La presente tesis se ha centrado en la evaluación a través de diferentes aproximaciones de la implicación del gen FOXP2, gen sometido a selección positiva en el linaje humano y relacionado directamente con una alteración de uno de los rasgos más característicos de la especie humana, el lenguaje, en la vulnerabilidad a la esquizofrenia. El estudio de asociación caso-control no ha permitido establecer una implicación consistente entre las variantes estructurales analizadas (SNPs y posibles expansiones de trinucleótidos) con las alucinaciones auditivas como fenotipo alternativo a la esquizofrenia. No obstante, la participación del gen FOXP2 en la vulnerabilidad a las alucinaciones auditivas, como componente referido al lenguaje no puede descartarse por completo, ya que el SNP rs2396753 mostró una tendencia hacia la significación y el SNP rs2253478 mostró diferencias significativas para el ítem de Pobreza del Lenguaje de la Escala Manchester.El análisis de la región promotora nos ha permitido valorar que la regulación de la expresión del gen debe ser más compleja de lo que inicialmente se esperaba. El análisis evolutivo muestra que diferentes tramos de la región promotora analizada han evolucionado diferencialmente, encontrándose una región altamente conservada, que curiosamente no parece contener una elevada concentración de sitios de unión a factores de transcripción, como sería lo esperado dada su posible importancia funcional. Esta secuencia se localiza inmediatamente aguas arriba del potencial promotor extraído de las bases de datos mediante herramientas bioinformáticas. Bajo la hipótesis de su pertenencia al núcleo central del promotor, la evaluación funcional de esta región conservada indica que posiblemente contenga elementos represores de la transcripción, al menos en el tipo celular testado, esto es, células procedentes del pulmón, ya que se obtienen mayores niveles de expresión en su ausencia.Dentro de la hipótesis epigenética de la esquizofrenia se llevó a cabo un análisis de los patrones de metilación en dos fragmentos incluidos en una isla CG adyacente al primer exón, no traducido, del gen en tejidos postmorten de pacientes esquizofrénicos y controles. En primer lugar se obtuvo una clara diferencia en el grado de metilación entre el fragmento analizado localizado aguas arriba del primer exón, con ausencia de metilación respecto al localizado aguas abajo, para el que se obtuvieron patrones específicos de metilación. Comparando el grado de metilación en diferentes áreas cerebrales en pacientes con esquizofrenia y controles, se observó que en la circunvolución del parahipocampo el grado de metilación es mayor que en las otras áreas analizadas y además hay indicios de diferencias entre ambos grupos analizados en ambos hemisferios. Los análisis de expresión encaminados a determinar si el grado de de metilación estaba correlacionado con los niveles de expresión no permitieron llegar a resultados concluyentes al respecto.Otro gen de gran interés en la evolución de la especie humana es el gen HAR1A el cual se caracteriza por incluir una región con evolución acelerada en el linaje humano. Se consideró que un gen de las características del gen HAR1A podría constituir también un buen gen candidato para la esquizofrenia, por lo que se llevó un estudio caso control de las mismas características que el realizado con el gen FOXP2. El hecho de no encontrar diferencias significativas en las frecuencias genotípicas, alélicas o haplotípicas en el estudio de asociación caso-control llevado a cabo con el gen HAR1A indica que no parece estar relacionado con la vulnerabilidad a la esquizofrenia, aunque podría estar relacionado con la susceptibilidad a padecer alucinaciones auditivas dentro del contexto psicótico, al obtenerse diferencias globales en la comparación de haplotipos entre pacientes alucinadores y pacientes sin alucinaciones. / This thesis has focused in the study of FOXP2 gene, which is the first gene related to a language disorder and which has been subject to positive selection in human lineage, as candidate gene for schizophrenia through different approaches Case-control study didn't allow establishing a consistent relationship between the analyzed structural variants (SNPs and trinucleotide repetitions) and auditory hallucination as alternative phenotype for schizophrenia. Nevertheless, a role of FOXP2 in vulnerability to schizophrenia through its relationship with language cannot be ruled out since SNP rs2396753 showed a trend to significance and SNP rs2253478 showed significative differences for Poverty of Speech. Analysis of promoter region suggests regulation of the expression of the gene is more complex than it was initially expected.Evolutionary analysis of a 6Kb fragment surrounding first exon of the gene revealed different evolutionary rates in different fragments as well as some potential promoter regions. A highly conserved region was detected upstream of the annotated promoter. In order to determine if this highly conserved region should be included in the promoter core functional analyses were performed. These experiments indicated that this region probably contains repressor elements. Under the epigenetic hypothesis of the origin of schizophrenia an analysis of the methylation patterns of a CpG island adjacent to first untranslated was performed. Differences between upstream and downstream region were detected as well as differences for methylation of parahippocampal gyrus in patients and controls and between hemispheres. Quantification of mRNA levels was conducted in order to correlate methylation and expression levels of the gene, with inconclusive results.As a summary, with our results we cannot rule out a role of FOXP2 in the susceptibility to schizophrenia, although no direct evidence has been obtained.

