Orientador : Solange Bento Farah / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-13T22:34:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Novais_RogerioCarlos_M.pdf: 3000966 bytes, checksum: 099c792d4519c4654b6e9a5ef35c7054 (MD5) Previous issue date: 1990 / Resumo: Neste trabalho, descrevemos o estudo molecular de uma seqüência isolada de um banco do cromossomo Y humano, denominada Y-1. A partir de hibridizações realizadas com essa seqüência pudemos verificar que esta apresenta bastante homologia com o cromossomo x e/ou autossomos, porém demonstrando algumas regiões específicas para o cromossomo Y. Com a construção de um mapa de restrição, pudemos isolar sub fragmentos a partir da seqüência original visando determinar um fragmento que se mostrasse mais específico a esse cromossomo. Com os nossos resultados, pudemos determinar que o fragmento Y-1. b1 é altamente específico a esse cromossomo Y. Além disso, com o experimento de clonagem da seqüência y.1 no plasmídio promotor-probe pKK232-8, pode-se verificar que a seqüência y.1 foi capaz de ativar a expressão da atividade gênica e é provável portanto, que esse fragmento contenha seqüências promotoras em seu interior. A partir da verificação da orientação do fragmento Y.1 no plasmídio pKK232-8 foi verificado que o sub-fragmento Y- 1.b2 é o mais provável candidato a conter essas seqüências. Devido a proximidade característica dessas seqüências a genes, é possível que com a utilização futura de técnicas de sequenciamento seja verificado a presença de um gene ou parte dele / Mestrado / Genetica / Mestre em Ciências Biológicas

Varios microsatélites inestables se caracterizan por la presencia de nucleótidos de citosinas en sus unidades de repetición; adoptan estructuras de DNA alternativas a la convencional y en algunos casos, involucran procesos de metilación. El genotipado de tripletes por PCR convencional se fundamenta en la denaturación del DNA y posterior amplificación del triplete repetido. Sin embargo, debido las estructuras alternativas que adoptan estos microsatélites, las reacciones de denaturación y amplificación son ineficientes. En este trabajo desarrollo una alternativa de diagnóstico por PCR para secuencias ricas en citosinas (metiladas y no metiladas) basada en modificación nucleotídica. Previo consentimiento se modificó el gen del retardo mental ligado al fragilidad del cromosoma X tipo 1,cuya siglas en ingles es FMR1(Fragile X Mental Retardation 1) de ocho individuos normales (cuatro mujeres y cuatro varones) empleando bisulfito de sodio, cambiando las citosinas en uracilo. Posteriormente, con el uso de bioinformática, se realizó:1) La simulación de las estructuras alternativas que adopta el microsatélite inestable contenido en la región 5’-UTR del gen. 2) Luego de la ubicación de las islas CpG, se generaron cebadores específicos que hibriden con el microsatélite modificado (Primer T) y cebadores específicos que hibriden con una secuencia modificada del gen FMR1 que contiene las islas CpG (Primer M). Finalmente, ambas secuencias fueron amplificadas por PCR convencional. La modificación del DNA fue evidenciada por espectrofotometría al uracilo, luego de tratamiento químico con bisulfito de sodio. La estructura que fue evidenciada por métodos bioinformaticos fue la estructura llamada hairpins (Horquillas). Se encontraron dos potenciales islas CpG en la región estudiada. La amplificación con los cebadores T confirmó el diseño in silico desarrollado para abordar la estructura en hairpins y el efecto que ejerce la modificación sobre este tipo de estructura. La amplificación con los cebadores M permitió detectar metilación de la primera isla CpG del gen FMR1 en el cromosoma x inactivo. En conclusión se desarrolló un método alternativo para amplificación de secuencias de microsatélite en rango normal, que contengan citosinas metiladas y no metiladas, que permite la amplificación mediante PCR. Se requieren estudios posteriores con muestras de DNA que contengan microsatélites anormalmente expandidos (metilados y no metilados) para validar su aplicación clínica diagnóstica. -- Palabras clave: metilación, modificación nucleotídica, tripletes repetidos / -- Many unstable microsatellites are characterized by presenting cytosine nucleotides in their repeat units, adopting alternative DNA structures and, in some cases, are involved in methylation processes. Triplet sequences genotyping by PCR methodology is based on DNA denaturation and amplification of the unstable microsatellite. However, due to alternative structures adopted by microsatellites, denaturation and amplification processes are inefficient. This thesis developed an alternative PCR genotyping method for cytosine rich sequences (methylated and unmethylated) based on nucleotide modification. After appropriate informed consent, the FMR1 gene from 8 healthy subjects (four male and four female) was modified with sodium bisulfite. Subsequently, using bioinformatics tools, we performed: 1) simulation of alternative structures of the unstable microsatellite in the 5’-UTR region of the gene. 2) After localization of the CpG islands, we generated specific primers which