Neste trabalho realizamos a análise das variações na expressão gênica global do fungo aquático Blastocladiella emersonii submetido ao estresse de carência de oxigênio (hipóxia), utilizando a técnica de microarranjos de cDNA em lâminas contendo 3773 genes distintos. Nos experimentos de hipóxia gradual (diminuição gradual da concentração de oxigênio dissolvido, seguido de reoxigenação) e hipóxia direta (diminuição direta da concentração de oxigênio dissolvido, seguido de reoxigenação) observamos que 650 genes foram diferencialmente expressos em pelo menos uma das condições de estresse e que 534 deles mostraram-se afetados (direta ou indiretamente) pela disponibilidade de oxigênio, uma vez que apresentaram recuperação (ou tendência à recuperação) da sua expressão aos níveis normais, quando as células foram reoxigenadas. Além de modular a expressão de diversos genes sem função conhecida, B. emersonii responde à hipóxia reajustando a expressão de genes responsáveis pela produção e consumo de energia. Pelo menos transcricionalmente, este fungo favorece o metabolismo anaeróbico, através da indução de genes que codificam enzimas da via glicolítica e lactato desidrogenase, ao passo que no ciclo do ácido cítrico, a maioria dos genes encontram-se reprimidos ou não sofrem alteração na expressão. Processos dispendiosos em energia como síntese protéica, metabolismo de aminoácidos, enovelamento de proteínas e transporte por membrana apresentaram perfis predominantemente de repressão gênica quando em carência de oxigênio. Ainda utilizando a técnica de microarranjos, mostramos semelhanças entre os perfis transcricionais nos experimentos hipóxia e de carência de Fe2+ (tratamento com quelante de Fe2+ 2,2´-dipyridyl) sugerem que estes estresses estão de alguma forma relacionados, fornecendo bons indícios de que o íon Fe2+ possa ter um papel importante no mecanismo sensor de oxigênio e/ou de resposta a hipóxia em B. emersonii. Além disso, o tratamento prévio de células submetidas à hipóxia com o antibiótico geldanamicina, um conhecido inibidor da proteína de choque térmico HSP90, levou à diminuição da indução de certos genes de hipóxia, indicando que este fungo pode possuir algum mecanismo semelhante ao do fator de transcrição de hipóxia HIF1-α de mamíferos, uma vez que este fator também é afetado por geldanamicina. Adicionalmente, desenvolvemos um protocolo para transformação de B. emersonii mediada por Agrobacterium tumefasciens que se mostrou promissor. A transferência do T-DNA contendo um gene de resistência a higromicina B, presente no vetor binário pBINPLUS-Hph, foi evidenciada pelo crescimento normal e esporulação das células transformadas, na presença do antibiótico e pela amplificação do gene de resistência no DNA genômico de células transformadas. / In this work we analyzed global gene expression changes in the aquatic fungus Blastocladiella emersonii submitted to oxygen deprivation (hypoxia), using cDNA microarrays containing 3,773 distinct genes. In gradual hypoxia (gradual decrease in dissolved oxygen concentration, followed by reoxygenation) and direct hypoxia (direct decrease of dissolved oxygen concentration, followed by reoxygenation) we observed 650 differentially expressed genes in at least one of the stress conditions tested, 534 of them being affected (directly or indirectly) by oxygen availability, since they showed recovery of normal expression levels or a tendency to recover, when cells were reoxygenated. Besides modulating many genes with no previously assigned function, B. emersonii responds to hypoxia by readjusting the expression levels of genes responsible for energy production and consumption. At least transcriptionally, this fungus seems to favour anaerobic metabolism through the induction of genes encoding glycolytic enzymes and lactate dehydrogenase, while in the TCA-cycle, most genes were repressed or unchanged. Energy-costly processes like protein synthesis, amino acid metabolism, protein folding and transport had their gene expression profiles predominantly repressed during oxygen deprivation. Microarray experiments also showed similarities between the transcriptional profile of genes in hypoxia and iron (II) deprivation (treatment with the iron (II) chelator 2,2\'-dipyridyl), suggesting that these stresses are somehow related, giving good evidence that Fe2+ ion could have a role in the mechanism of oxygen sensing and/or response to hypoxia in B. emersonii. Furthermore, pretreatment of cells subjected to hypoxia with the antibiotic geldanamycin, a known inhibitor of the heat shock protein HSP90, caused a significant decrease in the induction of certain hypoxic genes, indicating that this fungus could have a mechanism similar to that of the mammalian hypoxia transcription factor HIF-1α, which is also affected by geldanamycin. Additionally, we developed an Agrobacterium tumefasciens-mediated protocol for transformation of B. emersonii that has shown to be promising. The capacity to transfer the T-DNA containing a hygromycin B resistance gene, present in the pBINPLUSHph binary vector, was evidenced by the normal growth and sporulation of the transformed cells in the presence of antibiotic and by amplification of the resistance gene from the genomic DNA of transformed cells