Los linfomas cutáneos primarios de células T (LCPCT) son un grupo heterogéneo de linfomas no-Hodgkin que se caracterizan por la presencia de linfocitos atípicos en la piel. En el presente trabajo se ha analizado el perfil genético de la micosis fungoide tumoral (MFt) para conocer las alteraciones más frecuentes y su posible función como marcadores pronósticos. Por otra parte, se ha realizado un estudio paralelo para conocer el estatus de los genes del receptor de células T (TCR). Se estudiaron un total de 41 MFt, 13 síndromes de Sézarys (SS) y 6 linfomas cutáneos anaplásicos de célula grande CD30+ (LCACG-CD30+). Se aplicaron las técnicas de microarrays de hibridación genómica comparada (oligoarrayCGH) e hibridación in situ fluorescente (FISH) para los genes del TCR. El análisis de oligoarrayCGH reveló que un 78% presentaron alteraciones genéticas. Las alteraciones más frecuentes fueron las ganancias de 7q33.3q35, 17q21.1, 8q24.21, 9q34, 10p14 y 1q31.2q32.2, y las pérdidas de 9p21.3, 9q31.2, 17p13.1, 13q14.11, 6q21.3, 10p11.22, 16q23.2 y 16q24.3. El análisis de la inestabilidad genética permitió segregar a las MFt en dos grupos, uno genéticamente estable (0-5 alteraciones) y otro genéticamente inestable (>5 alteraciones). Además, se ha observado que el grupo genéticamente inestable se asociaba a la ganancia del cromosoma 7q. Finalmente, se ha observado que pertenecer al grupo genéticamente inestable así como presentar deleciones de 9p21.3, 10q26qter y ganancia en 8q24.21 se asociaba a una peor supervivencia. El análisis de los genes del TCR ha mostrado que las translocaciones de TCRAD, TCRB y TCRG no es un evento genético frecuente en los LCPCT. Sin embargo, se han observado ganancias en el número de copias de las sondas TCRB (7q34) y TCRG (7p14) en 3/6 MFt y 3/13 SS, lo que confirma los resultados previamente observados mediante las técnicas de oligoarrayCGH y citogenética convencional. De este estudio se concluye: 1. Nuestros datos confirman que la MFt presenta un perfil genético caracterizado por las ganancias de 7q, 17q, 8q, 9q, 10p y 1q, y las pérdidas de 9p, 9q, 17p, 13q, 6q, 10p y 16q. 2. Las alteraciones estructurales de los loci del TCR no son una característica genética de los LCPCT. Sin embargo, no se excluye su papel patogénico en los LCPCT. 3. Se ha definido el perfil de inestabilidad genético de la MFt y se ha observado la presencia de dos grupos, un grupo estable y otro inestable. Además, se ha observado una asociación significativa de la ganancia del cromosoma 7q con el perfil genéticamente inestable, lo que sugiere un importante papel patogénico de esta región en este subgrupo de MFt. 4. Respecto a los marcadores pronóstico, las pérdidas de 9p21.3 y 10q26qter, y la ganancia de 8q24.21, así como pertenecer al grupo genéticamente inestable se han asociado a un pronóstico desfavorable. Por otra parte, la edad superior a los 60 años en el momento del diagnóstico y el hecho de presentar lesiones cutáneas en más de dos localizaciones también se han asociado a una peor supervivencia. 5. Se ha observado que las MFt que presentaban infiltración en sangre periférica, presentaban alteraciones similares a las halladas en el SS en estudios previos lo que sugiere la existencia de una firma genética común para los SS de novo y los SS con una MF previa. Con respecto a los LCACG-CD30+, se confirma que ambas entidades son diferentes, no sólo en sus características clínicas sino también en sus perfiles genéticos. / Primary cutaneous T cells lymphomas (CTCL) are a heterogeneous group of non-Hodgkin lymphomas characterized by the presence of atypical lymphocytes in the skin. This work analyzed exhaustively the genomic profile of the tumoral stage mycosis fungoides (MFt) to find the most frequent alterations and their possible role as prognostic markers, as well as, to compare MFt genetic profile with other CTCL (specifically, Sézary syndrome [SS] and cutaneous anaplastic large cell lymphoma-CD30+ [cALCL-CD30+]). Moreover, there has been a parallel study to know the status of the genes of T cell receptor (TCR). We studied a total of 41 MFt, 13 SS and 6 cALCL-CD30+ using oligonucleotide array comparative genomic hybridization (oligoarrayCGH) and fluorescence in situ hybridization (FISH) techniques. Among the 41 MFt, 78% had genetic alterations. The most frequent alterations were gains of 7q33.3q35, 17q21.1, 8q24.21, 9q34, 10p14 and 1q31.2q32.2, and losses of 9p21.3, 9q31.2, 17p13.1, 13q14.11, 6q21.3, 10p11.22, 16q23.2 and 16q24.3. We also performed a genetic instability analysis and it has been observed that MFt segregate into two groups, a genetically stable (0-5 changes) and a genetically unstable (> 5 changes). It has also been observed that genetically unstable group was related to the presence of the gain of 7q. Regarding prognostic markers, deletion of 9p21.3, 10q26qter and 8q24.21 gain and to belong to the genetically unstable group was associated with a poor overall survival. On the other hand, TCR genes analyses showed that TCRAD, TCRB and TCRG translocations are not a frequent event in CTCL. However, we have observed extra signal FISH copies of TCRB (7q34) and TCRG (7p14) probes in 3/6 MFt and 3/13 SS, confirming our results previously observed by conventional cytogenetics and oligoarrayCGH techniques. This study concludes: 1. Our results confirm a MFt genomic profile characterized by gains of 7q, 17q, 8q, 9q, 10p y 1q, and losses of 9p, 9q, 17p, 13q, 6q, 10p y 16q regions. 2. TCR loci structural alterations are not a genetic characteristic of CTCLs. 3. We have defined the genomic instability of MFT and we observed the presence of two distinct groups: one called genetically stable and a second group called genetically unstable, characterized by the presence of numerous genetic changes. It has also observed a significant association of chromosome 7q gain with the genetically unstable group, suggesting an important pathogenic role of this region in this subset of MFT. 4. We have observed that losses of 9p21.3 and 10q26qter regions and the gain of the 8q24.21 region as well as belonging to the genetically unstable group have been associated with a poor prognosis. With regard to clinical characteristics, age over 60 years at diagnosis and presenting skin lesions in more than two locations have also been associated with poorer survival. 5. The comparison between MFt and SS genomic profiles has shown that MFt patients with peripheral blood involvement showed similar changes to those found in the SS in previous studies. These findings suggest the existence of a common genetic signature for de novo SS and SS with a previous MF. Regarding cALCL-CD30+, we confirmed that both entities are different not only in its clinical features but also on their genetic profiles.