hybridize with the modified microsatellite (Primers T) and specific primers that hybridize to a new sequence of the FMR1 gene containing CpG islands (Primers M). Finally, both of these sequences were amplified by PCR. Modified DNA was obtained after chemical treatment with sodium bisulfite. Alternative structures of the sequence of the microsatellite were characterized. CpG islands of the gene, that can be methylated, were identified. Amplification confirmed expected results obtained previously by bioinformatics analysis. The T primers amplified the modified microsatellite of the FMR1 gene. The M primers amplified the modified sequence containing the CpG Island of the gene. In conclusion, we developed a potential alternative genotyping method for amplification of microsatellite sequences carrying methylated and unmethylated cytosine Further studies are needed in DNA samples from individual with abnormally expanded microsatellites both methylated and unmethylated to validate clinical application. -- Key words: methylation, nucleotide modification, triplet repeats

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Laboratório Multidisciplinar de Pesquisa em Doença de Chagas, 2008. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2009-09-28T18:12:51Z No. of bitstreams: 1 2008_PerlaFdeAraujo.pdf: 1286808 bytes, checksum: 53fc99e52ecaefa2dd3e2e8055632df8 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2011-01-04T19:09:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_PerlaFdeAraujo.pdf: 1286808 bytes, checksum: 53fc99e52ecaefa2dd3e2e8055632df8 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-01-04T19:09:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_PerlaFdeAraujo.pdf: 1286808 bytes, checksum: 53fc99e52ecaefa2dd3e2e8055632df8 (MD5) Previous issue date: 2008-07 / O presente trabalho é o primeiro relato de integração de seqüências provenientes de um protozoário para o genoma de células germinativas humanas. Neste estudo, nós documentamos a integração de minicírculos de kDNA de Trypanosoma cruzi no genoma de células germinativas e a transferência vertical dessas mutações para os descendentes. Foram analisadas amostras de esperma de 34 voluntários. Desses, 22 doadores foram agrupados em cinco famílias, cujos progenitores (F0) eram portadores da doença de Chagas. Doze amostras de esperma foram obtidas de indivíduos isolados. Foi possível observar a integração de kDNA de T. cruzi no genoma de todos os 17 chagásicos estudados. A transferência vertical apenas das seqüências de kDNA para as progênies F1 e F2 pôde ser observada em 6 descendentes de chagásicos. As análises das regiões do genoma humano que flanqueavam as seqüências de kDNA mostraram a integração de minicírculos de kDNA preferencialmente em elementos retrotransponíveis do tipo LINE-1, em 72,5% das seqüências quimeras. O encontro do mesmo locus em indivíduos chagásicos e seus descendentes é mais uma evidência mostrando a herança das mutações. Verificamos, também, que as seqüências de minicírculos de kDNA ligaram-se a outros elementos transponíveis (4%), tais como Alu, ERV e MER, e, também, em alguns genes (9%). Nos demais clones (14%), não foi possível determinar os loci de integração do kDNA no genoma devido á ausência de informação em bancos de dados. Os achados deste estudo sugerem que as mutações decorrentes da inserção do kDNA poderiam causar alterações genotípicas e fenotípicas implicadas na auto-imunidade descrita na doença de Chagas. De fato, a incorporação de DNA exógeno na célula humana nos mostra a complexidade das interações do parasito com o hospedeiro humano. A descrição de mutação, recombinação e deriva genética, alterando genótipo e fenótipo do hospedeiro, poderão sugerir a base da auto-imunidade que se associa à patogênese da doença de Chagas. / The present work shows by the first time the integration of Trypanosoma cruzi kDNA minicircle sequences into the human genome. This eukaryote-to-eukaryote lateral transfer of DNA is constantly seen in each patient harbouring the infections. The kDNA mutations are inherited by F1 and F2 progeny and undergo genetic drifts, recombination hitchhiking from primary to secondary chromosomes. We analysed 22 samples of sperm of volunteers from five families whose founders have the active infections. Independently, we further analysed haploid cells DNA from 12 individuals. The vertical transfer of kDNA minicircle sequences was detected in 17 family members. Among these there were 11 with active T. cruzi infections, showing nDNA and kDNA signatures. The remaining six F1 and F2 progenie had the kDNA signatures only. In each of these 17 individuals we showed sequences of minicircles of kDNA from T. cruzi integrated into germ line cells. The main hotspot for the kDNA integration was retrotransposons LINE-1 (72.5%). In 9% of cases the integreations entered coding regions of genes. Besides, kDNA minicircles sequences integrated nonautonomous transposable elements (4%) Alu, ERV and MER, Finally, in (14%), the kDNA mutations entered undetermined sites into the human genome. The presence of the kDNA mutations are in agreement with the findings of lateral transfer of kDNA in somatic cells of same individuals (Hecht, M.M, Thesis, University of Brasilia, 2008). Furthermore, the demonstration of kDNA mutations in haploid cells is brought here in the absence of active T. cruzi infections. Actually, the vertical inheritance could be appreciated in two marriages to which the marriages generated offsprings with kDNA mutations showing sequence alignments similar to the father. In fact, an exogenous DNA incorporation by the human cell let us to see more complex process of parasite-host`s interaction. The evolution of living creatures suggests that lateral transfer of exogenous DNA, mutations and hitchhiking, genetic drifts and social heterosis could be considered ongoin forces leading to genetic diversity and evolution.