Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by giuliana silveira (giulianagphoto@gmail.com) on 2016-04-12T18:33:25Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ProduçãoPurificaçãoCaracterização.pdf: 1800894 bytes, checksum: 81ba847b0ec8fcfae1907bb11bb2a53e (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2016-04-12T19:06:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ProduçãoPurificaçãoCaracterização.pdf: 1800894 bytes, checksum: 81ba847b0ec8fcfae1907bb11bb2a53e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-12T19:06:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ProduçãoPurificaçãoCaracterização.pdf: 1800894 bytes, checksum: 81ba847b0ec8fcfae1907bb11bb2a53e (MD5) Previous issue date: 2016 / Os objetivos deste trabalho foram cultivar o fungo Chrysoporthe cubensis em diferentes fontes de carbono de baixo custo, para induzir a produção da poligalacturonase, purificar e caracterizar a enzima, para identificar propriedades funcionais interessantes para possíveis aplicações biotecnológicas. O fungo foi cultivado em meio semi sólido (67% de umidade), com farelo de trigo, casca de maracujá e casca de laranja, além disso os resíduos de frutas foram misturados ao farelo nas proporções 1:1, 3:1 e 9:1 (farelo: resíduo de fruta). O fungo apresentou maior produção da poligalacturonase em meio composto por farelo de trigo e casca de maracujá (3:1), com atividade de 41.49 U/g de substrato, sendo 1,32 vezes maior do que no cultivo em farelo de trigo puro. O extrato enzimático bruto foi purificado a partir da cromatografia de troca iônica DEAE-Sepharose, seguida por cromatografia em gel filtração em coluna Sephacryl S-200, exibindo atividade específica de 1117,45U/mg, com aumento de 28,34 vezes e rendimento final de 29,2 %. A massa molecular da poligalacturonase, obtida através de SDS-PAGE 12% foi de, aproximadamente, 40,74Kd. A enzima apresentou pH e temperatura ótimos de 3,5 e 50°C, repectivamente, e meia vida de 4,05 minutos a 50°C. A enzima se manteve estável na faixa de pH de 2,5 a 8,5, apresentando acima de 80% da atividade após 1h. O substrato preferencial da enzima foi o ácido poligalacturônico e o km e Vmax foi de 0,766 mg.mL-1 e 1,88U/mL, respectivamente. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a PG de C. cubensis é uma enzima importante dentro do complexo hidrolítico secretado pelo fungo quando cultivado em SSF, em meio contendo resíduos agroindustriais. __________________________________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT : The aims of this study were to cultivate the fungi Chrysoporthe cubensis on differents inexpensive carbon sources, to induce polygalacturonase production, purify and characterize the enzyme to identify interesting functional properties for potential biotechnological applications. The fungi was grown in semi solid (67% moisture) with wheat bran, passion fruit peel and orange peel, in addition, the waste fruits were mixed with the meal in the ratios 1: 1, 3: 1 and 9: 1 (bran: fruit residue). The fungus showed increased production of polygalacturonase in medium composed of wheat bran and passion fruit peel (3: 1), activity of 41.49 U / g substrate, being 1.32 times higher than that in pure culture in wheat bran. The crude extract enzyme was purified from the ion exchange chromatography DEAE-Sepharose, followed by gel filtration chromatography on Sephacryl S200 column exhibiting specific activity 1117,45U / mg, an increase of 28.34 fold and final yield of 29 ,2 %. The molecular weight of the polygalacturonase obtained by SDS-12% PAGE was approximately 40,74Kd. The enzyme showed pH 3.5 and temperature to 50 ° C, respectively, and a half life of 4.05 minutes at 50 ° C. The enzyme remained stable in the pH range of 2.5 to 8.5, with over 80% of activity after one hour of incubation. The preferred enzyme substrate was polygalacturonic acid and the Km and Vmax was 0.766 mg.mL-1and 1,88 U/mL, respectively. The results of this study indicate that C. cubensis PG is an important enzyme in the hydrolytic complex secreted by the fungus when grown in SSF, in medium containing organic residues.

Orientador : Nelson Eduardo Duran Caballero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T00:39:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MachucaHerrera_AngelaElena_M.pdf: 4768752 bytes, checksum: bbfe2e28c845d51b2f793118e54a226e (MD5) Previous issue date: 1991 / Resumo: A cepa brasileira de Thermoascus aurantiacus,. um fungo termófilo. foi estudada quanto as condiçeies de crescimento. produção de enzimas e ação sobre materiais lignocelulósicos. O fungo mostrou capacidade para crescer em meios de cul tivo que continham materiais lignocelulósicos como bagaço de cana, casca de arroz e serragem de Eucaliptus grandis. como únicas fontes de carbono. O crescimento do fungo nestes substratos foi melhor do que em substratos celulósicos. As condições ótimas de crescimento do fungo foram determinadas através de métodos estatisticos de otimização. As condiçõs ótimas obtidas em meio Czapek modificado foram: 0.8% (8.0 g/l) de glicose como fonte de carbono, 37.8 mEq/l (3.2 g/l) de NaN03 como fonte de nitrogênio em pH 6,0 a 48C. Nestas condições o fungo alcançou uma velocidade máxima de crescimento ae 4.74 -0.02 (mm/h). Um teor de 27.4% (p/p) de proteina foi obtida do micélio de Thermoascus aurantiacus aos 10 dias de crescimento em meio contendo 1,5% de glicose sob condições estacionárias. A proteina micelial foi hidrolisada e sua composição em aminoácidos foi determinada. A qualidade da proteina de T.aurantiacus é semelhante à proteína da soja e à sugerida pela FAO. Apresentando uma alta concentração de aminoácidos essenciais Na cultura contendo 1,5% de glicose, sob condições estacionárias e de agitação foi detectada a presença de etanol e metanol provavelmente produtos da fermentação de glicose pelo fungo. O fungo produzi enzimas celuloliti cas, hemiceluloliticas e ligninoliticas em maior ou menor quantidade, quando cultivado em meios que continham diferentes substratos de crescimento. As