Se ha propuesto que el cromosoma X tiene una tasa de fijación de reordenaciones cromosómicas subdominantes superior a la de los autosomas y algunos datos empíricos parecen concordar con esta predicción. Para contrastar esta hipótesis en el género Drosophila se han construido mapas físicos de los cromosomas X, 3 y 4 de las especies D. repleta y D. buzzatti (homólogos a los cromosomas X, 2L y 3L de D. melanogaster). La técnica utilizada para la obtención de estos mapas ha sido la hibridación in situ de un total de 218 marcadores (clones génicos, cósmidos y fagos P1) procedentes de la especie D. melanogaster. Las especies D. repleta y D. buzzatii pertenecen al grupo repleta del subgénero Drosophila y divergieron de D. melanogaster (subgénero Sophophora) hace 40-62 millones de años. En el caso del cromosoma 3 se analizó la organización molecular de la región de 1,944 Mb que rodea al locus Adh en la especie D. melanogaster. Para los cromosomas X y 4 se obtuvieron mapas físicos de todo el cromosoma con una densidad promedio de marcadores de uno cada 333 kb y uno cada 342 kb respectivamente. La comparación de los mapas físicos de las especies D. melanogaster y D. repleta nos permite estimar el número de inversiones fijadas durante la divergencia de estas dos especies. Los resultados también han sido comparados con los obtenidos previamente para el cromosoma 2 en estas mismas especies. Esta comparación muestra que hay diferencias de hasta cuatro veces en la tasa evolutiva entre cromosomas siendo el cromosoma X el que tiene una tasa más elevada. En conjunto se estima que el numero de inversiones paracéntricas fijadas entre estas dos especies es de 393 y la tasa promedio de disrupciones por Mb y por millón de años es de 0,053. Este resultado corrobora la elevada tasa de reordenaciones observada en el género Drosophila.La comparación de los mapas físicos obtenidos para las especies D. repleta y D. buzzatii indica que los puntos de rotura de las inversiones Xb y Xc fijadas entre estas dos especies han sido mal asignados. De acuerdo a los resultados obtenidos en el presente trabajo estas dos inversiones no estarían dispuestas en tándem sino que serían inversiones solapantes. / It has been proposed that the fixation rate of underdominant chromosomal rearrangements should be higher for the X chromosome than for autosomes and some empirical data agree with this prediction. To check this hypothesis in the Drosophila genus physical maps of the D. repleta and D. buzzatii X, 3 and 4 chromosomes (homologous to chromosomes X, 2L and 3L of D. melanogaster) have been constructed. In situ hybridization of 218 markers from D. melanogaster (gene clones, cosmids and P1s) was used to construct the maps. D. repleta and D. buzzatii belong to the repleta group of the Drosophila subgenus and diverged from D. melanogaster (Sophophora subgenus) 40-62 million years ago. The molecular organization of a 1,944 region of Drosophila melanogaster around the Adh locus was analyzed, whereas for chromosomes X and 4 physical maps of the whole chromosomes were obtained. The markers density in these two chromosomes is one marker per 333 kb for chromosome X and one marker per 342 kb in chromosome 4.The comparison of the physical maps of D. melanogaster and D. repleta allowed us to estimate the number of inversions fixed during the divergence of these two species. The results have also been compared to those previously obtained for chromosome 2. Four-fold differences in the number of inversions between chromosomes were found with chromosome X exhibiting the highest rate of rearrangement. Combining all results, we estimated that 393 paracentric inversions have been fixed in the whole genome since the divergence between D. repleta and D. melanogaster. This amounts to an average rate of 0.053 disruptions per Mb per million year, corroborating the high rate of rearrangement in the genus Drosophila. The chromosomal maps of D. repleta and D. buzzatii have also been compared showing that the breakpoints of inversions Xb and Xc have not been correctly assigned. According to our data these two inversions previously considered as in tandem, are overlapping inversions.

Una simple mutació en el gen K-Ras comporta transformació cel·lular. Les cèl·lules tenen pocs punts de transició que puguin determinar d'aquesta manera tan important el comportament cel·lular. Fins al punt que hi ha diferències entre diferents mutacions puntuals del mateix gen. Així va quedar demostrat que el creixement dels tumors subcutanis de NIH3T3 amb mutació en el codó 13 ( G:T - A:T/ Gly-Asp ASP13) tenen un període de latència més llarg però creixen més ràpid que els tumors NIH3T3 amb K-Ras mutat en el codó 12 (G:T - A:T/ Gly-Cys CYS12). En front a aquests resultats postulem que les mateixes mutacions puntuals en el gen K-Ras que determinen diferents fenotips de cèl·lules tumorals poden determinar diferències angiogèniques en els tumors que desenvolupen. Els marcatges específics amb anticossos de PECAM, desmina, α-Actina de la musculatura llisa i macròfags assenyalen que els tumors amb CYS12 tenen major densitat de vasos sanguinis però hem trobat diàmetres més grossos i més cèl·lules desmina positives al voltant dels vasos sanguinis dels tumors ASP13. La proliferació endotelial no ens aporta diferències entre els diferents tipus de tumors en un moment de creixement tumoral ja consolidat. Han estat analitzats els nivells de VEGF i els tumors amb mutació ASP13 expressen més aquest factor de creixement endotelial que no els tumors amb mutació CYS12. El fet de que in vitro també es denotin aquestes diferències ens remarca que la diferència mutacional en Ras és determinant. La presència d'altres cèl·lules de suport que hem descrit en els tumors ASP13 podria remarcar aquesta diferència però no de manera exclusiva. El VEGF que estan produint aquestes cèl·lules actua sobre les cèl·lules endotelials. Podem descartar l'efecte autocrí ja que no hem observat expressió ni estimulació del VEGFR2 in vitro. L'angiogènesi depent de la balança entre els factors pro i anti angiogènics. TSP-1, Ang 4 (precursor) i Ang-1 han estat analitzats en aquest sistema per Western Blot. L'expressió de TSP-1 en el sistema in vivo ha estat indetectable. En el cas de les angiopoietines observem una tendència dels tumors CYS12 acumular-ne més que els ASP13, però els resultats del Western Blot han estat molt heterogenis. L'absència de TSP-1 dóna força a les accions del VEGF en els tumors ASP13. Sembla que les angiopoietines podrien tenir un paper en el sitema angiogènic dels tumors CYS12. L'expressió de les MMPs ha estat analitzada per zimografia i Western Blot. In vitro no s'ha detectat expressió de MMP9 ni MMP7, d'aquesta manera queda palès que l'expressió d'aquestes metaloproteïnases la realitzen majoritàriament les cèl·lules acompanyants al tumor. Ja està descrit que els macròfags són grans productors de MMP9 i MMP7 i també que la seva expressió pot estar estimulada per citoquines, factors de creixement com el VEGF i molt induïda per l'hipòxia dels macròfags. Es relaciona aquestes dues MMPs amb proliferació i invasió cel·lular, promoció de l'apoptosi i alliberació de factors angiogènics entre altres possibles accions. Per tan afecten el fenotip vascular que hem descrit en els tumors ASP13. Els tumors amb mutació CYS12 incrementen la MMP2 activa respecte dels tumors ASP13 mentre que aquests segons tenen major expressió de TIMP-2 i MMP14 que els primers. La funció de promoure la migració endotelial que se li atribueix a la MMP2 podria explicar-nos la dispersió de les cèl·lules endotelials i el major número de vasos que observem en els tumors CYS12. TIMP-2 i MMP14 amb la capacitat de moderar la proliferació endotelial i d'estimular la tumoral respectivament poden contribuir a definir el fenotip angiogènic i tumoral dels tumors ASP13. Hem començat a traslladar aquests resultats en una sèrie de tumors colorectals humans on coneixem les mutacions en el gen K-Ras i disposem d'un seguiment clínic de més de 4 anys. No hem trobat diferències en la densitat vascular però si una tendència a expressar VEGFR2 en els tumors amb mutació en el gen K-Ras que comporta menys supervivència global. Aquests resultats confirmen que hi ha diferències angiogèniques entre diferents mutacions del gen K-Ras. Sembla que el VEGF, les metaloproteïnases i les cèl·lules de suport tumorals convergeixen a promoure aquestes diferències. En els tumors humans caldrà tenir més paràmetres per determinar si existeixen diferències.