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2010-03-09T20:55:25Z No. of bitstreams: 1 Tese_Versao Final.pdf: 2558640 bytes, checksum: 5ffc716ac59120309c02bc4e5d8a643c (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-04-06T19:30:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_Versao Final.pdf: 2558640 bytes, checksum: 5ffc716ac59120309c02bc4e5d8a643c (MD5) / Made available in DSpace on 2010-04-06T19:30:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Versao Final.pdf: 2558640 bytes, checksum: 5ffc716ac59120309c02bc4e5d8a643c (MD5) Previous issue date: 2008 / Neste estudo, nós confirmamos e estendemos o conhecimento sobre a transferência de minicírculos de kDNA de Trypanosoma cruzi para o genoma humano. Foram analisadas cinco famílias cujos parentais (G0) eram portadores da doença de Chagas. Foi possível observar a integração de kDNA de T. cruzi no genoma de todos os chagásicos estudados. Concomitantemente, investigamos a transferência gênica vertical (TGV) das seqüências integradas de kDNA para as progênies G1 e G2. A TGV foi identificada em 45% dos descendentes de chagásicos. As análises das regiões do genoma humano que flanqueavam as seqüências de kDNA mostraram a integração de minicírculos de kDNA preferencialmente em retrotransposons LINE (71% dos clones). As integrações foram identificadas também em retroelementos não-autonônomos (12%), em ilha CpG (1%) e em alguns genes (4%). Nos demais clones (12%), não foi possível determinar os loci de integração do kDNA no genoma. A análise da estrutura do kDNA integrado revelou duas seqüências consensos de minicírculos que são inseridas mais freqüentemente que as outras, sugerindo que suas características estruturais possam favorecer o processo de integração. Acreditamos que micro-homologias ricas em AC, presentes nos minicírculos do T. cruzi e no genoma humano, podem mediar a integração do kDNA por recombinação homóloga. Os nossos achados sugerem remodelagem do genoma hospedeiro na região de justaposição das seqüências de minicírculos de kDNA no genoma humano. As análises in silico sugerem que o fenômeno descrito aqui pode resultar no surgimento de novas proteínas ou na alteração de expressão de genes pré-existentes. O real significado de tais mutações não fica restrito à Doença de Chagas, mas, sim, estende-se ao longo do processo da evolução, onde a fixação dessas mutações ajudaria a impulsionar um fluxo genético introdutor de complexidade crescente às espécies. / In this study we showed the transference of Trypanosoma cruzi kDNA minicircle sequences into the human genome. All founders (G0) of five families having the chronic T. cruzi infections had the kDNA integrated into retrotransposable elements. Additionally, we demonstrated the vertical gene transfer (VGT) of those kDNA mutations to their G1 e G2 progenies. Indeed, VGT was demonstrated in 45% of Chagas patients’ descendents. The analyses of the juxtaposition regions of the kDNA to the human genome revealed that the minicircle sequences integrate preferentially into retrotransposable LINE in 71% of those mutations. These mutations were also present in non-authonomous retroelements (12%), CpG island (1%) and putatively in some genes (4%). The remaining mutations (12%) were present in undetermined loci in some chromosomes. The structure of the kDNA integrated into the host genome revealed main consensus types I and II sequences, which were found in the integration sites in high ratio then other minicircles integrated in defined loci. It appears that some particular feature in those consensus sequences favor their insertion in those loci. We believe that AC-rich micro-homologies present in the T. cruzi kDNA minicircles and in the human genome could mediate the parasite DNA integration by homologous recombination mechanism. Our findings suggest that host DNA shuffling and recombination may occur at the integration site. It appears that the phenomenon of kDNA integration may alter pre-existing genes expression or they may generate chimera proteins. The true meanings of those mutations appear not to be limited to Chagas disease. We understand that the observed genetic drift of 55% of the kDNA mutation in the progeny may help to propel a robust genetic flux possibly associated with genome growth and increasing complexity of species. We propose that the fixation of those mutations appear to influence the evolution process.