máximas atividades de endo-glicanase (1.49 UI/ml) e xilanase (1.20 UI/ml), foram obtidas em meio contendo 1.5% de glicose. Os máximos valores foram obtidos quando a glicose alcançou uma concentração de 0.3%. no sexto dia de crescimento. sob condições estacionárias. A atividade celulolitica de Thermoascus aurantiacus foi comparável à do fungo Trichoderma reesei (cepa selvagem), o fungo apresentou, atividade enzimática capaz de descolorir Remazol brilliant blue R. sendo que a máxima descoloração ocorreu quando foram adicionados ao meio 1.5% de glicose e 0.5% de serragem de Eucaliptus grandis, simultaneamente. Uma ligeira descoloração ocorreu quando o meio continha somente glicose. Uma alta atividade fenol oxidase foi obtida quando o fungo foi culivado em meio que continha 1,5% de serragem de Eucaliptus grandis e 0,5% de glicose. Nenhuma atividade foi obtida utilizou-se apenas glicose como fonte de carbono. Foi estudada a biodegradação dos componentes da madeira de Eucaliptus grandis (serragem e cavacos) . Após 21 dias de tratamento da madeira com Thermoascus aurantiacus, sob condições estacionárias e 50°C. obteve-se uma perda de peso de 6,7% para serragem e de 6,2% para cavacos, em cultura contendo 0.5% de glicose. Em ambos os casos (serragem e cavacos), o fungo atacou, principalmente, os componentes extraiveis em etanol/benzeno, provovando uma perda em peso de 64.4% na serragem e 59.0% nos cavacos / Abstract: Growth conditions, enzime production and lignocellulosic materials degradation by Brazilian strain of Thermoascus aurantiacus, were studied. The fungus showed ability to grow on lignocellulosic materials such as sugar cane bagasse, rice hull and Eucaliptus grandis sawdust, as single carbon sources. Growth of the fungus in these subtrates was better than cellulosic one. Statistical methods were applied for optimization of the growth conditions in Czapek-glucose (0,8%) modified medium in ph 6.0 at 48 degree degree and a NaN09 concentration of 37.8 mEq/1 (3.2 g/1) were observed. The growth rate value obtained in these conditions was 4.74 +- 0.02mm/h. Cultures of Thermoascus aurantiacus using glucose (1.50%) showed a 27.4% (w/w) of mycelila protein after 10 days incubation. Mycelial protein showed essential amino acids content similar to soybean protein and FAO standard requirements. Ethanol and methanol were detected in the extracellular medium of Thermoascus aurantiacus agitated as well as in stationary cultures using glucose 1.5%. Cellulolytic, hemicellilolytic and ligninolytic activities were produced when the fungus grown on a variety of substrates High endo-glucanase (1.49 UI/ml) and xylanase (1.20 UI/ml) activities were detected on glucose 1.5%. A higher enzyme activity was reached when the glucose concentration was reduced to 0.3% (sixth day) Thermoascus aurantiacus exhibits cellulolytic similar to Trichoderma reesei (wild strain). The higher decoloriation of Remazol brilliant blue (RBB-R) by cultures of Thermoascus aurantiacus in the presence of glucose (0.5% ) and Eucaliptus grandis sawdust (1.5%) simultaneously was observed. A light decolorization was observed when glucose was used as single carbon source. High phenol-oxidase activirty was reached when the fungal growth was on Eucaliptus grandis sawdust (1.5%) plus glucose (0.5%). No phenol-oxidase activity was observed when glucose was used as single carbon source. Sawdust and chips of Eucaliptus grandis biodegradation was studied. Growth of Theromoascus aurantiacus on Eucaliptus grandis resulted in a weight loss of 6.7% and 6.2%, for sawdust and chips respectively after 21 days of incubation at 50 degree on glucose 0.5% Fungal attack was more efficient on the extractives than other wood components. An extractive loss of 64.4% in sawdust and 59.0% in chips was obtained. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Hiroshi Aoyama / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-20T18:24:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MachucaHerrera_AngelaElena_D.pdf: 8160555 bytes, checksum: a51de738a15ce680819592e7da08a4a0 (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: No presente trabalho estudou-se a produção de extratos com atividade fenoloxidásica (FOx) pelo fungo termófilo lhermoasclls aurantiacus. Foram determinadas as melhores condições de cultivo para produção da atividade FOx em meio líquido. A adição de substratos polissacarídicos induziu altos teores de atividade, quando comparado com cultura contendo somente glicose. Farelo de trigo foi o melhor substrato, e em concentração de 1,5% (m/v) induziu níveis entre 1 a 2 UI/mL de atividade. O tipo e tamanho do inóculo afetaram significativamente a produção de atividade, porém a agitação e a oxigenação das culturas não tiveram efeitos significativos. Um pH inicial do meio de cultura entre 6 e 8 favoreceu a produção de atividade FOx. Quando substratos polissacarídicos foram adicionados à cultura, diversas atividades enzimáticas relacionadas à degradação de lignina, em menor ou maior grau, foram detectadas: lacase, peroxidase, manganês-peroxidase, celobiose-quinona oxidoreductase e álcool veratrílico-oxidase. Nas mesmas condições não foi detectada atividade lignina-peroxidase. Após estabelecer as melhores condições para produção de atividade FOx pelo Taurantiacus, foram produzidos extratos com alta atividade para estudos de caracterização cinética. A atividade FOx presente no extrato bruto apresentou características semelhantes às fenoloxidases do tipo lacase. O extrato bruto oxidou uma variedade de substratos típicos de fenoloxidases, na ausência de H202. As maiores atividades foram alcançadas com ácido 2,2'azino-bis-(3 etil benzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS), 2,6-dimetóxifenol (2,6-DMF) e odianisidina. Azida sódica e ácido tioglicólico foram os mais potentes inibidores da reação de oxidação catalizada pelo extrato bruto, ambos típicos inibidores de oxidases que contêm metal. O pH ótimo da reação de oxidação de o-dianisidina foi de 2,8, porém a estabilidade neste pH foi rapidamente