Plant growth and productivity are compromised by environmental stresses such as pathogens, extreme temperatures, drought and high salinity. Being sessile organisms, plants had to develop different physiologic and biochemical strategies to cope with these potential harmful situations. Drought in particular is one of the major environmental stresses that plants are forced to endure during their life cycle. The adaptation to water deficit is controlled by a cascade of molecular networks that start with the perception of water shortage which leads to increases in the ABA levels. Even though the ABA signalling model is well described for Arabidopsis, little is known for other plant species. With this thesis we proposed to increase the knowledge of maize response to drought, focusing on a maize kinase of the SnRK2 family ‐ ZmSnRK2.8/ZmOST1 ‐ which is highly homologous to the Arabidopsis OST1. We divided our work on three chapters, namely the biochemical characterization of ZmOST1, the functional characterization of ZmOST1 and the study of ZmOST1 regulation. 1) ZmOST1 biochemical characterization With Chapter 1 we characterized ZmOST1 at the biochemical level, making parallels with the Arabidopsis system whenever pertinent. We found a very close biochemical relationship between the maize and Arabidopsis kinases that suggests a conserved mechanism of plant responses to ABA and drought stress and point to the potential use of this kinase in improvement programs of drought tolerance in crops. 2) ZmOST1 functional characterization With Chapter 2 we described ZmOST1 as a functional kinase that is activated by different osmotic stresses and that is able to complement the Arabidopsis ost1‐2 mutant with effects on stomata closure. We also present a transcription factor of the NAC superfamily (ZmSNAC1) as a novel cognate substrate of ZmOST1. Under abiotic stresses ZmOST1 is capable of phosphorylating this transcription factor with further implications on stomata regulation. 3) ZmOST1 regulation With the results presented in Chapter 3 a larger picture of ABA signalling appears that implicates new partners on ZmOST1 regulation, specifically the CK2 kinase and the proteasome degradation. Ample evidence is shown suggesting CK2 phosphorylation is implicated in ABA signalling by affecting ZmOST1 localization, protein levels, protein degradation and interaction with PP2C phosphatases. At the plant level, overexpressing ZmOST1 mutagenized on the CK2 loci of phosphorylation grants several potential beneficial traits that could prove important for crop biotechnology, such as higher protein levels, better protein stability, enhanced phosphorylation activity and better stomata regulation. Working model: Taken the results presented in this thesis together, we propose a change in the current ABA signalling model. First we believe that there is an important role for CK2 in ABA sensing and SnRK2 activation that could affect the binding of the kinase to the PP2C phosphatises and regulate SnRK2 through degradation. Second, we propose that, apart from the always off and transiently fast on/off modes of SnRK2 activity, there is a third always on mechanism in which the kinase is fully detached from the phosphatase. / La sequía es actualmente el factor abiótico más limitante para el crecimiento de las plantas y se está agravando con los actuales cambios climáticos, aumento de población y reducción de las reservas de agua. Se estima que en el 2050 el 50% de las tierras cultivadas tengan problemas de salinidad o sequía. Por ello, la intensificación de la agricultura y el desarrollo de la mejora biotecnológica de adaptación al estrés son áreas que tienen que reforzarse. En esta tesis se pretende ampliar los conocimientos sobre la respuesta del maíz a la sequía haciendo un estudio profundizado de una quinasa de tipo SnRK2, designada ZmOST1 que está implicada en la respuesta de las plantas al déficit hídrico. - Capítulo 1: Caracterización bioquímica de la quinasa de maíz ZmOST1 en que se establece que ZmOST1 se localiza en el núcleo y citoplasma, se activa por ABA, es capaz de autofosforilar su centro activo y directamente interacciona con una fosfatasa ZmPP2C a través de su dominio regulador. - Capítulo 2: Caracterización fisiológica de ZmOST1. Se determinan los niveles de expresión y de actividad de la quinasa en diferentes tratamientos y estadios de desarrollo; se establece que ZmOST1 es capaz de recuperar el fenotipo de cierre estomático en mutantes OST1 de Arabidopsis; y se identifica un factor de transcripción que se caracteriza como un nuevo substrato de esta quinasa. - Capítulo 3: Se describe una nueva ruta de regulación de ZmOST1 en que esta quinasa es fosforilada por la CK2 (casein kinase 2) en el dominio regulador. Mutagenizando los residuos diana de la CK2 en la ZmOST1 lleva a una mayor acumulación, una menor degradación por el proteasoma y una hipersensibilidad a ABA.