Orientador: Carmen Silvia Bertuzzo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T17:46:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Parizotto_EneidaAbreu_M.pdf: 2181551 bytes, checksum: e328e2d73756eb3e85624dd438e919b8 (MD5) Previous issue date: 1996 / Mestrado / Genetica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientadores: Carmen Silvia Bertuzzo, Ilma Aparecida Paschoal / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T15:52:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Serra_HelianeGuerra_D.pdf: 6438255 bytes, checksum: f5a26f3b246cd061ab412d6654d9cd87 (MD5) Previous issue date: 1998 / Doutorado / Genetica / Doutor em Ciências Biológicas

Orientador : Iscia T. Lopes-Cendes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-01T18:03:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Facchin_Daniela_M.pdf: 13970036 bytes, checksum: ad97f904ffe393b72f0a4ec57b941290 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A síndrome de Rett (RS) é considerada um transtorno invasivo do desenvolvimento, primeiramente descrita em 1966 pelo austríaco Andreas Rett. Clinicamente é caracterizada por desenvolvimento neuropsicomotor aparentemente nonnal entre os seis e 18 meses de idade. Após este período o desenvolvimento fica estagnado, atinge um platô e posteriormente ocorre regressão motora progressiva. A prevalência da RS é ao redor de 1:1O000 a 1:22 000, no sexo feminino. Até outubro de 1999, o diagnóstico era feito somente através da aplicação de critérios clínicos, pois não havia um marcador bioquímico, citogenético ou molecular conhecido, associado à patologia. Diferentes modelos de herança foram propostos para RS a saber: mutações no DNA mitocondrial, dissomia uniparental, inativação preferencial do cromossomo X, mutações dinâmicas (repetição de tripletos) e aumento na freqüência de sítios frágeis. Recentemente, mutações no gene MECP2, localizado na região Xq28, foram identificadas em 33% a 80% de pacientes com quadro clínico clássico da RS e em pacientes outros fenótipos. o objetivo principal deste projeto foi investigar a presença de ligação genética entre marcadores de DNA localizados no cr X, incluindo a região Xq28. Para o cumprimento dos objetivos acima, contou-se com um total de 86 amostras, pertencentes a 23 famílias, das quais 25 pacientes com quadro clínico clássico de RS. Os estudos de ligação foram realizados através da genotipagem de marcadores anônimos de DNA do tipo microssatélite e a análise estatística da probabilidade de ligação calculada por métodos paramétricos, "lod score", através da utilização do programa de computador LINKAGE. Além disso, analisou-se, cuidadosamente, a segregação dos marcadores genotipados em em todas as famílias nas quais era possível estabelecer haplótipos. Obteve-se "lod scores" negativos significativos para todos os marcadores analisados, quando as famílias eram avaliadas em conjunto, sendo que extensas porções do cromossomo X foram excluídas a saber: DXS 1073 exclusão de 12 cM (compreendendo a região onde localiza-se o gene MECP2), DXS 8103 exclusão de 2 cM, DXS 8091 exclusão de 4 cM, DXS 8043 exclusão de 22 cM, DXS 1227 exclusão de 4 cM, e DXS 1192 / Abstract: Rett syndrome (RS) is a pervasive development disorder first described by Andreas Rett in 1966. It is eharaeterized by normal development during the first 6 to 18 months of age followed by developmental regression. Thereafter development sueeessively stagnates, plateaus and regresses. The estimated prevalenee is 1 in 10 000 to 22 000 females. Before oetober 1999, the diagnosis was based only on elinieal eriteria, sineethere were no bioquimie, citogenetie or moleeular marker for RS. Different models of inheritanee had been proposed for RS including uniparental disomy, skewed X inaetivation, mutations in the mitoehondrial DNA, and triplet repeat expansions. Recently, mutations in the MECP2 gene on ehromosome Xq28 have been found in 33 to 80% of patients with classieal RS and in patients with other phenotypes. The aim of the present study was to performed linkage analysis in 86 samples fiom 23 families including 25 girls with classieal RS using six mierosatellites markers on X ehromosome. Linkage studies