s further studies.