Hace mucho tiempo que se conoce la existencia en Escherichia coli de un sistema multigénico que responde a las lesiones en el DNA. Este sistema, conocido como sistema SOS no es exclusivo de esta especie bacteriana. Se han descrito sistemas similares no solamente en muchas otras especies de bacterias gramnegativas sino que también en especies grampositivas, siendo Bacillus subtilis el referente en estas últimas.El objetivo de esta tesis ha sido ahondar en el conocimiento de la regulación del sistema SOS dentro del grupo a de las Proteobacterias. Para conseguir nuestro objetivo hemos estudiado la regulación de los genes recA y uvrA de Paracoccus denitrificans y Rhodobacter capsulatus.En primera instancia procedimos a aislar, secuenciar y caracterizar el gen recA de P. denitrificans, gracias a una sonda derivada del gen recA de Rhodobacter sphaeroides. Posteriormente obtuvimos una cepa RecA- de P. denitrificans. También aislamos y secuenciamos la región operadora y el extremo 5' de la región codificante del gen uvrA de P. denitrificans, mediante hibridación con un fragmento interior del gen uvrA de R. sphaeroides. Para asegurarnos de que el gen uvrA de P. denitrificans formaba parte del sistema SOS de dicho microorganismo comprobamos su capacidad de inducción frente a lesiones en el DNA.El estudio de las regiones operadoras de los genes recA y uvrA, tanto in vitro mediante análisis de movilidad electroforética, como in vivo mediante el análisis de la inducción de fusiones con el gen lacZ de E. coli, nos ha permitido identificar el motivo GTTCN7GTTC como la caja SOS de P. denitrificans. La presencia de este motivo es necesaria para la unión de un represor, análogo al LexA de E. coli.Así mismo, y dado que el gen recA de R. capsulatus ya había sido secuenciado en nuestro laboratorio con anterioridad, nos centramos en el aislamiento y secuenciación del gen uvrA de esta especie bacteriana mediante una sonda obtenida a partir del gen uvrA de R. sphaeroides. Una vez dispusimos de la secuencia operadora y del extremo 5' de la región codificante de este comprobamos su inducibilidad frente a lesiones en el DNA.El estudio in vivo de la región operadora de estos dos genes pertenecientes al sistema SOS de R. capsulatus se llevó a cabo mediante fusiones con el gen lacZ de E. coli. En este caso también se comprobó que la caja SOS de R. capsulatus responde al motivo GTTCN7GTTC.Los resultados obtenidos en este trabajo así como los estudios previos realizados en nuestro laboratorio sobre el sistema SOS de R. sphaeroides y de la familia Rhizobiaceae nos permiten afirmar que el motivo GTTCYYYTTTTGTTC es la secuencia consenso para la caja SOS del grupo a de las Proteobacterias. Este es el primer caso en el que se describe una caja SOS cuya secuencia no es palindrómica.Los siguientes artículos describen y discuten los resultados en los cuales está basado este trabajo. En el texto se identifican con números romanos.I. Fernández de Henestrosa, A. R., del Rey, A., Tarragó, R. y Barbé, J. 1997. Cloning and characterization of the recA gene of Paracoccus denitrificans and construction of a recA-deficient mutant. FEMS Microbiol. Lett. 147: 209-213.II. del Rey, A., Diestra, J., Fernández de Henestrosa, A. R. y Barbé , J. 1999. Determination of the Paracoccus denitrificans SOS box. Microbiology 145: 577-584.III. Labazi, M., del Rey, A., Fernández de Henestrosa; A. R. y Barbé, J. 1999. Consensus sequence for the Rhodospirillaceae SOS operators. FEMS Microbiol. Lett. 171: 37-42. / In Escherichia coli, a multigenic system induced by DNA damage is well known. This system is called the SOS system. Similar systems have been reported in other bacteria, either Gramnegative and Grampositive (specially well studied in the case of B. Subtilis).This thesis tries to deep the knowledge of the regulation of the SOS system in the a-Subclass of the Proteobacteria. We have studied the regulation of the recA end uvrA genes of Paracoccus denitrificans and Rhodobacter capsulatus.First of all we have cloned, sequenced and characterised the recA gene of P. denitrificans, using a labelled probe containing the recA gene of Rhodobacter sphaeroides. After that, we constructed a recA-deficient mutant P. denitrificans strain. We also isolated and got sequenced the 5' end coding region and the promoter of the uvrA gene of P. denitrificans, probing a P. denitrificans genebank with an internal fragment of the R. sphaeroides uvrA gene. To be sure that the P. denitrificans uvrA gene was a member of the P. denitrificans SOS system, we studied its capacity to be induced by DNA damage.The study of the recA and uvrA genes promoter region in vitro, with the electrophoretic mobility, and in vivo, with fusions between both promoters and E. coli lacZ gene, has allowed us to identify the motive GTTCN7GTTC. This motive is necessary for the binding of the repressor, similar to the E. coli LexA protein.The recA gene of R. capsulatus have been previously sequenced in our laboratory. We isolated the uvrA gene of this microorganism with a R. sphaeroides uvrA gene labelled probe. We got the 5' ending region and the promoter. We proved that the uvrA gene from R. capsulatus was DNA-damage-inducible.The in vivo studies of the promoter region of this two genes from the SOS system of R. capsulatus was carried out with fusions with the E. coli lacZ gene. We proved that the GTTCN7GTTC was also the R. capsulatus SOS box.In our laboratory, other members of the a-Subclass of the Proteobacteria have been studied. This works allowed us to define the GTTCYYYTTTTGTTC as the consensus sequence for the a-Subclass of the Proteobacteria SOS box. Is the first SOS box described that is a direct repeat and not a palindrome.

El present treball de tesi es basa en l'estudi citogenètic de les gammapaties monoclonals. Les gammapaties monoclonals representen un grup de diverses patologies caracteritzades per un augment de la proliferació, maligne o no, d'un clon de cèl.lules plasmàtiques. S'han estudiat 53 pacients afectes de gammapatia monoclonal de significat incert (GMSI), 54 pacients amb mieloma múltiple (MM) i 7 pacients amb leucèmia de cèl.lules plasmàtiques. S'han aplicat les següents tècniques: la citogenètica convencional, el mètode MAC, la hibridació in situ fluorescent (FISH) i la tècnica de May-Grünwald Giemsa-FISH (FISH).S'han presentat els resultats de tres articles:-"The contribution of cytogenetics and in situ hybridization in the study of monoclonal gammopathies of undetermined significance" Cancer Genetics and Cytogenetics 132: 25-29, 2002. -"Cytogenetic and FISH studies in 60 patients with multiple myeloma and plasma cell leukaemia" Cancer Genetics and Cytogenetics 148: 71-76, 2004.-"Cytogenetic and fluorescence in situ hybridisation (FISH) studies in four cases of plasma cell leukaemia (PCL)" Cancer Genetics and Cytogenetics 121: 163-166, 2000.I un annex de tres articles més:-"May-Grünwald-Giemsa- Fluorescence in situ hybridization (MGG-FISH) technique applied to a plasma cell leukemia" Haematologica 84 (6): 568-569, 1999.-"A new case of Turner syndrome associated with multiple myeloma" Cancer Genetics and Cytogenetics 171(1): 80-81, 2000.