perdida após 5 horas de incubação. A temperatura ótima de reação foi observada entre 70 e 80°C, e a estabilidade térmica do extrato bruto foi extremamente elevada, conservando mais de 50% da atividade após 5 horas de incubação à 100°C. Todas as características apresentadas pelo extrato bruto foram semelhantes às da maioria das fenoloxidases de tipo lacase, exceto a elevada temperatura ótima e termoestabilidade, nunca descritas para fenoloxidases de fungos mesófilos ou termófilos. Na intenção de desvendar a natureza responsável pela atividade FOx, procedeu-se à purificação de uma fração contendo tal atividade, a partir das culturas de Tauralltiacus. O trabalho teve que ser redirecionado devido ao inesperado resultado desta etapa, uma vez que a fração com atividade FOx atravessou uma membrana de ultrafiltração de 1,0 kDa e eluiu de uma coluna de Sephadex G-l0 em um volume correspondente a uma massa molecular £ 700 Da. Este resultado, junto com a elevada estabilidade térmica, descartou a possibilidade da existência de uma lacase ou alguma outra enzima, como responsável pela atividade FOx. A fração com alta atividade FOx (fração FOx), parcialmente purificada por Sephadex G10, foi caracterizada quanto às propriedades cinéticas e estruturais. As propriedades de pH e temperatura ótimos de atividade e estabilidade, foram semelhantes às do extrato bruto. A fração FOx oxidou os mesmos substratos que o extrato bruto, porém com maiores velocidades. Somente o efeito de inibidores foi diferente, observando-se uma diminuição do efeito inibitório em relação ao extrato bruto. A suspeita da presença de um sideróforo (complexante de Fe de baixa massa molecular), responsável pela atividade FOx, presente no extrato bruto e na fração, levou à procura destes compostos nas culturas de T.aurantiacus, utilizando o reagente universal Chromo azurol S (CAS). Através deste método foi possível confirmar a produção de sideróforos pelo fungo, em meio sólido e líquido, sendo que em meio líquido a máxima produção de atividade FOx coincidiu com uma mínima reação CASo Porém, apesar dos resultados positivos em meio de cultura, a fração FOx não reagiu com CASo. A caracterização estrutural da fração FOx revelou uma estrutura tipo hidroxamato com uma massa molecular aproximada de 530 Da, aparentemente sem aminoácidos, e com alguns metais (Ca, Mg, Fe) participando desta estrutura. Todos os resultados de caracterização estrutural sugeriram que o composto responsável pela atividade FOx, era um sideróforo pertencente à classe dos hidroxamatos. Estes resultados e outros preliminares, sugerem um mecanismo de ação para a fração FOx, onde o Fe presente na fração seria o responsável pelo potencial de oxidação de diversos substratos. Resultados preliminares indicam também que o F e participante na reação de oxidação de o-dianisidina é Fe (II). Assim, parece que a fração FOx complexa Fe (III) e, posteriormente, quando necessário esse Fe (III) seria reduzido para Fe (II) pela própria fração. Visando a aplicação biotecnológica dos extratos com alta atividade FOx de T. aurantiacus, estes foram utilizados no tratamento de uma polpa Kraft de Eucalipto e de um efluente, resultante do processo Kraft. Os extratos ativos mostraram-se eficientes no tratamento das polpas, obtendo-se 39% de deslignificação após 60 minutos à 500C e pH 3,0, porém nestas condições uma redução da viscosidade foi observada. A adição de ABTS, como um mediador redox, não aumentou a eficiência de deslignificação observada na sua ausência. Os efluentes, após 72 horas de tratamento com o extrato ativo de J:aurantiacus, à 250C e pH 4,0, apresentaram 60 a 70% de redução de fenóis, dependendo das condições de incubação. Sob condições estacionárias, obteve-se 67% de despolimerização e 5% de mineralização das cloroligninas de elevada massa molecular. Ao mesmo tempo, sob condições agitadas obteve-se 47% de mineralização. A redução da cor variou de 61 a 35%, sob condições agitadas ou estacionárias, respectivamente / Abstract: This work involves the phenoloxidase activity (POx) production by the thermophilic fungus Thermoascus auralltiacus. The best conditions for POx activity production in liquid culture were determined. The addition of lignocellulosic and polyssacharides substrates to culture induced high leveI POx activity. The best substrate was the wheat bran which induced between 1-2 UI/mL, when utilized in concentration of 1.5% (w/v). The type and size of inoculum influenced the activity production, however the agitation and oxygenation of cultures did not affect it significantly. The initial pH between 6-8 supported the higher POx activity production. Different enzymatic activities related to lignin degradation such as laccase, peroxidase, Mn-peroxidase, cellobiose-quinone oxidoreductase and veratryl alcohol oxidase, but no ligninperoxidase, were detected in the cultures containing polyssacharides substrates. After the best conditions to POx activity production by Taurantiacus were established, crude extracts with high POx activity were utilized in the kinetic characterization. The POx activity showed similar characteristics to phenoloxidases laccase type. The crude extracts oxidized various typical substrates of phenoloxidases, in the absence of H202. The higher activities were produced with ABTS, 2,6-DMP and o-dianisidine. Typical inhibitors of oxidases containing metal, such as sodic azide and thioglycollic acid, were the most potent inhibitors of POx activity. The optimal pH for o-dianisidina oxidation was 2.8, but in this pH the stability was rapidly lost after 5 hours of incubation. The optimal temperature was found between 70 and 800C, and the crude extract showed an high thermostability, keeping more than 50% of activity after 5 hours of incubation at 100°C. All the characteristics of the crude extract were similar to phenoloxidases laccase type, except the high optimal temperature and thermostability, never report for phenoloxidases of mesophilic and thermophilic fungi. To elucidate the responsible nature for POx activity, the