Neste trabalho realizamos a análise das variações na expressão gênica global do fungo aquático Blastocladiella emersonii submetido ao estresse de carência de oxigênio (hipóxia), utilizando a técnica de microarranjos de cDNA em lâminas contendo 3773 genes distintos. Nos experimentos de hipóxia gradual (diminuição gradual da concentração de oxigênio dissolvido, seguido de reoxigenação) e hipóxia direta (diminuição direta da concentração de oxigênio dissolvido, seguido de reoxigenação) observamos que 650 genes foram diferencialmente expressos em pelo menos uma das condições de estresse e que 534 deles mostraram-se afetados (direta ou indiretamente) pela disponibilidade de oxigênio, uma vez que apresentaram recuperação (ou tendência à recuperação) da sua expressão aos níveis normais, quando as células foram reoxigenadas. Além de modular a expressão de diversos genes sem função conhecida, B. emersonii responde à hipóxia reajustando a expressão de genes responsáveis pela produção e consumo de energia. Pelo menos transcricionalmente, este fungo favorece o metabolismo anaeróbico, através da indução de genes que codificam enzimas da via glicolítica e lactato desidrogenase, ao passo que no ciclo do ácido cítrico, a maioria dos genes encontram-se reprimidos ou não sofrem alteração na expressão. Processos dispendiosos em energia como síntese protéica, metabolismo de aminoácidos, enovelamento de proteínas e transporte por membrana apresentaram perfis predominantemente de repressão gênica quando em carência de oxigênio. Ainda utilizando a técnica de microarranjos, mostramos semelhanças entre os perfis transcricionais nos experimentos hipóxia e de carência de Fe2+ (tratamento com quelante de Fe2+ 2,2´-dipyridyl) sugerem que estes estresses estão de alguma forma relacionados, fornecendo bons indícios de que o íon Fe2+ possa ter um papel importante no mecanismo sensor de oxigênio e/ou de resposta a hipóxia em B. emersonii. Além disso, o tratamento prévio de células submetidas à hipóxia com o antibiótico geldanamicina, um conhecido inibidor da proteína de choque térmico HSP90, levou à diminuição da indução de certos genes de hipóxia, indicando que este fungo pode possuir algum mecanismo semelhante ao do fator de transcrição de hipóxia HIF1-α de mamíferos, uma vez que este fator também é afetado por geldanamicina. Adicionalmente, desenvolvemos um protocolo para transformação de B. emersonii mediada por Agrobacterium tumefasciens que se mostrou promissor. A transferência do T-DNA contendo um gene de resistência a higromicina B, presente no vetor binário pBINPLUS-Hph, foi evidenciada pelo crescimento normal e esporulação das células transformadas, na presença do antibiótico e pela amplificação do gene de resistência no DNA genômico de células transformadas. / In this work we analyzed global gene expression changes in the aquatic fungus Blastocladiella emersonii submitted to oxygen deprivation (hypoxia), using cDNA microarrays containing 3,773 distinct genes. In gradual hypoxia (gradual decrease in dissolved oxygen concentration, followed by reoxygenation) and direct hypoxia (direct decrease of dissolved oxygen concentration, followed by reoxygenation) we observed 650 differentially expressed genes in at least one of the stress conditions tested, 534 of them being affected (directly or indirectly) by oxygen availability, since they showed recovery of normal expression levels or a tendency to recover, when cells were reoxygenated. Besides modulating many genes with no previously assigned function, B. emersonii responds to hypoxia by readjusting the expression levels of genes responsible for energy production and consumption. At least transcriptionally, this fungus seems to favour anaerobic metabolism through the induction of genes encoding glycolytic enzymes and lactate dehydrogenase, while in the TCA-cycle, most genes were repressed or unchanged. Energy-costly processes like protein synthesis, amino acid metabolism, protein folding and transport had their gene expression profiles predominantly repressed during oxygen deprivation. Microarray experiments also showed similarities between the transcriptional profile of genes in hypoxia and iron (II) deprivation (treatment with the iron (II) chelator 2,2\'-dipyridyl), suggesting that these stresses are somehow related, giving good evidence that Fe2+ ion could have a role in the mechanism of oxygen sensing and/or response to hypoxia in B. emersonii. Furthermore, pretreatment of cells subjected to hypoxia with the antibiotic geldanamycin, a known inhibitor of the heat shock protein HSP90, caused a significant decrease in the induction of certain hypoxic genes, indicating that this fungus could have a mechanism similar to that of the mammalian hypoxia transcription factor HIF-1α, which is also affected by geldanamycin. Additionally, we developed an Agrobacterium tumefasciens-mediated protocol for transformation of B. emersonii that has shown to be promising. The capacity to transfer the T-DNA containing a hygromycin B resistance gene, present in the pBINPLUSHph binary vector, was evidenced by the normal growth and sporulation of the transformed cells in the presence of antibiotic and by amplification of the resistance gene from the genomic DNA of transformed cells

Usando incorporação \"in vivo\" de 35S metionina tradução \"in vitro\" de RNA e eletroforese bidimensional, iniciamos um estudo do controle da síntese de proteínas durante duas fases distintas de diferenciação celular, a esporulação e a germinação, do fungo Blastocladiella emersonii. Durante a esporulação ocorre uma intensa variação no padrão de síntese proteica. Foi analisada a síntese de 108 proteínas, sendo verificado que o aumento na síntese de várias proteínas está associado com estágios definidos da esporulação. Um grande número de proteínas básicas é sintetizado exclusivamente no final da esporulação, que corresponde à fase de diferenciação dos zoósporos. Também foram detectadas drásticas variações na população de mRNAs ao longo de toda a esporulação. A síntese de várias proteínas típicas da esporulação parece ser controlada ao nível da transcrição. Além disso a maioria dos RNAs mensageiros específicos da esporulação não é conservada nos zoósporos maduros; o