were performed by genotyping marker using PCR and two point lod seore ealeulation using the program MLINK of the LINKAGE paekage. Lod score added for all 23 families. We have excluded a region of 12 eM around marker DXS 1073 (where the MECP2 gene is loeated), 2 eM around marker DXS 8103,4 eM around marker DXS 8091, 22 eM around marker DXS 8043, 4 eM around marker DXS 1227 and 10 eM around marker DXS 1192.No isolated families gave signifieant lod seore. However haplotype analysis of family 6 eomposed by two sisters with elassieal RS cleary show inherited of different haplotypes for five marker genotiped (Xq26 and Xqter). In eonclusion our results strengths the evidenee for genetie heterogeneity in RS, thus adding information whieh is likely to help the seareh for an alternative loeus for RS / Mestrado / Genetica Medica / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Denise Pontes Cavalcanti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T22:50:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zanchetta_LucieneMaria_M.pdf: 6427174 bytes, checksum: 7469913e878f8a18368af3f97d213e92 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: As aneuploidias constituem a principal alteração genética encontrada na espécie humana e podem envolver tanto cromossomos autossômicos quanto sexuais. As neuploidias em mosaicos são menos freqüentes do que as trissomias livres, podendo apresentar-se, do ponto de vista clínico, de forma bastante heterogênea. O mosaicismo acontece devido ao surgimento de uma segunda linhagem celular (trissômica ou dissômica) durante o período pós-zigótico. A técnica de FISH em núcleo interfásico tem sido descrita como mais sensível na detecção de mosaicismos, por prescindir do cultivo celular e por possibilitar a análise de um grande número de células de cada vez. Neste trabalho utilizou-se a citogenética convencional e a do FISH interfásico, em 3 grupos de indivíduos: 1) 10 pacientes com mosaicismo cromossômico conhecido (3 mosaicos tetraplóides-diplóides, 1 mosaico do cromossomo 15, 1 mosaico do cromossomo 14, 1 mosaico de cromossomo marcador e 4 casos de mosaicos do cromossomo 21); 2) 9 pacientes polimalformados com cariótipo normal e 3) 10 controles compostos por recémnascidos clinicamente normais. Foram utilizadas sondas centroméricas dos respectivos cromossomos envolvidos em cada mosaico específico, nos pacientes do grupo 1 e sondas centroméricas do cromossomo 16, para a pesquisa de criptomosaicismo nos pacientes do segundo grupo, bem como, para estabelecer a sensibilidadedas sondas no grupo controle. O diagnóstico de mosaicismo cromossômico foi confirmado pelo FISH interfásico, em todos os pacientes do grupo 1. As proporções de células aneuplóides apresentaram-se ora coincidentes, ora diferentes, inclusive com detecção de criptomosaicismo em fibroblastos do paciente portador de mosaicismo do cromossomo 15. Criptomosaicismodo cromossomo 16 não foi detectado em nenhum dos 10 pacientes do grupo 2. O presente estudo reforça a necessidade de estudo em mais de um tecido em casos de mosaicismo. Sugere-se também que, sempre que possível, os mosaicismos cromossômicos sejam investigados por FISH interfásico / Abstract: Chromosome aneuploidy is the most common human genetic change. Aneuploidy may involve both autosomic and sexual chromosomes. The mosaic aneuploidies occur less frequently than free trissomies. Moreover, mosaic patients may show a wide diversity of phenotipical effects of trissomy. Phenotipical changes may involve since just a few sintoms to similar clinical change observed on &ee trissomy carriers. Mosaicism arrises from the development of a viable second cellular lineage on the post-zigotic stage. The usual mosaicism classification is based on the amount of DNA that has changed which may range from a base pair to a loss of a whole chromosome. On this study we have focused on 3 working groups: 1) 10 patients with known mosaicism (3 mosaics tetraploid-diploid, 1 mosaic of the chromosome 15, 1 mosaic of chromosome 14, 1 mosaic of marker chromosome and 4 cases of mosaicim of chromosome 21); 2) 9 malformed patients with normal karyotype and 3) 10 controls composed by normal newborns. We have utilized