Ett vanligt återkommande problem inom pappersindustrin är fläckar på den färdiga produkten. BillerudKorsnäs Gävle har genom undersökningar kommit fram till att en del fläckar som just nu uppkommer till stor del består av Alkyl keten dimer, AKD. AKD är ett lim som tillsätts i mälden för att öka hydrofobiciteten hos pappret eller kartongen. AKD partikeln skyddas av ett hölje bestående av katjonisk polymer för att partikeln lättare ska fästa på träfibrerna i processen. Om detta hölje blir instabilt ökar risken för bildning av agglomerat och en sämre retention på pappersmaskinen vilket i sin tur kan orsaka fläckar på den färdiga kartongen. Detta arbete för att undersöka stabiliteten hos AKD har därför gjorts.   För att undersöka stabiliteten hos AKD har olika processparametrars inverkan på AKD partikelns stabilitet undersökts. Tester gjordes på två olika AKD och de processparametrar som testats i detta arbete är temperatur, pH och salthalt. Även prover från processen har tagits ut för att undersöka om rena AKD prover kan relateras till processen. Proverna undersöktes i en flödescytometer för att detektera graden av hydrofobicitet hos partiklarna i proverna.   Resultaten visade att det testade temperaturspannet inte påverkade stabiliteten hos AKD partikeln nämnvärt. Försöken där pH förändrades kunde påvisa påverkan hos stabiliteten. Detta innebär att AKD i processen påverkas, och att uppkomsten av fläckar i kartongen delvis kan bero på instabiliteten hos AKD partikeln vid förändring av pH i processen. Stabiliteten hos ett utspätt prov påverkades inte nämnvärt under ett tidsintervall på 60 dagar. / A recurring problem in the paper industry is spots on the finished product. Through previous studies, Billerudkorsnäs Gävle has detected one of the sources of these stains to be Alkyl keten dimer (AKD). AKD is a glue that is added to the ground pulp to increase the hydrophobicity of the paper or cardboard. The AKD particle is protected by a cationic polymer to make it easier for the particle to attach to the fibers in the process. If the polymer becomes instable, the risk of the AKD particles forming agglomerate increases and the retention in the paper machine decrease, which can lead to stains on the finished cardboard. This work with the aim of investigation of the stability of AKD has therefore been done.   To investigate the stability of AKD, the impact of different process parameters on the AKD particle has been studied. Test has been done with two different AKD, and the process parameters tested in this work were temperature, pH and salinity. Samples from the process has also been studied to investigate if the pure AKD samples could be related to the process. All the samples were analyzed in a flow cytometry to detect the degree of hydrophobicity of the particles in the samples.   The result showed that the tested temperature range did not affect the stability of the AKD particles. The experiments where the pH were changed showed that the stability of the particles were affected. This means that AKD in the process is affected, and that the appearance of stains in the carton may partly be due to the instability of the AKD particle in changing the pH of the process. The stability of a diluted sample was not significantly affected over a 60 day time interval.

Flow cytometric methods are used to count leukocytes in quality control (QC) of blood components using the LeucoCount method. This involves using fluorescent dyes that bind to DNA/ RNA in combination with TruCount tubes. Flow cytometric can also be used to analyze lymphocyte subpopulations using the BD MultitestTM 6-color TBNK reagent and TruCount tubes. The study aimed to evaluate the stability of leukocyte counting QC samples and blood samples for lymphocyte subpopulation analysis within 48 hours of collection. In this study 10 erythrocytes concentrates, 10 thrombocytes concentrate, 10 blood doner samples and 14 patient samples was collected. The results showed that both the QC samples and patient samples can be stored for up to 48 hours without significant changes. Some variation was observed between the analysis conducted at 4, 24 and 48 hours, possibly due to instrument variation and manual gatening. However, statistical tests indicated no significant differences aiming the time points. Therefore, samples can be reliably analyzed within 48 hours from the time of collection.