purification of an active fraction from Taurantiacus was conducted. The unexpected results of the purfication stage redirected this study. Because of that fraction with POx activity crossed over a 1 kDa ultrafiltration membrane, eluted from Sephadex G-10 column in a elution volume correponding with molecular mass of £ 700 Da, as well as presented high thermostability. The possibility of a laccase or some other enzyme to be responsible by POx activity was excluded. The kinetic and structural properties of the fraction partially purified by Sephadex G-10 with high POx activity, were studied. The properties of optimum pH and temperature for activity and stability were similar to those of the crude extract. The POx fraction oxidized the same substrates than the crude extract, but with higher rates. Unlike of the crude extract a decrease of inhibition was observed with POx fraction. The presence of a siderophore type compound (low-molecular mass Fe chelators) responsible by POx activity in the crude extracts as well in the partially purified fraction was then considered, and led to search for these compounds in the T.aurantiacus cultures, using the universal CAS reactive. Through this method the siderophore production by the fungus, in solid and liquid medium, was confirmed. The maximum production of POx activity in liquid medium coincided with a minimum CAS reaction. However, in spite of the positive results in culture medium, the POx fraction partially purified was not reactive with CAS. The structural characterization of partially purified POx fraction revealed a structure hydroxamate type with approximate molecular mass of 530 Da, apparently lacking aminoacids, and some metais (Ca, Mg, Fe) present in the structure. Thus, the existence of a siderophore hydroxamate type, responsible by POx activity, was suggested through of structural characterization. With these results an mechanism of substrate oxidation by POx fraction was proposed, in which Fe would be responsible by the oxidation of different substrates. Preliminary results showed that Fe is involved in the o-dianisidina oxidation as Fe(II). Apparently, the fraction possessed the ability to both chelate Fe(III) and reduce it to Fe(II), when necessary. The extracts with high POx activity fTom T.aurantiacus were used in biotechnological processes such as treatment of Eucalyptus Kraft pulps and effiuent result of Kraft processo The active extracts showed efficience on pulp biobleaching, with a 39% deslignification after 60 minutes at 500C and pH 3, however a viscosity reduction also was observed. The ABTS addition, as a redox mediator, it not increase the deslignification. After 72 hours of treatment with active extracts at 250C and pH 4, the effiuents showed between 60-70% phenol reduction, depending of incubation conditions. Under static conditions a 67% despolimerization and a 5% mineralization of chlorolignins high-molecular mass were observed. Under agitation conditions a 47% mineralization was observed. A colour reduction effiuent of61 or 35% was obtained under agitation or static conditions, respectively / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Ciências

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-02Bitstream added on 2014-06-13T21:01:54Z : No. of bitstreams: 1 freitas_fz_dr_araiq_prot.pdf: 4506629 bytes, checksum: 72017b1ea005ba3d7b6b2bb0d348f3cc (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / As células eucarióticas são capazes de responder e de se adaptar a diferentes condições ambientais estressantes tais como o choque térmico, modulando sua atividade metabólica. Na levedura Saccharomyces cerevisiae o choque térmico é conhecido por induzir múltiplos genes relacionados a esta forma de estresse, através dos elementos transativadores Hsf1p (Heat Shock Protein) e Msn2/4p, os quais se ligam, respectivamente, às seqüências consensos HSE e STRE, ativando a transcrição. A seqüência nucleotídica do gene da glicogênio sintase (gsn) de Neurospora crassa foi previamente isolada em nosso laboratório e uma análise da expressão gênica mostrou que a transcrição do gene foi diminuída na situação de choque térmico (30 para 45ºC). Uma análise da região 5' flanqueadora revelou a presença dos elementos de DNA CRE, HSE e STRE tanto na região promotora do gene quanto na 5'-UTR. Neste trabalho, nós investigamos o envolvimento destes elementos de DNA na regulação da transcrição na condição de choque térmico, através de ensaios de mobilidade em gel (EMSA) usando como sondas, fragmentos de DNA contendo os elementos transcricionais citados anteriormente. Para isto, foram utilizados como fonte de proteínas extratos nucleares brutos ou fracionados em coluna de Heparina-Sepharose, preparados a partir de micélios coletados antes e após choque térmico (amostras HS30). Os resultados obtidos mostraram a presença de proteínas capazes de reconhecer e ligar aos elementos de DNA testados sob a condição estressante analisada. A especificidade das bandas de mobilidade reduzida foi confirmada por diferentes ensaios de competição, tais como 1) adição prévia de sondas de DNA não marcadas antes da reação de ligação, 2) adição de oligonucleotídeo de DNA dupla fita contendo o elemento STRE do promotor gsn como competidor específico, 3) utilização... / Eukaryotic cells respond and adapt to environmental stressing conditions such as heat shock, by modulating metabolic responses to counteract them. In the yeast Saccharomyces cerevisiae heat shock activates multiple stressing related genes by the trans acting elements Hsfp (Heat shock factors) and Msn2/4p, which bind to the cis regulatory elements HSE (Heat Shock Element) and STRE (Stress Responsive Element), respectively, and activates the gene transcription. We have previously isolated the gene encoding the Neurospora crassa glycogen synthase (gsn) and demonstrated that the gene transcription was decreased under heat shock (30 to 45ºC). An analysis of the gsn 5' flanking region showed the presence of the DNA elements CRE, HSE, and STRE, in the promoter region and