-"Técnicas de hibridación in situ (HIS). Fundamento y aplicaciones en neoplasias hematológicas" Sangre 44 (4): 261-267, 1999.Les conclusions que es van obtenir van ser les següents:1. Els estudis citogenètics en GMSI no són informatius degut a que la cèl.lula que entra en divisió no és la cèl.lula plasmàtica. La FISH sobre el total de cèl.lules de moll d'os és fiable i permet detectar alteracions encara que possiblement enmascara alguns pacients amb aneuploidies.2. Els pacients amb GMSI tipus IgA s'associen de forma estadísticament significativa a la presència d'una monosomia 18.3. La citogenètica convencional en MM només detecta alteracions en un 50% dels casos. Les alteracions més freqüents són les alteracions al cromosoma 1, reordenaments a 14q32 i la monosomia 13.4. L'associació entre monosomia 18 i IgA no s'ha confirmat.5. El 100% dels pacients amb LCP presenten alteracions citogenètiques, freqüentment amb hipodiploidia i monosomia 13.6. La técnica MGG-FISH permet determinar en quina cèl.lula es troba l'alteració citogenética. / The present study is based in the cytogenetic study of monoclonal gammopathies. Monoclonal gammopathies are characterized by the presence of a clone of plasma cells in the bone marrow.Samples were collected from 53 patients with monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS), 54 patients with multiple myeloma (MM) and 7 patients with plasma cell leukemia.We applied the following techniques: conventional cytogenetics, the MAC method, fluorescence in situ hybridization (FISH) and May-Grünwald-Giemsa-FISH (MGG-FISH) technique.Results were published three papers:-"The contribution of cytogenetics and in situ hybridization in the study of monoclonal gammopathies of undetermined significance" Cancer Genetics and Cytogenetics 132: 25-29, 2002. -"Cytogenetic and FISH studies in 60 patients with multiple myeloma and plasma cell leukaemia" Cancer Genetics and Cytogenetics 148: 71-76, 2004.-"Cytogenetic and fluorescence in situ hybridisation (FISH) studies in four cases of plasma cell leukaemia (PCL)" Cancer Genetics and Cytogenetics 121: 163-166, 2000.And another three papers were included in an annex:-"May-Grünwald-Giemsa- Fluorescence in situ hybridization (MGG-FISH) technique applied to a plasma cell leukemia" Haematologica 84 (6): 568-569, 1999.-"A new case of Turner syndrome associated with multiple myeloma" Cancer Genetics and Cytogenetics 171(1): 80-81, 2000.-"Técnicas de hibridación in situ (HIS). Fundamento y aplicaciones en neoplasias hematológicas" Sangre 44 (4): 261-267, 1999.Conclusions were:1. Cytogenetic studies in MGUS are not informative because the cell that we studied is not the plasma cell. FISH applied in the totality of the bone marrow cells is trust worthy but probably, in some of our cases, the aneuploid plasma cells cannot be detected because their low percentage.2. Patients with MGUS and IgA type are associated with the presence of monosomy 18.3. Conventional cytogenetics in MM can detect abnormal karyotypes in 50% of cases. The more frequent abnormalities are rearrangements in chromosome 1 and 14q32 and monosomy 13.4. The association of monosomy 18 and IgA was not observed in our series of MM.5. The 100% of patients with PCL presented cytogenetic abnormalities, frequently hypodiploidy and monosomy 13.6. The MGG-FISH technique permits to determine which cell presents the cytogenetic abnormality.

El concepte de síndromes mieloproliferatives cròniques (SMPC) engloba un conjunt d'entitats hematològiques amb característiques clíniques i evolutives molt similars i d'etiopatogènia probablement comú. Es tracta de processos caracteritzats per l'expansió clonal d'una cèl·lula mare (stem cell) pluripotent, que dóna com a resultat una hipercel·lularitat medul·lar amb predomini d'una o més línies que arriben a diferenciar-se en elements madurs. Totes les SMPC es troben subjectes a evolució clonal però en un grau força variable: un 90% d'evolució a leucèmia aguda en la leucèmia mieloide crònica front un 1-2% a la trombocitèmia essencial. Les SMPC clàssiques comprenen quatre entitats: la leucèmia mieloide crònica (LMC), la mielofibrosi idiopàtica (MI), la policitèmia vera (PV) i la trombocitèmia essencial (TE). Aquesta tesi pretén caracteritzar biologicament millor la PV i la TE.La PV és el resultat de la proliferació anormal d'una cèl·lula mare pluripotent, que dóna lloc a una hemopoesi clonal d'hematies, granulòcits i plaquetes, amb predomini d'hiperplàsia eritroide sobre la resta de línies hemopoètiques. La TE és una SMPC caracteritzada per un increment persistent de la xifra de plaquetes i per una hiperplàsia megacariocítica en la medul·la òssia.Un dels criteris diagnòstics majors de la PV i majoria dels criteris diagnòstics de la TE són criteris d'exclusió. Aquest fet fa que constantment s'estiguin buscant nous biomarcadors que ajudin al diagnòstics d'aquestes patologies. Les tècniques que s'han utilitzat en aquestes tesi amb aquest propòsit han sigut:1. Citogenètica convencional: - PV: Al moment del diagnòstic entre el 13-18% dels pacients presenten un cariotip alterat mitjançant tècniques de citogenètica convencional. Les alteracions més freqüents són: del(20q) (25%), trisomia 8 (16%), trisomia 9 (16%) (tampoc era rar trobar les dues trisomies 8 i 9 juntes en el mateix pacient), duplicacions de bandes inespecífiques d'1q o trisomies d'1q (10%), seguit per del(13q), del(11q), del(7q), del(5q) i trisomia 21.- TE: Al moment del diagnòstic entre el 5% i 10% dels casos presenten alteracions cromosòmiques. Entre les alteracions citogenètiques més descrites en la TE trobem les delecions dels braços llargs dels cromosomes 20 (del(20q)) i 13 (del(13q)) i les trisomies 8 i 9. 2. Hibridació in situ fluorescent:- PV: El percentatge de pacients amb alteracions cromosòmiques que es detecten mitjançant la tècnica de FISH varia entre 14.3% i 71.5% en funció de cada sèrie.- TE: El percentatge de pacients amb alteracions cromosòmiques que es detecten mitjançant la tècnica de FISH varia entre 15% i 55% en funció de cada sèrie.3. Estudi de clonalitat mitjançant el gen HUMARA:- PV: El percentatge de clonalitat entre les pacients afectes de PV oscil·la entre el 41% i el 73%.- TE: El percentatge de clonalitat entre les pacients afectes de TE oscil·la entre el 18.7% i el 68%.La tècnica més útil com a nou biomarcador ha estat l'estudi de clonalitat mitjançant el gen HUMARA. Ara bé, la recerca constant de possibles biomarcadors (ex. PRV-1, JAK2...) poden superar la eficacia d'aquesta tècnica. / Essential thrombocythemia (ET) and polycythemia vera (PV) are chronic myeloproliferative disorders (MPD) arising from the clonal expansion of a pluripotential stem cell. Specific genetic lesions have not been recognized for both disorders, so, diagnostic criteria still are based on the presence or absence of particular clinical and laboratory features In recent years, there have been attempts to find new positive criteria that could help in the diagnosis of ET and PV, such as spontaneous in vitro colony formation of erythroid and megakaryocytic progenitors, conventional cytogenetics, fluorescence in situ hybridization techniques and analysis of X-chromosome inactivation patterns (XCIPs). This thesis wants to better characterize PV and ET. For this propose it has been used the following methodologies:1. Conventional Cytogenetics:- PV: At diagnosis between 13-18% of patients has an abnormal karyotype with conventional cytogenetics methodologies. The most frequent abnormalities are del(20q) (25%), trisomy 8 (16%), trisomy 9 (16%) (we can also find both alterations together in the same patient), duplications of unspecific bands from 1q or trisomy 1q (10%), del(13q), del(11q), del(7q), del(5q) and trisomy 21.- TE: At diagnosis between 5-10% of patients has an abnormal karyotype with conventional cytogenetics methodology. The most frequent abnormalities are del(20q)), del(13q) and trisomy 8 and 9. 2. Fluorescent in situ hybridization:- PV: The percentage of patients with abnormalities detected by FISH goes from 14.3% to 71.5% depending on the series.- TE: The percentage of patients with abnormalities detected by FISH goes from 15% to 55% depending on the series. 3. Clonality study with HUMARA gene:- PV: The percentage of clonality between patients goes from 41% to 73%.- TE: The percentage of clonality between patients goes from 18.7% to 68%.The most useful technique as a biomarker has been the clonality study with the HUMARA gene. But the constant investigation of new possible biomarkers (ex. PRV-1, JAK2...) could be even more useful than this one.