Introduction: Hemostasis is a complex system in the body that maintains blood flow and prevents bleeding. Patients with platelet disorders are at the risk of mucocutaneous bleedings and at Clinical chemistry in Linköping platelet function is measured with flow cytometry. The platelet response to various agonists is measured with fluorescently labeled platelet antibodies. The aim of this study was to evaluate the stability of the frozen reagents used for platelet function testing. Further the durability of platelet antibodies after freezing and freeze-drying was tested.   Method: Platelet antibodies were prepared for freezing/freeze-drying in buffer and were analyzed at three different occasions using blood from 2 to 3 individuals with flow cytometry. Agonists and blood were added on the day of analysis. The reagent stability test was evaluated statistically using one-way ANOVA with Bonferronis post-hoc test. Results: The slight drop in percent positive platelets and median fluorescence intensity (MFI) seen over time in the reagent stability test was not statistically significant (p>0,05). All platelet antibodies could be used after freezing/freeze-drying. The results are showing a declining trend, especially for MFI values. Conclusion: The frozen reagents used for platelet function testing is stabile up to 36 months. The results from the freeze-drying/freezing indicate that all platelet antibodies keep some activity but that some are more sensitive than others. Some antibodies could not be evaluated due to concentration of agonist in the sample being too low to induce activation. Due to individual variations further studies with more participants and more agonists in their optimal concentrations are needed. / Bakgrund: Hemostas är ett komplext system i kroppen som upprätthåller blodflödet och förhindrar blödning. Mukokutana blödningar kan uppstå hos patienter som har problem i den primära hemostasen vilket kan bero på trombocydefekter. På Klinisk kemi i Linköping mäts trombocytfunktion med flödescytometri. Trombocyterna aktiveras med olika agonister och svaret på stimuli mäts genom detektion av fluoroforkonjugerade antikroppar. Syftet med denna studie var att utvärdera långtidsstabiliteten av de frysta reagens som används för trombocytfunktionsutredningen, att testa om nya trombocytantikroppar klarar att frysas och att utvärdera reagensens hållbarhet för frystorkning. Metod: Antikroppar frystorkades/frystes i buffert och analyserades vid tre tillfällen med blod från 2 till 3 personer med flödescytometri. Agonist och blod tillsattes på analysdagen. Långtidsstabilitetstestet utvärderades statistiskt med  one-way ANOVA med Bonferronis post-hoc test. Resultat: En svag nedgång över tid i procent positiva trombocyter och MFI i långtidsstabilitetstestet var inte statistiskt signifikant (p>0,05). Alla antikroppar gav signal efter frysning och frystorkning. Främst för MFI syns en nedåtgående trend över tid. Slutsats: Reagenset för trombocytfunktionsutredningen är stabilt upp till 36 månader. Resultat från frystorkningen tyder på att alla antikroppar klarar att frystorkas/frysas men vissa är känsligare än andra. Vissa antikroppar kunde inte utvärderas p.g.a. för låg agonistkoncentration för att inducera aktivering. Ytterligare försök måste göras med fler individer och fler agonister i optimal koncentration p.g.a. individuella skillnader i svar för agonister. Frystorkningsprocessen kan optimeras.

No description available.