in the 5'-untranslated region. In this work we investigated the involvement of these DNA elements in gene transcription regulation under heat shock condition by performing electrophoretic mobility shift assays (EMSA) using, as probes, DNA fragments containing the regulatory elements, and crude or Heparin-Sepharose fractionated nuclear extracts prepared from mycelia collected before and after 30 min of heat shock (HS30 sample). Ours results showed the presence of nuclear proteins capable to recognize and bind to the DNA regulatory elements under heat stress. The specificity of the DNA shifts were confirmed by using 1) unlabelled DNA probes as specific competitor, 2) the gsn promoter STRE double-stranded oligonucleotide as specific competitor, 3) a mutated gsn promoter STRE probe, and 4) the HSE unlabelled probe in a cross-reaction competition assay with the gsn promoter STRE probe. The involvement of the regulatory CRE elements in the modulation of the gsn gene transcription was investigated by using EMSA in the wild type strain, and also in two N. crassa mutant strains defective in the cAMP-signaling pathway: one having hyperactive...(Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Flávio Henrique da Silva / Banca: Nilce Maria Martinez Rossi / Banca: Maria Isabel Nogueira Cano / Banca: Nádia Monesi / Resumo: As células eucarióticas são capazes de responder e de se adaptar a diferentes condições ambientais estressantes tais como o choque térmico, modulando sua atividade metabólica. Na levedura Saccharomyces cerevisiae o choque térmico é conhecido por induzir múltiplos genes relacionados a esta forma de estresse, através dos elementos transativadores Hsf1p (Heat Shock Protein) e Msn2/4p, os quais se ligam, respectivamente, às seqüências consensos HSE e STRE, ativando a transcrição. A seqüência nucleotídica do gene da glicogênio sintase (gsn) de Neurospora crassa foi previamente isolada em nosso laboratório e uma análise da expressão gênica mostrou que a transcrição do gene foi diminuída na situação de choque térmico (30 para 45ºC). Uma análise da região 5' flanqueadora revelou a presença dos elementos de DNA CRE, HSE e STRE tanto na região promotora do gene quanto na 5'-UTR. Neste trabalho, nós investigamos o envolvimento destes elementos de DNA na regulação da transcrição na condição de choque térmico, através de ensaios de mobilidade em gel (EMSA) usando como sondas, fragmentos de DNA contendo os elementos transcricionais citados anteriormente. Para isto, foram utilizados como fonte de proteínas extratos nucleares brutos ou fracionados em coluna de Heparina-Sepharose, preparados a partir de micélios coletados antes e após choque térmico (amostras HS30). Os resultados obtidos mostraram a presença de proteínas capazes de reconhecer e ligar aos elementos de DNA testados sob a condição estressante analisada. A especificidade das bandas de mobilidade reduzida foi confirmada por diferentes ensaios de competição, tais como 1) adição prévia de sondas de DNA não marcadas antes da reação de ligação, 2) adição de oligonucleotídeo de DNA dupla fita contendo o elemento STRE do promotor gsn como competidor específico, 3) utilização...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Eukaryotic cells respond and adapt to environmental stressing conditions such as heat shock, by modulating metabolic responses to counteract them. In the yeast Saccharomyces cerevisiae heat shock activates multiple stressing related genes by the trans acting elements Hsfp (Heat shock factors) and Msn2/4p, which bind to the cis regulatory elements HSE (Heat Shock Element) and STRE (Stress Responsive Element), respectively, and activates the gene transcription. We have previously isolated the gene encoding the Neurospora crassa glycogen synthase (gsn) and demonstrated that the gene transcription was decreased under heat shock (30 to 45ºC). An analysis of the gsn 5' flanking region showed the presence of the DNA elements CRE, HSE, and STRE, in the promoter region and in the 5'-untranslated region. In this work we investigated the involvement of these DNA elements in gene transcription regulation under heat shock condition by performing electrophoretic mobility shift assays (EMSA) using, as probes, DNA fragments containing the regulatory elements, and crude or Heparin-Sepharose fractionated nuclear extracts prepared from mycelia collected before and after 30 min of heat shock (HS30 sample). Ours results showed the presence of nuclear proteins capable to recognize and bind to the DNA regulatory elements under heat stress. The specificity of the DNA shifts were confirmed by using 1) unlabelled DNA probes as specific competitor, 2) the gsn promoter STRE double-stranded oligonucleotide as specific competitor, 3) a mutated gsn promoter STRE probe, and 4) the HSE unlabelled probe in a cross-reaction competition assay with the gsn promoter STRE probe. The involvement of the regulatory CRE elements in the modulation of the gsn gene transcription was investigated by using EMSA in the wild type strain, and also in two N. crassa mutant strains defective in the cAMP-signaling pathway: one having hyperactive...(Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Os fungos endofíticos merecem um destaque especial devido a sua diversidade, e consequentemente ao aumento da probabilidade de descoberta de metabólitos. Este trabalho teve por objetivo isolar fungos endofíticos das folhas da Annona crassiflora, selecionar os de melhor atividade e testá-los quanto à capacidade em produzir metabólitos bioativos com atividade antimicrobiana, antioxidante e antiproliferativa. Foram isolados 192 fungos em diferentes períodos do ano, sendo a maior quantidade isolada a partir de folhas adultas. Após o isolamento foi preparado extrato de acetato de etila, e avaliada a atividade dos extratos. Para a análise da atividade antimicrobiana foram utilizados os micro-organismos Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 25922 e Candida albicans ATCC 10231, e foi obtida a atividade de 73,22% contra pelo menos um dos micro-organismos. Contra o S. aureus a atividade dos extratos foi de 45,54%, a C. albicans foi inibida por 31,25% dos extratos, e 54,46% dos extratos foram capazes de inibir a E. coli. A partir destes resultados foram selecionados os extratos fúngicos: A1F2F1, A4F14F1 e A5F18F7. A concentração inibitória mínima contra S. aureus foi de 250-500 μg/mL para o extrato A5F18F7, 500-1000 μg/mL para o extrato A4F14F1 e A1F2F1 não apresentou atividade nas concentrações testadas. O extrato A5F18F7 demonstrou capacidade bactericida na concentração de 1000 μg/mL. Nas análises de atividade antioxidantes o extrato A4F14F1 destacou frente aos demais em todos os testes e ainda obteve uma maior quantidade de compostos fenólicos totais. Os resultados de atividade antiproliferativa demonstraram resultados promissores para o extrato A4F14F1, sendo esta avaliada como potente contra linhagens de células tumorais e uma baixa atividade contra linhagens celulares não tumorais. Através da análise da composição química desses extratos não foi possível identificar compostos que pudessem ser responsáveis pelas atividades testadas, porém foi possível determinar a presença do ácido butanodióico que consiste em um composto de ampla utilização em diversas áreas. Portanto os resultados sugerem a potencialidade dos extratos, e destacam a importância do estudo dos fungos endofíticos, já eles podem ser uma fonte para várias novas substâncias com atividade de interesse farmacológico. / The endophytic fungi deserve a special mention because of its diversity, and consequently the increased probability of discovery metabolites. This study aimed to isolate endophytic fungi from the leaves of Annona crassiflora, select the best activity and test them for their ability to produce bioactive metabolites with antimicrobial activity, antioxidant and antiproliferative. Were isolated 192 fungi in different periods of the year, being the largest single amount from adult leaves. After isolation extract was prepared in ethyl acetate, and evaluated the activity of the extracts. For the analysis of the antimicrobial activity of micro-organisms Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 25922 and Candida albicans ATCC 10231 were used, and the activity of 73.22% against at least one of the micro-organisms was obtained. Against S. aureus activity of the extracts was 45.54% C. albicans was inhibited by 31.25%, and 54.46% of the extract the extracts were able to inhibit E. coli. From these results we selected the fungal extracts: A1F2F1, A4F14F1 and A5F18F7. The minimum inhibitory concentration against S. aureus was 250-500 mg / mL for the extract A5F18F7, 500-1000 mg / mL for A4F14F1 and A1F2F1 extract was inactive at the tested concentrations. The A5F18F7 extract showed bactericidal activity at 1000 mg / mL. In the analyzes of antioxidant activity extract A4F14F1 emphasized compared to other all the tests and still got a larger amount of phenolic compounds. The results of the antiproliferative activity shown promising results for A4F14F1 sample, this being evaluated as potential against tumor cells and a low activity against non-cancer cell lines. By analyzing the chemical composition of these extracts was not possible to identify compounds that could be responsible for the activities tested, but it was possible to determine the presence of butanedioic acid consisting of a compound widely used in various fields. Therefore the results suggest the potential of the extracts, and highlight the importance of the study of endophytic fungi, since they can be a source for several new substances with pharmacological activity of interest. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-06-30Bitstream added on 2014-06-13T20:30:12Z : No. of bitstreams: 1 aguiar_ap_dr_sjrp.pdf: 1787445 bytes, checksum: 8416ed8af2ff527097430030acd57c99 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A degradação da lignina ocorre através de um processo oxidativo que envolve enzimas extracelulares como as ligninases (MnP, LiP e lacase) produzidas, principalmente por fungos basidiomicetos. Os caminhos atuais da biotecnologia indicam que tais fungos denominados de fungos de degradação branca sejam eficientes na degradação de corantes sintéticos. Foram estudadas cinco linhagens de basidiomicetos quanto a produção das ligninases em de fermentação em estado sólido (FES). Todos os fungos analisados (Inonotus rickii, Dacryopinax elegans, Pycnoporus sanguineus, Chaetocalathus liliputianus e Lentinus strigellus) mostraram-se bons produtores de MnP. Nenhum dos microrganismos apresentaram níveis significantes de LiP. As espécies L. strigellus e P. sanguineus produziram quantidades consideráveis de lacase. Esses dois últimos fungos foram selecionados em função de sua capacidade de produção de MnP e lacase, e o farelo de trigo foi o melhor meio para a produção das duas enzimas. A MnP e lacase produzida tanto por L. strigellus quanto por P. sanguineus apresentaram pH ótimo ácido. A temperatura ótima para a MnP de ambos os fungos foi de 40°C. Para a lacase de L. strigellus a temperatura ótima ficou entre 50°C e 55°C, para a de P. sanguineus entre 60°C e 70°C. A MnP produzida pelos dois fungos mantiveram-se estável em toda a faixa de pH estudada. A lacase de L. strigellus apresentou estabilidade em pH 7,0 e a de P. sanguineus, 7,5. A temperatura de estabilidade para a MnP de L. strigellus ficou entre 15°C e 25°C e para a enzima de P. sanguineus entre 35°C e 45°C. Todos os corantes estudados sofreram descoloração por essas enzimas, especialmente o Laranja II (cerca de 74%), Azul Cibacron 3GA (cerca de 85%), Azul Brilhante Remazol R (cerca de 87%) e o Cristal Violeta (cerca de 65%) / Lignin degradation occurs through an oxidative process that involves extracellular enzymes such as ligninases (MnP, Lip and laccase) produced specially by basidiomycete fungi. Current biotechnological studies indicate that these fungi, known as white rot fungi , may be efficient on the degradation of synthetic dyes. Five strains of basidiomycetes