centromeric probes of each chromosome involved in specific mosaicism of the patients from group 1 and chromosome 16 centromeric probes for the research of hidden mosaicism in the patients of the second group, as well as, to establish the probes sensibility in the control group. Mosaicism was confirmed by FISH in all patients from group 1. The proportions of aneuploid cells were similar in some cases and different in others. Chromosome 16 hidden mosaicism was not detected in group 2. The present study reinforce the need of studing different tissues in cases of mosaicism. It also suggests, whenever possible, the interfasic FISH investigation of mosaic patients / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

A atrofia muscular espinal (AME) é uma das doenças de herança autossômica recessiva mais frequentes, com uma incidência estimada de 1 em cada 10.000 nascidos vivos. A AME se caracteriza por degeneração de neurônios motores na medula espinal, causando fraqueza progressiva de membros e tronco, seguida de atrofia muscular. Os pacientes são classificados em AME tipo I, AME tipo II e AME tipo III, baseado na idade de início dos sintomas e na evolução clínica. As três formas clínicas são causadas por alterações no gene de sobrevivência do neurônio motor (SMN1), que apresenta uma cópia homóloga (SMN2). Em torno de 95% dos pacientes com AME são homozigotos para ausência do exon 7 do gene SMN1, devido a uma deleção desse gene ou à uma conversão para SMN2. A ausência de SMN2 não tem consequências clínicas e é encontrada em aproximadamente 5% dos indivíduos normais, mas o número de cópias de SMN2 modula o fenótipo de pacientes com AME. Devido a este espectro uniforme de mutação, a análise molecular realizada mais frequentemente é a detecção de deleções e conversões dos éxons 7 e/ou 8 dos genes SMN1 e SMN2 nos pacientes com suspeita clínica de AME. Neste trabalho, um protocolo baseado no sistema TaqMan® foi desenvolvido e comparado com a metodologia de PCR-RFLP (restriction fragment length polymorfism) utilizada no laboratório, avaliando o potencial de aplicação no diagnóstico molecular de pacientes com AME. Amostras de DNA de 100 indivíduos com suspeita clínica de AME foram analisadas pelos dois métodos. Amostras suspeitas de apresentar conversão foram analisadas por sequenciamento direto de DNA. Homozigotos para a ausência do exon 7 do gene SMN1 foram identificados em 58 casos (58%), sendo a maioria devido à deleção desse gene. Destes pacientes, 56 foram classificados, de acordo com os critérios diagnósticos revisados para AME, e distribuídos da seguinte forma: 26 (46,4%) do tipo I, 16 (28,6%) tipo II e 14 (25,0%) tipo III. Oito casos de conversão do gene SMN1 para SMN2 foram encontradas entre os pacientes e a distribuição desses casos entre as três formas clínicas foi a seguinte: 4 pacientes do tipo III, 3 do tipo II e 1 do tipo I. Cinco casos de homozigotos para ausência do gene SMN2 foram identificados entre os demais indivíduos. A comparação do método PCR-RFLP com o método baseado no sistema TaqMan® descrito neste estudo mostrou que ambos foram específicos e precisos para essas análises. No entanto, o ensaio TaqMan® foi mais sensível e mais rápido e parece ser um método adequado para o diagnóstico de AME. / Spinal muscular atrophy (SMA) is one of the most frequent autosomal recessive disorder with an estimated incidence of 1 case in each 10,000 live-births. SMA is characterized by degeneration of motor neurons in the spinal cord, causing progressive weakness of the limbs and trunk, followed by muscle atrophy. Patients have been classified in type I–III SMA based on age at onset and clinical course. All three types of SMA are caused by alterations in the survival motor neuron gene (SMN1) that also have a homologous copy named SMN2. About 95% of SMA patients show homozygous absence of SMN1 exon 7 due a deletion of this gene or a conversion into SMN2. The absence of SMN2 is found in about 5% of individuals with no clinical phenotype, but number of SMN2 copies modulates the phenotype of SMA patients. Considering this uniform mutation spectrum, direct molecular genetic testing consists basically of detecting deletions and conversions of exons 7 