Under vissa omständigheter kan bakterier kan ta sig in i blodbanan där de kan orsaka allvarliga infektioner (bakteriemi). Metoden som används för identifiering och resistensbestämning av bakterier i blododlingar kräver minst 16 timmars inkubation. Fram tills en resistensbestämning utförts kan empirisk antibiotikabehandling användas, men med ökande resistensutbredning blir det alltmer osäkert om denna behandling är verksam. Nyligen har en lappdiffusionsmetod för resistensbestämning direkt från blododling validerats, som kan läsas av efter 4, 6 och/eller 8 timmars inkubation. Det finns även publicerade arbeten där flödescytometriassisterad resistensbestämning används, men då krävs att bakterierna finns i tillräckligt hög koncentration, befinner sig i tillväxtfas och finns som renkultur. Syftet med examensarbetet var att optimera hantering av blododlingsflaskor så att bakterier från blododlingsflaskorna kunde isoleras med tillräcklig kvalitet och koncentration för att kunna utföra resistensbestämning med flödescytometri. Upprening av bakterierna utfördes med olika tvättbuffertar och sedan utfördes resistensbestämning med flödescytometri och  referensmetoden buljongspädning. Resultaten från uppreningen visade att sterilt vatten och Tween20 gynnade bakteriernas återhämtningsförmåga mest. Resistensbestämning utfördes med Klebsiella pneumoniae ATCC700603,  K. pneumoniae CCUG56233 och K. pneumoniae ATCC13882, som tvättats med sterilt vatten och Tween20. För CCUG56233 skiljde 1 spädningssteg i koncentrationsskalan mellan metoderna. ATCC-isolaten erhöll likartade MIC-värden (minimum inhibitory concentration) vid alla analyser men där fanns en skillnad på 2 spädningssteg mellan buljongspädning och analys med flödescytometri. Detta kan förklaras av skillnaden i inkubationstid mellan metoderna. Slutsatsen som kan dras är därför att resultaten från de två metoderna vid resistensbestämning är likartade och att sterilt vatten är mest lämpligt att använda vid upprening av bakterier. Fler undersökningar bör dock utföras.

Mjölksyrabakterier är mikroorganismer som bildar mjölksyra när de bryter ned socker. Dessa bakterier förekommer naturligt i människans kropp och tillhör tarmens normalflora. De hjälper dessutom till med att skydda människan från patogena mikroorganismer. Maten som intas idag innehåller mycket lite av mjölksyrabakterier och bör därför berikas på annat sätt. BioGaia som är ett svenskt bioteknikföretag, har forskat på mjölksyrabakterien Limosilactobacillus reuteri och substansen reuterin. BioGaias produkter innehåller mjölksyrabakterien Limosilactobacillus reuteri som bidrar till en balanserad tarmflora. Stabilitetsstudier är en viktig aspekt när en ny produkt utvecklas där produktens hållbarhet behöver undersökas under olika förhållanden. Haltbestämningen som är en del av stabilitetsstudien, görs idag på bakterier i de olika produkterna på BioGaia med plattmetoden, d.v.s. bakterieodlingar. Processen för plattmetoden tar cirka tre dagar tills att ett resultat kan fås. Syftet med studien var att jämföra plattmetoden med flödescytometri på probiotiska prover, för att se om resultatet av haltbestämningen av antalet levande bakterier blir samma med de olika metoderna och om det är möjligt att ersätta plattmetoden med flödescytometri för probiotiska prover. Studien har visat att skillnaden mellan resultatet från plattmetoden och flödescytometrin på probiotiska prover, är större än förväntat. Storleken på skillnaden varierar mellan prover. Resultatet har dock inte ett tydligt mönster som gör det möjligt att avgöra ifall det är möjligt att ersätta plattmetoden med flödescytometri.