were studied regarding the production of ligninases through solid state fermentation (SSF). All of the fungi tested (Inonotus rickii, Dacryopinax elegans, Pycnoporus sanguineus, Chaetocalathus liliputianus e Lentinus strigellus), proved to be good MnP producers. None of the microorganisms produced significant amounts of LiP. The species L. strigellus e P. sanguineus produced considerable amounts of laccase. These last two were selected due to their ability to produce MnP and laccase, and wheat bran was the best medium for the production of both enzymes. .MnP and laccase from L. strigellus and P. sanguineus acted optimally in acid pH. Optimum temperature for MnP activity from both fungi was 40°C. Optimum temperature for laccase from L. strigellus was between 50°C e 55°C, and from P. sanguineus was between 60°C e 70°C. MnP from both fungi maintained stability through the whole pH range studied. Laccase from L. strigellus was stable in pH 7,0 and from P. sanguineus in pH 7,5. MnP from L. strigellus remained stable in temperatures between 15°C and 25°C and from P. sanguineus between 35°C e 45°C. The enzymes were effective in the decoloration of all the dyes tested, specially Orange II (approximately 74%), Cibacron Blue 3GA (approximately 85%), Remazol Brilliant Blue R (approximately 87%) and Crystal Violet (approximately 65%)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-09-30Bitstream added on 2014-06-13T19:09:17Z : No. of bitstreams: 1 egea_tc_me_sjrp.pdf: 1427713 bytes, checksum: d8f2e425f18704f4f7828a1c94ad86de (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Para o setor industrial, o isolamento e identificação de microrganismos com habilidade em produzir biocatalisadores é de grande importância para a apresentação de novas fontes de enzimas ao mercado. O isolamento é uma das ferramentas mais utilizadas na seleção de microrganismos, proporcionando o levantamento de espécies capazes de metabolizar compostos químicos potencialmente tóxicos, sendo essenciais na biorremediação, pois atuam como medida mitigadora para os problemas decorrentes do uso irracional de agrotóxicos. Neste trabalho, foram isoladas 75 linhagens fúngicas de solo de plantação de cana de açúcar, por diferentes fontes de carbono, em diferentes épocas do cultivo e em duas áreas de coleta – solo com e sem a queima da palha – para o estudo do potencial de produção enzimática e de degradação do herbicida diuron. Dentre os isolados, encontrou-se 10 gêneros diferentes, sendo a maioria referente ao gênero Trichoderma (40%), seguido de Fusarium (15%), Cunninghamella (13%) e Aspergillus (12%). Da quantidade total de fungos isolados, 56% foram oriundos do solo de queimada e 44% do solo sem queima. Os gêneros Aspergillus, Cunninghamella, Fusarium e Trichoderma foram os gêneros encontrados em todos os meios de isolamento, como também os mais constantes, sendo os dois últimos, os únicos a serem encontrados em todas as coletas. Os isolados foram submetidos à fermentação do estado sólido, contendo bagaço de cana e farelo de trigo como substratos, para estudo da produção de xilanase, CMCase e lacase. A atividade das enzimas pelos isolados fermentados foi bastante variada, com produção de xilanase atingindo valores máximos de 64,0 U/mL (Aspergillus) e 63,7 U/mL (Aspergillus), a produção de CMCase foi de 5,5 U/mL (Fusarium) e 4,2 U/mL (Aspergillus) e lacase de 0,50 U/mL (Verticillium) e 0,27 U/mL (Fusarium). Dos 74 isolados, 23 foram... / The isolation and identification of microorganisms with ability to produce biocatalysts is a great method for the presentation of new sources of enzymes to the industry. Isolation is one of the most used tools in the selection of microorganisms, providing a survey of species able to metabolize potentially toxic chemical compounds In this study, 75 fungal strains were isolated from soil of plant sugar cane from different carbon sources, at different times of cultivation and collecting in two areas - soil with and without straw burning - to study the enzyme activity and degradation of the herbicide diuron. Among the isolates, were found 10 different genres, mostly related to the genus Trichoderma (40%), followed by Fusarium (15%), Cunninghamella (13%) and Aspergillus (12%). Of the total isolates, 56% came from the soil of burned and 44% of the ground without burning. The genera Aspergillus, Cunninghamella, Fusarium and Trichoderma were the genera found in all media of isolation, and the last two were the only ones to be found in all samples. The isolates were subjected to solid-state fermentation, containing sugar cane bagasse and wheat bran as substrates to study the production of xylanase, CMCase and laccase. The activity of enzymes by the fungus fermentation was quite varied, with xylanase production reached maximum values of 64.0 U/mL (Aspergillus) and 63.7 U/mL (Aspergillus), the production of CMCase was 5.5 U/mL (Fusarium) and 4.2 U/mL (Aspergillus) and laccase from 0.50 U/mL (Verticillium) and 0.27 U/mL (Fusarium). Of the 74 isolates, 23 were selected for verification of the potential degradation of the herbicide diuron. All selected microorganisms showed higher degradation of the herbicide in question, and the genus Aspergillus had the most promising degradation (47.7% for peak product and 67.1 per concentration) in the period studied