zoósporos contém mRNAs armazenados que provavelmente são sintetizados nos últimos 30 minutos da esporulação. Durante a transição dos zoósporos a células redondas, que ocorre nos primeiros 25 minutos após a indução da germinação em meio inorgânico, não foram verificadas diferenças qualitativas no padrão de síntese proteica, tanto na ausência como na presença de actinomicina D, indicando que os eventos precoces da germinação são inteiramente pré-programados pelo mRNA que está armazenado nos zoósporos. Contudo, na germinação tardia são verificadas profundas variações no padrão de síntese proteica. A síntese de algumas dessas proteínas (seis polipeptídios), provavelmente corresponde a uma tradução seletiva de mensagens armazenadas nos zoósporos, enquanto que a maioria das novas proteínas expressas (vinte e dois polipeptídios) corresponde a tradução de novos mRNAs. Assim, durante a germinação dos zoósporos, ocorrem múltiplos níveis de regulação da síntese proteica, envolvendo controles ao nível da tradução e transcrição. Durante o início da germinação também foi observado um controle ao nível de pós-traduçãoo, com várias proteínas dos zoósporos sendo especificamente degradadas ou modificadas. Também analisamos o padrão das proteínas sintetizadas durante a germinação em meio nutriente sendo observada a síntese de polipeptídios específicos desta condição de germinação e crescimento. Algumas proteínas cuja síntese é controlada pelo desenvolvimento foram identificadas. Utilizando anticorpos monoclonais comerciais contra actina, α e β-turbulinas foip-tubulinas foi possível identificar estas proteínas no perfil eletroforético de proteínas sintetizadas durante a esporulação. Comparando a cinética da síntese \"oin vitro\" destas proteínas com o acúmulo de seus respectivos mRNAs traduzidos \"in vitro\", o, foi possível demonstrar que o intenso aumento na síntese de actina, α e β-tubulinas que ocorre durante a esporulação apresenta uma correlação temporal com o aumento dos mRNAs correspondentes. Em paralelo ao aumento da síntese destas três proteínas citoesqueLéticas pôde ser detectado um aumento dos seus conteúdos em massa. Durante a germinação e crescimento ocorre uma sensível diminuição no conteúdo destas proteínas. Além disso, verificamos que as proteínas identificadas como α e β-tubulinas estão presentes no flagelo dos zoósporos. Muito interessante foi a observação de que três proteínas sintetizadas durante a esporulação correspondiam aparentemente a três proteínas, Hsp70, Hsp76 e Hsp39a, cuja síntese é induzida pelo choque térmico. Esta verificação decorreu do fato de estarmos investigando se em Blastocladiella a resposta ao choque térmico teria algum controle do desenvolvimento, uma vez que alguns dados da literatura sugeriam o envolvimento de certas proteínas de choque térmico (Hsps) no desenvolvimento normal de alguns organismos. Em Blastocladiella a resposta ao choque térmico é dependente do estágio do desenvolvimento. Células expostas a temperaturas elevadas nos diferentes estágios do desenvolvimento (esporulação, germinação e crescimento) mostram uma síntese diferencial de proteínas de choque térmico. Conjuntos específicos de Hsps (de um total de 22 Hsps) são induzidos em cada fase, demonstrando uma expressão não coordenada dos genes de choque térmico. A proteína de 70 kDa, sintetizada espontaneamente durante um certo intervalo da esporulação, apresenta mobilidade eletroforética em géis bidimensionais idêntica à Hsp70. A confirmação da identidade entre estas proteínas foi obtida através de análise dos seus peptídios resultantes de digestão enzimática parcial bem como pelo reconhecimento de ambas as proteínas por anticorpos contra a proteína DnaK (homóloga à Hsp70> de E. coli e contra a proteína Hsp70 de Drosophila. Utilizando tradução o\"in vitro\"o de RNA e hibridização de RNA com uma sonda do gene hsp70 de Drosophila, demonstramos que o aumento de síntese da Hsp70 que ocorre durante o choque térmico e espontaneamente durante a esporulação, está associado com a acumulação do mRNA desta proteína. Embora a síntese de Hsps seja controlada pelo desenvolvimento em Blastocladiella, a aquisição de termotolerância pode ser induzida em qualquer estágio do seu ciclo de vida. A indução da termotolerância em Blastocladiella é dependente da síntese de proteínas e está correlacionada com o aumento da síntese de algumas Hsps: Hsp82a, Hsp82b, Hsp76, Hsp70, Hsp60,Hsp25 e Hsp17b. As outras Hsps parecem não estar envolvidas especificamente com a termotolerância. As observações anteriores de que o estado de fosforilação da proteína ribossômica 56, em Blastocladiella, varia durante o desenvolvimento e em resposta a alterações do meio ambiente (Bonato et al., 1984, Eur. J. Biochem. 144:597-606) e a verificação de que a resposta ao choque térmico, em Blastocladiella, também está sob o controle do desenvolvimento proporcionou a oportunidade de verificar se os diferentes níveis de fosforilação de 56 poderiam ser correlacionados com a tradução de mensageiros específicos isto é, mRNAs normais ou de choque térmico durante o choque térmico, recuperação do choque térmico e indução de termotolerância nos diferentes estágios do ciclo de vida deste fungo. Assim foi observado que, independente do estado inicial de fosforilação de 56 (máximo ou intermediário>, ocorre uma rápida e completa desfosforilação de 56 durante o choque térmico, sendo que a 56 permanece desfosforilada durante a termotolerância. Durante a recuperação do choque térmico, ocorre a refosforilação de 56 para os níveis característicos de cada estágio do desenvolvimento, coincidentemente com a interrupção da síntese de proteínas de choque térmico. / Using 35S methionine pulse labeling in vitro translation and two-dimensional gel electrophoresis, we