Flödescytometrisk analys av DNA-ploiditeten används vid diagnostisering av endometriecancer. DNA-ploidi reflekterar cellcykeln och avgör om tumörens cellpopulationen är diploid eller aneuploid, där aneuploiditet förknippas med sämre prognos. Vid analys av paraffininbäddat vävnadsmaterial används avparaffineringsmedlet xylen, vars toxiska egenskaper försämrar arbetsmiljön på laboratoriet. Den har en stark och obehaglig lukt som kan orsaka illamående och yrsel. Syftet med studien var att undersöka om xylen kan ersättas med xylensubstitutet Tissue Clear, ett isoparaffinskt kolväte som är mindre toxiskt. Studien omfattade paraffininbäddad humanvävnad från endometrioid carcinom (n=20), både diploid (n=15) och aneuploid (n=5) vävnad, som avparaffinerades med xylen respektive Tissue Clear innan DNA-ploidi utfördes. Eventuella skillnader inom de flödescytometriska parametrarna % CV-diploid, % S-fas, % debris och DI-aneuploid undersöktes och vid statistisk analys kunde ingen signifikant skillnad ses på samtliga parametrar. Eftersom analysen utförs sällan i rutin är antalet prover i studien relativt stor, trots att detta kan anses vara en liten kvantitet. Av dessa var endast 25 % av proverna aneuploida. Att en patient uppvisar aneuploiditet är ovanligt och därför ansågs även denna mängd som tillräckligt stor. Studien visar att avparaffinering med Tissue Clear är ekvivalent med xylen och därmed kan Tissue Clear ersätta xylen oavsett om vävnaden är diploid eller aneuploid. / DNA ploidy is used for endometrial cancer diagnosis. It reflects the cell cycle and determines whether the cell population in tumors is diploid or aneuploid. When analyzing paraffin embedded tissues xylene can be used for deparaffinization, whose toxicity impairs the laboratory´s work environment. Its strong and unpleasant smell can cause nausea and dizziness. The aim of this study was to investigate if xylene can be replaced with Tissue Clear, an isoparaffinic hydrocarbon that is less toxic. The study included paraffin embedded human tissues from endometrioid carcinoma (n=20), both diploid (n=15) and aneuploid (n=5), deparaffinized with xylene or Tissue Clear before DNA ploidy was performed. Potential differences between the parameters % CV-diploid, % S-phase, % debris and DI-aneuploid were statistically examined and showed no significant differences. The sample amount in this study might be considered low, though it is relatively high since the analysis is rarely performed routinely. Among these only 25 % were aneuploid. Patients showing aneuploidy is rare and the amount was therefore considered to be sufficient as well. The study shows that deparaffinization with Tissue Clear generates equivalent results as for xylene and can thereby replace xylene regardless if the tissue is diploid or aneuploid.

Prostate cancer is one of the most common cancer types worldwide. However, current diagnostic approaches and treatments are invasive and unspecific. Prostate-specific membrane antigen (PSMA) is an ideal biomarker for prostate cancer and can act as a target for therapeutic or diagnostic agents. Previous attempts to develop an affibody with affinity towards PSMA have been unsuccessful, therefore this thesis aimed at making the affibody selections against PSMA more efficient. In this thesis HEK293 cells expressing a modified version of PSMA containing a 3C protease cleavage site were generated, to enable extraction of the extracellular domain of PSMA during the selections. However, further analyses must be performed to determine if the extracellular domain can be successfully cleaved off. To develop an affibody that can be used both in vitro and in vivo, selections will be carried out against recombinant PSMA as well. The recombinant PSMA was previously produced incorporating an Avi tag for site-specific biotinylation and immobilization for the selections. To biotinylate the recombinant PSMA, the enzyme BirA that catalyzes the biotinylation of the Avi tag, was produced. A protein yield of 8.95 mg/liter culture was obtained and the site-specific biotinylation was highly efficient. To evaluate the proposed affibody selection strategy the next step is to determine if cleavage of the PSMA expressed on the HEK293 cells is possible, optimize the cleavage conditions and to start initial selections using the generated HEK293 cells and the produced BirA enzyme. / Prostatacancer är en av de mest förekommande cancertyperna över hela världen. Nuvarande diagnostiska metoder och terapeutiska behandlingar är dock invasiva och ospecifika. Prostataspecifikt membranantigen (PSMA) är en idealisk biomarkör för prostatacancer och kan agera som en målmolekyl för terapeutiska eller diagnostiska ändamål. Tidigare försök att utveckla en affibody med affinitet mot PSMA har inte lyckats, därför var målet med detta examensarbete att effektivisera selekteringen av affibodies mot PSMA. I detta projekt har HEK293 celler som uttrycker en modifierad version av PSMA, innehållande ett 3C-proteas- klyvningsställe, genererats för att möjliggöra extraktion av den extracellulära domänen av PSMA under selekteringen. Ytterligare analyser måste dock utföras för att avgöra om den extracellulära domänen kan klyvas av. För att utveckla en affibody som kan användas både in vitro och in vivo kommer selekteringen att utföras även mot rekombinant PSMA. Rekombinant PSMA har producerats tidigare med en Avi tag för specifik biotinylering och immobilisering under selekteringen. För att biotinylera det rekombinanta PSMA producerades enzymet BirA, som katalyserar biotinyleringen av en Avi tag. Ett proteinutbyte av 8,95 mg/liter kultur erhölls och den specifika biotinyleringen var effektiv. För att utvärdera den föreslagna strategin för selektering av affibodies är nästa steg att avgöra om klyvning av PSMA uttryckt av HEK293 cellerna är möjlig, optimera klyvningsförhållandena och starta initiala selektioner med de genererade HEK293-cellerna och det producerade BirA-enzymet.