Es presenta un resum dels resultats i les conclusions de cadascun dels capítols en què es divideix la tesi.1. La circumscripció i la classificació intragenèrica de Campanula és altament controvertida. Per tal de dilucidar les relacions filogenètiques de Campanula i gèneres aliats, així com explorar els processos biològics que van ocórrer durant l'evolució d'aquest gènere, s'han obtingut un total de 105 noves seqüències de la regió de DNA cloroplàstic trnL-F i 41 noves seqüències de la regió nuclear ITS de diferents espècies de Campanula i gèneres afins. El mostreig inclou les principals seccions i subgèneres de Campanula, així com gèneres propers. S'ha construït una matriu de seqüències per a cada regió afegint-hi altres disponibles a la base de dades Genebank, per tal d'analitzar les matrius independentment i de forma combinada mitjançant els mètodes de Parsimònia i Inferència Bayesiana. S'han mapat en els arbres filogenètics resultants dades per cercar patrons evolutius: nombre cromosòmic, tipus de corol.la, hàbit, tipus de dehiscència de la càpsula. Les anàlisis filogenètiques han revelat que Campanula, en la seva circumscripció actual, no és un gènere monofilètic. Aquest gènere es divideix en dos clades principals: el primer és un ampli clade format per la majoria d'espècies de Campanula incloent gèneres propers (Adenophora, Asyneuma, Azorina, Campanulastrum, Diosphaera, Edraianthus, Githopsis, Hanabusaya, Heterocodon, Legousia, Michauxia, Petromarula, Physoplexis, Phyteuma, Trachelium and Triodanis); i el segon és un clade constituït per Musschia més dos espècies de Campanula. L'ampli clade de Campanula es compòn de dos grups, un tipus Rapunculus i un tipus Campanula. Tant l'anàlisi bayesiana com la de Parsimònia indiquen que els principals caràcters morfològics utilitzats en les classificacions tals com la forma de la flor i la dehiscència de la càpsula han aparegut paral.lelament. Per explicar la convergència floral es suggereixen fortes pressions selectives per part dels pol.linitzadors. Plantegem dues propostes diferents per tal d'obtenir una classificació de Campanula que reflecteixi més acuradament l'evolució d'aquest gènere.2. En aquest estudi hem explorat l'evolució espaial i temporal (en termes d'àrees ancestrals i episodis de divergència) de les Campanulàcies en sentit estricte, i de Campanula en particular, mitjançant una aproximació bayesiana de la datació molecular i de l'ànalisi de dispersió-vicariança que té en compte la incertesa filogenètica. Per resoldre les relacions filogenètiques en els grups majors (Wahlenbergieae-Campanuleae), hem seqüenciat la regió conservada rbcL incloent tàxons dels principals llinatges de Platycodoneae i Wahlenbergieae. Les anàlisis de datació i biogeografia s'han aplicat a les noves dades del marcador rbcL i a les dades del marcador trnL-F obtingudes en l'estudi previ. Les anàlisis filogenètiques mostren que Platycodoneae és el grup germà de les Wahlenbergiae-Campanulae, les quals apareixen combinades entre sí. Els resultats suggereixen que l'oest d'Àsia i l'est de la Mediterrània han jugat un paper important com a centres de migració i diversificació del grup Campanula. La història biogeogràfica d'aquest gènere sembla que ha estat molt complexe. Les taxes de diversificació de Campanula haurien incrementat durant el període Messinià. Suggerim que els canvis climàtics i l'expansió de regions muntanyoses durant aquest període actuaren com a fortes pressions selectives que expliquen el fet que moltes espècies de Campanula estan adaptades a ambients secs, freds o alterats.3. Campanula subgènere Roucela comprèn espècies que conformen unitats evolutives difícilment delimitables morfològicament degut a la manca de caràcters estables. Per aquesta raó, el tractament taxonòmic del subgènere Roucela és molt controvertit. S'han obtingut noves seqüències nuclears i cloroplàstiques (ITS, trnG i trnL-trnF) per a construir les respectives matrius i analitzar-les independentment i de forma combinada mitjançant els mètodes de parsimònia i inferència bayesiana, per millorar els coneixements de les relacions filogenètiques d'aquest grup. S'han mapat en els arbres filogenètics els nombres cromosòmics i caràcters morfològics per tal d'esbrinar possibles patrons evolutius. Les anàlisis filogenètiques de Roucela han revelat que la circumscripció actual no és monofilètica. Campanula scutellata presenta tendències morfològiques i moleculars que suggereixen la seva pertanyença a una unitat evolutiva diferent. La resta d'espècies de Roucela conformen un grup monofilètic, tot constituïnt tres clades que no es corresponen amb els principals trets morfològics. Es suggereix una proposta taxonòmica per tal d'obtenir una circumscripció que es correspongui amb l'evolució del subgènere Roucela. / We present a synthesis of the main results and conclusions of each chapter of the thesis.1. The circumscription and intrageneric classification of Campanula is highly controversial. In order to elucidate the phylogenetic relationships of Campanula and related genera, and explore the biological processes that occurred during the evolution of this genus, we obtained 105 new sequences of the DNA chloroplastic region trnL-F and 41 new sequences of the ITS nuclear region of different species of Campanula and allied genera. An extensive sampling of the main sections and subgenera of Campanula and related genera was done. We constructed a sequence matrix for each region where we added other sequences available in Genebank. Independent and combined data from nuclear and chloroplast sequences were analyzed with Bayesian and Parsimony methods. Chromosome numbers, corolla types, habit and capsule dehiscence were mapped on the phylogenetic trees obtained to search for evolutionary patterns. The phylogenetic analyses revealed that Campanula, as currently circumscribed, is not monophyletic. This genus is divided into two main clades: a large core of Campanula species that includes related genera (Adenophora, Asyneuma, Azorina, Campanulastrum, Diosphaera, Edraianthus, Githopsis, Hanabusaya, Heterocodon, Legousia, Michauxia, Petromarula, Physoplexis, Phyteuma, Trachelium and Triodanis), and a clade constituted by Musschia plus two Campanula species. The large core of Campanula is divided into two main groups, a rapunculoid and a campanuloid group. Both Bayesian and Parsimony analyses indicate that the main morphological characters used in classifications