investigated the regulation of protein synthesis during two distinct phases of cell differentiation, sporulation and germination, in the aquatic fungus Blastocladiella emersonii. We have found dramatic changes in the spectrum of proteins synthesized during sporulation. Synthesis of 108 polypeptides was analyzed and a large increase in the synthesis of several proteins is associated with particular stages. A large number of basic proteins are synthesized exclusively during late sporulation. Changes in translatable mRNA species were also detected by in vitro translation of RNA prepared at different stages of sporulation. The synthesis of several proteins during sporulation seems to be transcriptionally controlled. Most of the sporulationspecific messages are not present in the mature zoospores; the zoospores contain stored mRNA, which is apparently synthesized in the last 30 min of sporulation.We analyzed the pattern of proteins synthesized during zoospore germination in an inorganic solution, in both the presence and absence of actinomycin D. During the transition from zoospore to round cells (the first 25 min), essentially no qualitative differences were noticeable, indicating that the earliest stages of germination are entirely preprogrammed with stored RNA. Later in germination (after 25 min), however, changes in the pattern of protein synthesis were found. Some of these proteins (a total of 6 polypeptides) correspond possibly to a selective translation of stored messages, whereas the majority of the changed proteins (22 polypeptides) corresponds to newly synthesized mRNA. Thus, multiple levels of protein synthesis regulation seem to occur during zoospore germination, involving both transcriptional and translational controls. We also analyzed the pattern of protein synthesis during germination in a nutrient medium; synthesis of specific polypeptides occurred during late germination. During early germination posttranslational control was also observed, several labeled proteins from zoospores being specifically degraded or charge modified. Some proteins whose expression is developmentally regulated were identified. Actin, α- and β-tubulin have been identified in the two-dimensional pattern of proteins synthesized during sporulation by using well characterized monoclonal antibodies and western blotting. We compared the kinetics of synthesis of these proteins, by pulse-labeling experiments with ‌35S‌methionine, with the accumulation of their corresponding mRNAs, translated in a cell-free system. Large increases occur in the rates of actin and α- and β-tubulin biosynthesis during sporulation and there is an accumulation of the corresponding mRNAs. In parallel to the increased synthesis, these cytoskeletal proteins accumulate during the late stage of sporulation. During germination and early growth there is a strong decrease in the level of these proteins. We also verified that α- and β-tubulin are present in flagellar axonemes of zoopores. Very interesting was the observation that three proteins spontaneously expressed during sporulation correspond possibly to three heat shock-induced proteins CHsp70, Hsp76, Hsp39a). This fact was noticed when we were investigating the heat shock-response during the development of Blastocladiella. The heat-shock response in Blastocladiella is dependent on the developmental stage. Cells exposed to elevated temperatures at different stages of life cycle (sporulation, germination or growth) show a differential synthesis of heat-shock proteins (Hsps). Of a total af 22 polypeptides induced, particular subsets of Hsps appear in each phase, demonstrating a non-coordinate heat-shock gene expression. By the criteria of two-dimensional gel electrophoresis and partial proteolysis mapping, the 70-kDa protein, whose synthesis is induced spontaneously during sporulation, is indistinguishable from the heat-inducible hsp70. Additional evidence in support of the identity between the 70-kDa protein and Hsp70 was provided by immunological cross-reaction of both proteins with antibodies against DnaK protein from E.coli and Hsp70 from Drosophila. The techniques of in vitro translation, and Northern analysis using a Drosophila hsp70 probe, demonstrated that enhanced synthesis of hsp70, which occurs during heat-shock treatment and spontaneously during sporulation, is associated with an accumulation of Hsp70 mRNA. Although the Hsps synthesis is developmentally regulated in Blastocladiella, the acquisition of thermotolerance can be induced at any stage of the life cycle. lhe development of thermotolerance is correlated with the enhanced synthesis of some heat-shock proteins: Hsp82a, Hsp82b, Hsp76, Hsp70, Hsp60, Hsp25, Hsp17b. Other Hsps are not specifically involved in thermotolerance. In B. emersonii the state of 56 phosphorylation changes depending on the developmental stage and environmental conditions (Bonato et al., 1984, Eur. J. Biochem. 144, 597-606). On the other hand, we verified that the heat-shock response is developmentally regulated. Then, we examined the changes in 56 phosphorylation during heat shock, thermotolerance, and recovery from heat shock at different stages of life cycle in order to investigate whether the different levels of 56 phosphorylation might be correlated with the translation of specific message subsets. We observed that independently of the initial state of 56 phosphorylation (maximal or intermediate), a rapid and complete dephosphorylation of 56 is induced by heat shock and 56 remains unphosphorylated during the acquired thermotolerance. During recovery from heat shock rephosphorylation of 56 occurs always to the levels characteristic of that particular stage, coincidently with the turn off of heat shock protein synthesis.