Hematopoietic stem cells (HSCs) have historically been difficult to maintain ex vivo with many attempts to culture them in vitro by mimicking their natural biological environment. Providing a hypoxic environment is one way to achieve this goal and can be performed by using hypoxia stimulating compounds that inhibits the degradation of HIF1a which plays an important role in regulating hypoxia. For each sample 50 murine HSCs were isolated with fluorescence-activated cell sorting (FACS) and cultured with different concentrations of the hypoxia inducible compound Adaptaquin for 13 days followed by analysing with flow cytometry. The results showed an increase in proliferation of treated cells with the highest average total viable cell count for cells treated with 100 nM Adaptaquin of 4,70 ± 1,12 x 105 cells compared to the control which had 2,39 ± 0,76 x 105 cells. The HSC frequency was highest in the control samples with an average of 1,91 ± 0,42 % compared to the 5 mM treated samples with the highest average HSC frequency which was 1,52 ± 0,82 %. The biggest noticeable difference between the control and treated samples was seen when observing the total cell count. The difference in proliferation was on the other hand too small to see significant difference between the samples. The conclusion is that Adaptaquin did not have any significant impact on keeping the cells undifferentiated but could have a potential to be used as a compliment to other factors to maintain HSCs in vitro and to mimic its hypoxic biological environment. / Hematopoetiska stamceller (HSCs) har historiskt sett varit svåra att odla ex vivo och många försök har genomförts in vitro genom att efterlikna deras naturliga biologiska miljö. Att tillhandahålla en hypoxisk miljö är en metod för att uppnå detta och kan göras med användning hypoxi-stimulerande substanser som hämmar nedbrytningen av HIF1a som spelar en viktig roll i regleringen av hypoxi. För varje prov isolerades 50 murina HSCs med fluorescence-activated cell sorting (FACS) och odlades med olika koncentrationer av det hypoxi-inducerande ämnet Adaptaquin under 13 dagar följt av analys med flödescytometri. Resultaten visade en ökning i avseende på proliferationen hos behandlade celler där det högsta genomsnittliga totala antalet levande celler behandlade med 100 nM Adaptaquin som var 4,70 ± 1,12 x 105 celler jämfört med kontrollen som hade 2,39 ± 0,76 x 105 celler. HSC-frekvensen var högst i kontrollproverna med ett genomsnitt på 1,91 ± 0,42 % jämfört med proverna behandlade med 5 mM Adaptaquin som hade den högsta genomsnittliga HSC-frekvensen som låg på 1,52 ± 0,82 %. Den största synliga skillnaden mellan kontroll- och behandlingsprover var synlig när det observerade totala antalet celler jämfördes mellan behandlade prover som i genomsnitt hade fler totala celler. Skillnaden i proliferation var å andra sidan för liten för att se en signifikant skillnad mellan proverna. Slutsatsen är att Adaptaquin inte hade någon signifikant påverkan på att hålla HSCs odifferentierade men kan ha potential att användas som ett komplement till andra faktorer för att odla HSCs in vitro och efterlikna dess hypoxiska biologiska miljö.