such as flower shape and capsule dehiscence have arisen in parallel. Strong selective pressures from pollinators are suggested to explain floral convergence. We put forward two different proposals in order to accomplish a classification of Campanula that more accurately reflects the evolution of this genus.2. In this study, we explored the spatial and temporal evolution in terms of ancestral areas and divergence episodes of the Campanulaceae s. str. and Campanula alliance in particular, by applying a Bayesian approach to molecular dating and dispersal-vicariance analysis that takes into account phylogenetic uncertainty. To better resolve relationships among major groups (Wahlenbergieae-Campanuleae) and the position of some genera such as Trachelium L. with respect to Campanula, we have sequenced the rbcL-conserved region including taxa of some major lineages within Platycodoneae and Wahlenbergieae. Dating and biogeographic analyses were applied to the new rbcL data and to the trnL-F data obtained in a previous study. The phylogenetic analysis showed that Platycodoneae is the sister group of Wahlenbergiae-Campanulae, which appeared inter-graded. The results obtained suggest that Western Asia and Eastern Mediterranean seem to have played an important role as centers of migration and diversification of the Campanula core. The biogeographical history of this genus seems to be highly complex. Rates of species diversification of Campanula seem to have increased during the Messinian period. Strong selective pressures from the climate changes and the expansion of mountainous regions during this period are suggested to explain the fact that many species of Campanula are adapted to drought, cold or disturbed environments.3. Campanula subgenus Roucela includes species that constitute evolutionary units very difficult to delimit morphologically due to the lack of stable characters. Because of this, the taxonomic treatment of Roucela is highly controversial. We obtained new nuclear and chloroplast sequences (ITS, trnG and trnL-trnF) to analyze these data with Bayesian Inference and Parsimony methods to elucidate the phylogenetic relationships of Roucela, in order to ameliorate the understanding of its phylogenetic relationships. Chromosome numbers, and morphological characters were mapped on the phylogenetic trees searching for evolutionary patterns. The phylogenetic analyses revealed that Roucela, as currently circumscribed, is not monophyletic. Campanula scutellata shows morphological and molecular trends that suggest that it belongs to a different evolutionary unit. The rest of the Roucela species constitute a monophyletic group with three different lineages, which are not in consonance with the main morphological features. We suggest a taxonomic proposal in order to obtain a more natural circumscription for the subgenus Roucela.

El BPA es un compuesto que se produce y se emplea anualmente en grandes cantidades. Debido a su amplio uso en la producción de artículos empleados en alimentación, juguetes, odontología y biberones, se considera que es un compuesto al cual estamos expuestos de manera continuada. Estudios realizados en los Estados Unidos de Norte América han demostrado que el 90% de los adultos tienen valores detectables de este compuesto en sangre y orina. Las mujeres embarazadas así como los neonatos son un grupo particular de estudio ya que en ellos se duplican lo valores descritos en adultos tanto en sangre como en orina. En este sentido, es importante señalar que los productos “derivados de la gestación” (líquido amniótico, placenta y leche materna) pueden presentar valores hasta 10 veces más altos. Los efectos del BPA como disruptor hormonal se han estudiado en diferentes modelos de animales así como en cultivos de líneas celulares tanto de humanos como de animales. Sin embargo, los efectos a nivel reproductivo siguen siendo un punto de debate dentro de la comunidad científica. Se ha demostrado que el BPA produce alteraciones en la estructura y función de los ovocitos provenientes de tejido ovárico adulto pero en el caso específico de ovocitos fetales, solo existen unos pocos reportes sobre sus efectos. De hecho los estudios realizados para evaluar los efectos del BPA en ovocitos en profase I han demostrado que tanto en C. elegans como en ratón, este producto afecta el correcto desarrollo de los procesos de apareamiento, sinapsis y recombinación, con las consecuencias que, de ellos, puedan derivarse en las células germinales resultantes. En este sentido, si en animales de experimentación existe poca información, en ovocitos fetales humanos es inexistente. Las características de la gametogénesis femenina en mamíferos incluyendo al humano, en la cual el proceso reproductivo se inicia durante la vida fetal han limitado aún más su estudio. Durante este período se desarrollan diferentes procesos celulares, y sin duda la primera profase meiótica es uno de los más importantes. El correcto desarrollo de los eventos de apareamiento, sinapsis y recombinación durante la profase I permite que durante la edad reproductiva se tengan ovocitos con las características necesarias para ser aptos en el proceso reproductivo. La alteración de estos procesos se relaciona con anormalidades en la segregación, aneuploídias y en general con trastornos en la vida reproductiva de la mujer. De esta manera el objetivo de este trabajo es valorar los efectos del BPA sobre los procesos de apareamiento, sinapsis y recombinación en el ovocito fetal humano expuesto al BPA tanto a nivel citogenético como a nivel de expresión génica. De esta manera, los objetivos planteados durante el desarrollo de este trabajo de tesis doctoral han sido: Objetivo general: Determinar los efectos tóxicos del BPA en ovocitos fetales humanos cultivados in vitro. Objetivos específicos: 1. Desarrollar un modelo de cultivo in vitro que permita: • la progresión meiótica de los ovocitos fetales humanos in vitro. • la recombinación meiótica de los ovocitos fetales humanos in vitro. 2. Evaluar el efecto del BPA en ovocitos fetales humanos cultivados in vitro, con respecto a: • la progresión meiótica de los ovocitos fetales humanos in vitro. • la recombinación meiótica de los ovocitos fetales humanos in vitro. 3. Evaluar la expresión génica de los ovocitos fetales humanos in vitro en: • Ovocitos fetales humanos en cultivo no expuestos a BPA. • Ovocitos fetales humanos en cultivo expuestos a BPA.