Usando incorporação \"in vivo\" de 35S metionina tradução \"in vitro\" de RNA e eletroforese bidimensional, iniciamos um estudo do controle da síntese de proteínas durante duas fases distintas de diferenciação celular, a esporulação e a germinação, do fungo Blastocladiella emersonii. Durante a esporulação ocorre uma intensa variação no padrão de síntese proteica. Foi analisada a síntese de 108 proteínas, sendo verificado que o aumento na síntese de várias proteínas está associado com estágios definidos da esporulação. Um grande número de proteínas básicas é sintetizado exclusivamente no final da esporulação, que corresponde à fase de diferenciação dos zoósporos. Também foram detectadas drásticas variações na população de mRNAs ao longo de toda a esporulação. A síntese de várias proteínas típicas da esporulação parece ser controlada ao nível da transcrição. Além disso a maioria dos RNAs mensageiros específicos da esporulação não é conservada nos zoósporos maduros; o zoósporos contém mRNAs armazenados que provavelmente são sintetizados nos últimos 30 minutos da esporulação. Durante a transição dos zoósporos a células redondas, que ocorre nos primeiros 25 minutos após a indução da germinação em meio inorgânico, não foram verificadas diferenças qualitativas no padrão de síntese proteica, tanto na ausência como na presença de actinomicina D, indicando que os eventos precoces da germinação são inteiramente pré-programados pelo mRNA que está armazenado nos zoósporos. Contudo, na germinação tardia são verificadas profundas variações no padrão de síntese proteica. A síntese de algumas dessas proteínas (seis polipeptídios), provavelmente corresponde a uma tradução seletiva de mensagens armazenadas nos zoósporos, enquanto que a maioria das novas proteínas expressas (vinte e dois polipeptídios) corresponde a tradução de novos mRNAs. Assim, durante a germinação dos zoósporos, ocorrem múltiplos níveis de regulação da síntese proteica, envolvendo controles ao nível da tradução e transcrição. Durante o início da germinação também foi observado um controle ao nível de pós-traduçãoo, com várias proteínas dos zoósporos sendo especificamente degradadas ou modificadas. Também analisamos o padrão das proteínas sintetizadas durante a germinação em meio nutriente sendo observada a síntese de polipeptídios específicos desta condição de germinação e crescimento. Algumas proteínas cuja síntese é controlada pelo desenvolvimento foram identificadas. Utilizando anticorpos monoclonais comerciais contra actina, α e β-turbulinas foip-tubulinas foi possível identificar estas proteínas no perfil eletroforético de proteínas sintetizadas durante a esporulação. Comparando a cinética da síntese \"oin vitro\" destas proteínas com o acúmulo de seus respectivos mRNAs traduzidos \"in vitro\", o, foi possível demonstrar que o intenso aumento na síntese de actina, α e β-tubulinas que ocorre durante a esporulação apresenta uma correlação temporal com o aumento dos mRNAs correspondentes. Em paralelo ao aumento da síntese destas três proteínas citoesqueLéticas pôde ser detectado um aumento dos seus conteúdos em massa. Durante a germinação e crescimento ocorre uma sensível diminuição no conteúdo destas proteínas. Além disso, verificamos que as proteínas identificadas como α e β-tubulinas estão presentes no flagelo dos zoósporos. Muito interessante foi a observação de que três proteínas sintetizadas durante a esporulação correspondiam aparentemente a três proteínas, Hsp70, Hsp76 e Hsp39a, cuja síntese é induzida pelo choque térmico. Esta verificação decorreu do fato de estarmos investigando se em Blastocladiella a resposta ao choque térmico teria algum controle do desenvolvimento, uma vez que alguns dados da literatura sugeriam o envolvimento de certas proteínas de choque térmico (Hsps) no desenvolvimento normal de alguns organismos. Em Blastocladiella a resposta ao choque térmico é dependente do estágio do desenvolvimento. Células expostas a temperaturas elevadas nos diferentes estágios do desenvolvimento (esporulação, germinação e crescimento) mostram uma síntese diferencial de proteínas de choque térmico. Conjuntos específicos de Hsps (de um total de 22 Hsps) são induzidos em cada fase, demonstrando uma expressão não coordenada dos genes de choque térmico. A proteína de 70 kDa, sintetizada espontaneamente durante um certo intervalo da esporulação, apresenta mobilidade eletroforética em géis bidimensionais idêntica à Hsp70. A confirmação da identidade entre estas proteínas foi obtida através de análise dos seus peptídios resultantes de digestão enzimática parcial bem como pelo reconhecimento de ambas as proteínas por anticorpos contra a proteína DnaK (homóloga à Hsp70> de E. coli e contra a proteína Hsp70 de Drosophila. Utilizando tradução o\"in vitro\"o de RNA e hibridização de RNA com uma sonda do gene hsp70 de Drosophila, demonstramos que o aumento de síntese da Hsp70 que ocorre durante o choque térmico e espontaneamente durante a esporulação, está associado com a acumulação do mRNA desta proteína. Embora a síntese de Hsps seja controlada pelo desenvolvimento em Blastocladiella, a aquisição de termotolerância pode ser induzida em qualquer estágio do seu ciclo de vida. A indução da termotolerância em Blastocladiella é dependente da síntese de proteínas e está correlacionada com o aumento da síntese de algumas Hsps: Hsp82a, Hsp82b, Hsp76, Hsp70, Hsp60,Hsp25 e Hsp17b. As outras Hsps parecem não estar envolvidas especificamente com a termotolerância. As observações anteriores de que o estado de fosforilação da proteína ribossômica 56, em Blastocladiella, varia durante o desenvolvimento e em resposta a alterações do meio ambiente (Bonato et al., 1984, Eur. J. Biochem. 