Hepatit-B är en leversjukdom som orsakas av hepatit-B-virus (HBV) vilket är en kapslad DNA-virus. Kapsidprotein (Cp) har stor betydelse i virusets livscykel exempelvis DNA-replikation, interaktion med värdceller och andra virala glykoproteiner. HBV, som många andra virus, tar sig in i cellen genom att binda till cellreceptorer. Transferrinreceptor är en välkänd receptor som mögliggör virus inträde i cellen genom att binda till virusproteiner, intraktionen sker i apikala domänen i TfR. Båda Cp149, kapsidsammansättnings domänen i Cp, och apikala domänen i TfR är betydelsefulla ändamål för utveckling av antivirala läkemedel. Syftet med arbetet var att klona och uttrycka olika varianter av ett nytt modifierat Cp149, där Cp149 har modifierats med AP01 (lösliga formen av apikala dömanen),  och analysera intraktioner mellan proteinerna och viralt glykoprotein, MGP1. Modifierade proteingener klonades i plasmid (pET-11a) med hjälp av rekombinant DNA-teknik och användning av restriktionsenzymer NdeI och BamHI. Agarosgelelektrofores och DNA-sekvensering användes för att  kontrollera förekomst av eftersökta DNA-sekvenser. Nya plasmider fördes över till bakterieceller, Escherichia coli, och  proteinutrycket inducerades i bakteriecellerna genom kemiskbehandling. Framrenade proteiner från respektive provlösning analyserades med Sodium dodecyl sulphate polyakrylamid gel electrophoresis (SDS-PAGE) och proteinernas funktion undersöktes med flödescytometri genom att besämma bindningsförmågan till MGP1, som uttrycktes på jästceller, i närvaro av TfR. Rekombinant plasmid innehållande proteingen kodande Cp149 för varianter A-D samt F lyckades att framställas. Resultatet från SDS-PAGE påvisade inga tydlyga protein-band och flödescytometri resultatet var svårt att bedömma, troligen då ytterliggare proteinupprening behövdes för att isolera kapsidproteinerna. Syftet med arbetet har erhållits delvis och fortsatt undersökningar på nya proteiner förslås. / Hepatitis B is one av the major worldwide health problems that is caused by enveloped DNA virus, Hepatitis B virus (HBV). HBV’s capsid protein (Cp) has an important role in the virus life cycle, för example DNA replication, intraction with host cells, and other viral glycoproteins. HBV, like many other viruses, enters the cells by binding to cell receptors. Transferrin receptor (TfR) is a well-known receptor that enables virus entry into the cell by binding to viral proteins. The interaction takes place in the apical domain of TfR. Both Cp149, the capsid’s composition domain of Cp, and the soluble form of the apical domain, AP01, from TfR are important builing parts to be explored as starting building blocks for the development of antiviral therapeutics. Modification of Cp149 with AP01 is an interesting combination to produce new protein-based drugs to prevent viral infections. The aim of this project was to clone and express six different variants of a AP01 modified Cp149 protein as a starting points to analyze interactions between the proteins and Machupo virus glykoprotein 1 (MGP1). All target DNA templates and plasmids (pET-11a) were digested with restriction enzymes, NdeI and BamHI, and ligated by T4 DNA ligase. Agarose gel electrophoresis and DNA sequencing were used as validation methods to confirm the presence of desired and corrected DNA sequences, respectively, during gene cloning. DNA transformation and induction of Escherichia coli cells was used to express the desired proteins. The purified proteins were validated for their binding ability to MGP1, expressed on yeast cells by flow cytometry in a competition assay with TfR. Recombinant plasmid including the expected DNA sequence encoding Cp149 for variants A-D and F was successfully produced. There was no clear detection of protein bands on Sodium dodecyl sulphate polyakrylamid gel electrophoresis (SDS-PAGE) gel and flow cytometry results were difficult to interpret due to insufficient protein purification during ammonium sulphate percipitation. The purpose of the project has been obtained partially and more studies have to be carried out to produce pure proteins that can be used for further analysis.