Orientador: Lara Durães Sette / Banca: Maria Aparecida Marin Morales / Banca: Carlos Renato Corso / Banca: Valeria Maia de Oliveira / Banca: Vera Maria Valle Vitali / Resumo: Considerando a importância dos processos de biorremediação, o presente trabalho teve como objetivo principal avaliar o potencial de consórcios microbianos, constituídos por quatro fungos filamentosos isolados de invertebrados marinhos e duas bactérias recuperadas de reservatório de petróleo, na destoxificação de poluentes ambientais, por meio da sobrevivência do microcrustáceo Artemia sp. e da luminescência da bactéria Vibrio fischeri. Após estudos de antagonismo entre os micro-organismos, foram estruturados oito consórcios microbianos, em diferentes combinações. Os consórcios foram usados, isoladamente, para avaliar a toxicidade dos poluentes ambientais corante têxtil RBBR (Remazol Brilliant Blue R), óleo diesel e hidrocarbonetos policíclicos aromáticos. Dentre os consórcios estudados, o consórcio 3, composto por dois fungos filamentosos e pelas duas bactérias, apresentou melhores resultados de destoxificação do corante RBBR e óleo diesel, após sete dias de cultivo a 28 oC e 140 rpm. As enzimas ligninolíticas apresentaram atividade baixa ou ausente no teste feito com o corante e com o óleo diesel. Para o benzo[a]pireno (BaP), apesar de ter havido uma produção mais expressiva de enzimas ligninolíticas, os resultados de destoxificação foram incoerentes, por não apresentar toxicidade mesmo em elevadas concentrações. Sendo assim, no presente estudo o consórcio 3 foi empregado na otimização da destoxificação e descoloração do corante RBBR. Os resultados de dois planejamentos do tipo Plackett-Burman (PB1 e PB2) e um DCCR (Delineamento Composto Central Rotacional) revelaram que as melhores condições de destoxificação/descoloração foram obtidas no ensaio 11 do PB1 e no ensaio 2 do PB2. As condições de cultivo desses dois ensaios foram submetidas a experimentos de validação, porém ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico) / Abstract: Taking into account the relevance of bioremediation processes, the present work aimed to evaluate the potential of microbial consortia composed by four filamentous fungi isolated from marine invertebrates and two bacteria recovered from oil reservoirs in the detoxification of environmental pollutants, through the survival of the microcrustacean Artemia sp. and the luminescence of the bacterium Vibrio fischeri. After studies of antagonism between the microorganisms, eight microbial consortia were structured in different combinations. The consortia were tested separately against the environmental pollutants RBBR (Remazol Brilliant Blue R) textile dye, diesel oil, and polycyclic aromatic hydrocarbons. Among the consortia studied, the consortium 3, composed of two filamentous fungi and two bacteria presented better results of RBBR dye and diesel detoxification after seven days at 28 oC and 140 rpm. Ligninolytic enzymes showed low or absent activity in the experiments containing RBBR and diesel. For benzo[a]pyrene (BaP), although there was a more expressive production of ligninolytic enzymes, the results of detoxification were incoherent, since no toxicity was showed even at high concentrations. Therefore, in the present study the consortium 3 was used to optimize detoxification and discoloration of RBBR dye. Results from two Plackett-Burman designs (PB1 and PB2) and one CCD (Central Composite Design) revealed that the best conditions for detoxification/ discoloration were obtained in the assay 11 from PB1 and assay 2 from PB2. The culture conditions of this two assays were submitted to validation experiments, however only assay 2 from PB2 (4 cylinders (0.5 cm) of each fungus, and 4 mL of each bacteria (OD 0.4), 1 g/50 mL wheat bran, 100 % artificial sea water, pH 8, and 500 ppm RBBR) presented ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Resumo: O aumento na produção de corantes têxteis acarreta grandes problemas ambientais principalmente em corpos d'água, através dos resíduos formados após tingimento das fibras. Com a baixa eficiência dos métodos atualmente aplicados para a eliminação destes resíduos, a biodegradação tornou-se uma alternativa para combater este tipo de poluição. Dentre os organismos utilizados, os fungos apresentam um grande potencial por estarem naturalmente presentes em áreas degradadas e muitos deles produzirem enzimas que degradam moléculas xenobióticas. Microrganismos endofíticos vêm sendo investigados para aplicação em diferentes áreas de interesse biotecnológico. Neste trabalho, de 35 isolados de fungos endofíticos avaliados, cinco (48J, 14JA, 3HAI, 1IIG, BB1) apresentaram potencial para descoloração do corante Remazol azul. Os isolados foram obtidos a partir da planta medicinal "Espinheira-santa" (Maytenus ilicifolia) e correspondem ao gênero Pestalotiopsis. Destes, dois isolados denominados 14JA e 48J foram selecionados para estudos aprofundados por apresentarem potencial de descoloração superior a 50%. Diferentes condições nos meios de cultura foram testados utilizando a avaliação por superfície de resposta para cada um dos isolados selecionados, visando melhores resultados no processo de descoloração. Para o isolado 14JA, a melhor composição do meio foi com 5g/L de galactose como fonte de carbono, 15g/L de uréia como fonte de nitrogênio e 1mM de cobre e 5mM de manganês suplementando o meio, com pH 7,6, além dos ingredientes usuais e para o isolado 48J, 1g/L de galactose, 15g/L de tartarato de amônio em pH 6. A temperatura de incubação foi de 28°C. A atividade descorante do micélio do meio chegou a 53% para o isolado 14JA e 57% para o isolado 48J. A atividade descorante destes isolados é oriunda da ação de uma lacase, associada ao micélio. Com o objetivo de identificar os isolados utilizados em nível de espécie, foram sequenciadas as regiões ITS, ?- tubulina e EF ("Elongation Factor"). As sequências obtidas foram comparadas com o banco de dados do Genbank e os resultados obtidos para as três regiões não foram coincidentes para a identificação das espécies. Os dados de sequências ITS para este gênero são mais abundantes enquanto as sequências de EF mais raras, sendo assim, foram utilizadas principalmente os resultados das regiões ITS sequeniadas para a identificação das espécies. O isolado 48J apresentou identidade genética de 100% com Pestalotiopsis vismae, Os outros isolados, 14JA, 3HAI, 1IIG e BB1, apresentaram identidade genética entre 97 a 99% com Pestalotiopsis mangiferae. O sequenciamento das outras regiões (EF e Beta-tubulina) resultou em identidade genética com outras espécies de Pestalotiopsis. Devido à complexidade taxonômica deste gênero, não foi possível concluir com certeza a que espécie estes isolados pertencem.