144:597-606) e a verificação de que a resposta ao choque térmico, em Blastocladiella, também está sob o controle do desenvolvimento proporcionou a oportunidade de verificar se os diferentes níveis de fosforilação de 56 poderiam ser correlacionados com a tradução de mensageiros específicos isto é, mRNAs normais ou de choque térmico durante o choque térmico, recuperação do choque térmico e indução de termotolerância nos diferentes estágios do ciclo de vida deste fungo. Assim foi observado que, independente do estado inicial de fosforilação de 56 (máximo ou intermediário>, ocorre uma rápida e completa desfosforilação de 56 durante o choque térmico, sendo que a 56 permanece desfosforilada durante a termotolerância. Durante a recuperação do choque térmico, ocorre a refosforilação de 56 para os níveis característicos de cada estágio do desenvolvimento, coincidentemente com a interrupção da síntese de proteínas de choque térmico. / Using 35S methionine pulse labeling in vitro translation and two-dimensional gel electrophoresis, we investigated the regulation of protein synthesis during two distinct phases of cell differentiation, sporulation and germination, in the aquatic fungus Blastocladiella emersonii. We have found dramatic changes in the spectrum of proteins synthesized during sporulation. Synthesis of 108 polypeptides was analyzed and a large increase in the synthesis of several proteins is associated with particular stages. A large number of basic proteins are synthesized exclusively during late sporulation. Changes in translatable mRNA species were also detected by in vitro translation of RNA prepared at different stages of sporulation. The synthesis of several proteins during sporulation seems to be transcriptionally controlled. Most of the sporulationspecific messages are not present in the mature zoospores; the zoospores contain stored mRNA, which is apparently synthesized in the last 30 min of sporulation.We analyzed the pattern of proteins synthesized during zoospore germination in an inorganic solution, in both the presence and absence of actinomycin D. During the transition from zoospore to round cells (the first 25 min), essentially no qualitative differences were noticeable, indicating that the earliest stages of germination are entirely preprogrammed with stored RNA. Later in germination (after 25 min), however, changes in the pattern of protein synthesis were found. Some of these proteins (a total of 6 polypeptides) correspond possibly to a selective translation of stored messages, whereas the majority of the changed proteins (22 polypeptides) corresponds to newly synthesized mRNA. Thus, multiple levels of protein synthesis regulation seem to occur during zoospore germination, involving both transcriptional and translational controls. We also analyzed the pattern of protein synthesis during germination in a nutrient medium; synthesis of specific polypeptides occurred during late germination. During early germination posttranslational control was also observed, several labeled proteins from zoospores being specifically degraded or charge modified. Some proteins whose expression is developmentally regulated were identified. Actin, α- and β-tubulin have been identified in the two-dimensional pattern of proteins synthesized during sporulation by using well characterized monoclonal antibodies and western blotting. We compared the kinetics of synthesis of these proteins, by pulse-labeling experiments with ‌35S‌methionine, with the accumulation of their corresponding mRNAs, translated in a cell-free system. Large increases occur in the rates of actin and α- and β-tubulin biosynthesis during sporulation and there is an accumulation of the corresponding mRNAs. In parallel to the increased synthesis, these cytoskeletal proteins accumulate during the late stage of sporulation. During germination and early growth there is a strong decrease in the level of these proteins. We also verified that α- and β-tubulin are present in flagellar axonemes of zoopores. Very interesting was the observation that three proteins spontaneously expressed during sporulation correspond possibly to three heat shock-induced proteins CHsp70, Hsp76, Hsp39a). This fact was noticed when we were investigating the heat shock-response during the development of Blastocladiella. The heat-shock response in Blastocladiella is dependent on the developmental stage. Cells exposed to elevated temperatures at different stages of life cycle (sporulation, germination or growth) show a differential synthesis of heat-shock proteins (Hsps). Of a total af 22 polypeptides induced, particular subsets of Hsps appear in each phase, demonstrating a non-coordinate heat-shock gene expression. By the criteria of two-dimensional gel electrophoresis and partial proteolysis mapping, the 70-kDa protein, whose synthesis is induced spontaneously during sporulation, is indistinguishable from the heat-inducible hsp70. Additional evidence in support of the identity between the 70-kDa protein and Hsp70 was provided by immunological cross-reaction of both proteins with antibodies against DnaK protein from E.coli and Hsp70 from Drosophila. The techniques of in vitro translation, and Northern analysis using a Drosophila hsp70 probe, demonstrated that enhanced synthesis of hsp70, which occurs during heat-shock treatment and spontaneously during sporulation, is associated with an accumulation of Hsp70 mRNA. Although the Hsps synthesis is developmentally regulated in Blastocladiella, the acquisition of thermotolerance can be induced at any stage of the life cycle. lhe development of thermotolerance is correlated with the enhanced synthesis of some heat-shock proteins: Hsp82a, Hsp82b, Hsp76, Hsp70, Hsp60, Hsp25, Hsp17b. Other Hsps are not specifically involved in thermotolerance. In B. emersonii the state of 56 phosphorylation changes depending on the developmental stage and environmental conditions (Bonato et al., 1984, Eur. J. Biochem. 144, 597-606). On the other hand, we verified that the heat-shock response is developmentally regulated. Then, we examined the changes in 56 phosphorylation during heat shock, thermotolerance, and recovery from heat shock at different stages of life cycle in order to investigate whether the different levels of 56 phosphorylation might be correlated with the translation of specific message subsets. We observed that independently of the initial state of 56 phosphorylation (maximal or intermediate), a rapid and complete dephosphorylation of 56 is induced by heat shock and 56 remains unphosphorylated during the acquired thermotolerance. During recovery from heat shock rephosphorylation of 56 occurs always to the levels characteristic of that particular stage, coincidently with the turn off of heat shock protein synthesis.

Foram estudadas as enzimas implicadas no metabolismo de cAMP, bem como as variações na concentração deste nucleotídeo cíclico e na atividade de adenilato ciclase durante o ciclo biológico de B. emersonii. Demonstrou-se que os zoósporos contêm enzimas específicas e distintas para a hidrólise de cAMP e cGMP. Existe apenas uma espécie molecular da cAMP fosfodiesterase, que hidrolisa cAMP a 5\'-AMP com um Km aparente de 2-4 µM; a presença de cGMP nas misturas de reação, não altera as propriedades cinéticas da enzima. A adenilato ciclase de B. emersonii é uma enzima particulada, provavelmente ligada à membrana plasmática do zoósporo, que exige especificamente Mn2+ para sua atividade. A enzima não é ativada por NaF, catecolaminas ou outros compostos de estrutura semelhante. O estudo das propriedades cinéticas da adenilato ciclase sugere um modelo simples no qual o verdadeiro substrato da enzima é o complexo MnATP2- e tanto ATP corno Mn2+ , nas suas formas livres, competem com o complexo pelo sítio catalítico da enzima, que apresenta uma afinidade maior pelas formas livres do que pelo complexo MnATP2-. A atividade especifica da adenilato ciclase, determinada durante o ciclo biológico do fungo, mostra-se elevada nos zoósporos, cai lentamente durante a germinação e permanece baixa em todo o período de crescimento, só voltando a apresentar um aumento na atividade após a indução da esporulação. Quando este processo e induzido na presença de cicloheximida, a atividade permanece baixa, sugerindo que a enzima é sintetizada \"de novo\" nesta fase do ciclo evolutivo. A concentração intracelular de cAMP foi também determinada nas várias fases do ciclo biológico de B. emersonii. No zoósporo encontrou-se um valor médio de 33 pmoles cAMP/mg proteína. Durante a germinação, os níveis de cAMP aumentam, atingindo um máximo (~ 100 pmoles/mg proteína)quando a quase totalidade dos zoósporos se transformou em esferócitos. A partir daí observou-se um declínio gradual nos níveis de cAMP, que permanecem baixos durante toda a fase de crescimento, voltando a elevar-se na fase final da esporulação até alcançar o nível de zoósporo. O grande aumento na concentração intracelular de cAMP na fase de esferócitos é parcialmente explicado pela predominância da atividade de adenilato ciclase sobre a atividade de cAMP fosfodiesterase neste período; a possibilidade de uma ativação \"in vivo\" da adenilato ciclase, neste estágio do ciclo, não pode ser excluída. A queda nos níveis de cAMP que ocorre na passagem de esferócito a gérmen, numa fase onde a atividade de cAMP fosfodiesterase já e muito baixa, é devido principalmente a excreção deste nucleotídio cíclico para o meio extracelular. O grande aumento nos níveis de cAMP durante a transição de zoósporo a esferócito pode estar relacionado com a ativação metabólica ocorrendo nesta fase e pode também refletir uma característica de sistemas em diferenciação, isto é, a necessidade de altos níveis de cAMP para a transição entre dois estados celulares diferenciados. / The enzymes involved in the metabolism of cAMP have been studied, as well as the fluctuations in the concentration of this cyclic nucleotide and in the adenylate cyclase activity during the life cycle of B. emersonii. Zoospores were shown to contain independent specific enzymes involved in the hydrolysis of cAMP and cGMP. A single molecular species was found for the cAMP phosphodiesterase activity, which catalyses the hydrolysis of cAMP to 5\'-AMP. This enzyme displays normal Michaelis kinetics with an apparent Km of 2-4 µM; the addition of cGMP to the reaction mixtures does not modify the kinetic properties of the enzyme. Adenylate cyclase activity in B. emersonii is associated with particulate subcellular fractions, most probably bound to the zoospore plasma membrane. The activity requires Mn2+ and it is not activated by NaF, cathecolamines or other related compounds. The enzyme substrate is the MnATP2- complex and the kinetic data obtained studying the adenylate cyclase activity can be explained by a simple model where free ATP and Mn2+ compete with MnATP2- for the catalytic site of the enzyme, the affinity for MnATP2- being lower than for free Mn2+ and ATP. The specific activity of adenylate cyclase has been determined throughout the fungus life cycle. The enzyme activity is high in zoospores, falls slowly during germination remaining low at the growth phase and rising again during the later stage of sporulation. When this process is induced in the presence of cycloheximide, there is no increase in adenylate cyclase activity, suggesting that \"de novo\" synthesis of the enzyme occurs at this stage. Fluctuations in the intracellular levels of cAMP during the cell cycle of B. emersonii have also been shown. Zoospores contain an average concentration of 33 pmoles cAMP/mg protein. During germination, a significant increase in the cAMP levels is observed, reaching a maximum (ca. 100 pmoles/mg protein) when the majority of the zoospores have changed into round cells. From then on a gradual decline in the cAMP levels is observed. During the growth phase the cAMP contents of the cells remain low, increasing again late in the sporulation stage. The large increase in the intracellular concentration of cAMP in the round cell phase is partially explained by the predominance of adenylate cyclase activity over cAMP phosphodiesterase activity (during this stage); the possibility of an \"in vivo\" activation of the adenylate cyclase during this period, however, cannot be excluded. The decrease in the cAMP levels occurring during the passage of round cells to germlings, in a stage where cAMP phosphodiesterase activity is negligible, is mainly due to the excretion of this cyclic nucleotide to the extracellular medium. The rise in cAMP contents during encystment might be related to the activation of metabolism occurring in this phase and may also reflect a characteristic of differentiating systems, that is, high cAMP levels being necessary for a differentiative transition.

Foram estudadas as enzimas implicadas no metabolismo de cAMP, bem como as variações na concentração deste nucleotídeo cíclico e na atividade de adenilato ciclase durante o ciclo biológico de B. emersonii. Demonstrou-se que os zoósporos contêm enzimas específicas e distintas para a hidrólise de cAMP e cGMP. Existe apenas uma espécie molecular da cAMP fosfodiesterase, que hidrolisa cAMP a 5\'-AMP com um Km aparente de 2-4 µM; a presença de cGMP nas misturas de reação, não altera as propriedades cinéticas da enzima. A adenilato ciclase de B. emersonii é uma enzima particulada, provavelmente ligada à membrana plasmática do zoósporo, que exige especificamente Mn2+ para sua atividade. A enzima não é ativada por NaF, catecolaminas ou outros compostos de estrutura semelhante. O estudo das propriedades cinéticas da adenilato ciclase sugere um modelo simples no qual o verdadeiro substrato da enzima é o complexo MnATP2- e tanto ATP corno Mn2+ , nas suas formas livres, competem com o complexo pelo sítio catalítico da enzima, que apresenta uma afinidade maior pelas formas livres do que pelo complexo MnATP2-. A atividade especifica da adenilato ciclase, determinada durante o ciclo biológico do fungo, mostra-se elevada nos zoósporos, cai lentamente durante a germinação e permanece baixa em todo o período de crescimento, só voltando a apresentar um aumento na atividade após a indução da esporulação. Quando este processo e induzido na presença de cicloheximida, a atividade permanece baixa, sugerindo que a enzima é sintetizada \"de novo\" nesta fase do ciclo evolutivo. A concentração intracelular de cAMP foi também determinada nas várias fases do ciclo biológico de B. emersonii. No zoósporo encontrou-se um valor médio de 33 pmoles cAMP/mg proteína. Durante a germinação, os níveis de cAMP aumentam, atingindo um máximo (~ 100 pmoles/mg proteína)quando a quase totalidade dos zoósporos se transformou em esferócitos. A partir daí observou-se um declínio gradual nos níveis de cAMP, que permanecem baixos durante toda a fase de crescimento, voltando a elevar-se na fase final da esporulação até alcançar o nível de zoósporo. O grande aumento na concentração intracelular de cAMP na fase de esferócitos é parcialmente explicado pela predominância da atividade de adenilato ciclase sobre a atividade de cAMP fosfodiesterase neste período; a possibilidade de uma ativação \"in vivo\" da adenilato ciclase, neste estágio do ciclo, não pode ser excluída. A queda nos níveis de cAMP que ocorre na passagem de esferócito a gérmen, numa fase onde a atividade de cAMP fosfodiesterase já e muito baixa, é devido principalmente a excreção deste nucleotídio cíclico para o meio extracelular. O grande aumento nos níveis de cAMP durante a transição de zoósporo a esferócito pode estar relacionado com a ativação metabólica ocorrendo nesta fase e pode também refletir uma característica de sistemas em diferenciação, isto é, a necessidade de altos níveis de cAMP para a transição entre dois estados celulares diferenciados. / The enzymes involved in the metabolism of cAMP have been studied, as well as the fluctuations in the concentration of this cyclic nucleotide and in the adenylate cyclase activity during the life cycle of B. emersonii. Zoospores were shown to contain independent specific enzymes involved in the hydrolysis of cAMP and cGMP. A single molecular species was found for the cAMP phosphodiesterase activity, which catalyses the hydrolysis of cAMP to 5\'-AMP. This enzyme displays normal Michaelis kinetics with an apparent Km of 2-4 µM; the addition of cGMP to the reaction mixtures does not modify the kinetic properties of the enzyme. Adenylate cyclase activity in B. emersonii is associated with particulate subcellular fractions, most probably bound to the zoospore plasma membrane. The activity requires Mn2+ and it is not activated by NaF, cathecolamines or other related compounds. The enzyme substrate is the MnATP2- complex and the kinetic data obtained studying the adenylate cyclase activity can be explained by a simple model where free ATP and Mn2+ compete with MnATP2- for the catalytic site of the enzyme, the affinity for MnATP2- being lower than for free Mn2+ and ATP. The specific activity of adenylate cyclase has been determined throughout the fungus life cycle. The enzyme activity is high in zoospores, falls slowly during germination remaining low at the growth phase and rising again during the later stage of sporulation. When this process is induced in the presence of cycloheximide, there is no increase in adenylate cyclase activity, suggesting that \"de novo\" synthesis of the enzyme occurs at this stage. Fluctuations in the intracellular levels of cAMP during the cell cycle of B. emersonii have also been shown. Zoospores contain an average concentration of 33 pmoles cAMP/mg protein. During germination, a significant increase in the cAMP levels is observed, reaching a maximum (ca. 100 pmoles/mg protein) when the majority of the zoospores have changed into round cells. From then on a gradual decline in the cAMP levels is observed. During the growth phase the cAMP contents of the cells remain low, increasing again late in the sporulation stage. The large increase in the intracellular concentration of cAMP in the round cell phase is partially explained by the predominance of adenylate cyclase activity over cAMP phosphodiesterase activity (during this stage); the possibility of an \"in vivo\" activation of the adenylate cyclase during this period, however, cannot be excluded. The decrease in the cAMP levels occurring during the passage of round cells to germlings, in a stage where cAMP phosphodiesterase activity is negligible, is mainly due to the excretion of this cyclic nucleotide to the extracellular medium. The rise in cAMP contents during encystment might be related to the activation of metabolism occurring in this phase and may also reflect a characteristic of differentiating systems, that is, high cAMP levels being necessary for a differentiative transition.