and 8 of these genes in SMA patients. In this work, we develop a real time PCR TaqMan® method and compared with the most commonly used PCR restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) assay, evaluating the potential application of molecular diagnosis of SMA patients. DNA samples from 100 individuals with clinical features of SMA were analyzed by both methods. Besides, patients DNA samples carrying a conversion event were analysed by direct DNA sequencing. Homozygous for SMN1 exon 7 absence were identified in 58 cases (58%) being the majority due to gene deletion and eight cases of gene conversion. From those, 56 were classified, according to the revised diagnostic criteria, and distributed as follows: 26 (46.4%) SMA type I, 16 (28.6%) SMA type II and 14 (25.0%) SMA type III. In addition, gene conversion was observed in 4 SMA type I patients, 3 SMA type II and 1 SMA type III patient. Among the remaining individuals five samples were found to be homozygous for absence of SMN2 gene. Comparing PCR-RFLP method and the method based on the TaqMan® system describe in this study, we verify that both were precise and specific for these analyses. However, the TaqMan® assay was faster and more sensitive than PCR-RFLP and was shown to be a suitable method for the diagnosis of SMA.

A doença de Gaucher (DG) é uma doença lisossômica de depósito, de herança autossômica recessiva, causada pela deficiência da enzima glicocerebrosidase (GC). Essa deficiência é causada por mutações no gene (GBA) que codifica esta enzima. Até o momento, mais de 250 mutações já foram identificadas nesse gene. O objetivo deste estudo foi identificar mutações na região codificante do gene GBA de pacientes brasileiros com DG através de PCR longo, seguido de nested PCR e sequenciamento direto. As análises foram realizadas em 54 pacientes não-aparentados com DG, confirmados por apresentar baixa atividade enzimática e com pelo menos um alelo mutante não-identificado após a triagem para 4 mutações comuns (p.N370S, p.L444P, 84insG e IVS2+1G>A). O protocolo introduzido permitiu a identificação de 7 variações de sequência novas (p.S125N, p.F213L, p.P245T, p.W378C, p.D399H, 982-983insTGC e IVS10+1G>T) no gene GBA de pacientes com DG. Todas essas novas variações de sequência são provavelmente alterações responsáveis pela doença, pois alteram resíduos conservados da proteína, inserem um aminoácido ou prejudicam o splicing normal do RNA mensageiro. Consequentemente, estas mutações causam mudanças na estrutura e/ou na função da GC. Além dessas, 24 mutações raras que já foram descritas previamente, também, foram identificadas nesse trabalho, contribuindo na definição do genótipo dos pacientes. A identificação dos alelos mutantes é importante para o conhecimento do espectro de mutações no nosso país e para aumentar o conhecimento das bases moleculares da doença. Além disso, essas informações podem também contribuir para a melhor compreensão de correlações genótipo-fenótipo, assim como, para o aconselhamento genético e/ou para a oferta de análises moleculares individualizadas para famílias em risco. / Gaucher disease (GD) is an autosomal recessive lysosomal storage disorder caused by deficiency of the glucocerebrosidase (GC). This deficiency is caused by mutations in the gene (GBA) coding for this enzyme. To date, more than 250 mutations have been identified associated with GD. The aim of this study was to identify mutations in the coding region of the GBA gene in Brazilian patients with GD through long-range PCR, followed by nested PCR and direct sequencing. Analyses were carried out in 54 unrelated GD patients who presented low enzymatic activity and had at least one unidentified disease-associated allele after screening for 4 common mutations (p.N370S, p.L444P, 84insG, and IVS2+1G>A). Protocol described here allowed the identification of 7 novel sequence variations (p.S125N, p.F213L, p.P245T, p.W378C, p.D399H, 982-983insTGC, and IVS10+1G>T) in the GBA gene of patients with GD. As these new sequence variations change conserved protein residues, insert an amino acid or affect mRNA normal processing, they are likely to be disease causing mutations. Consequently, these mutations cause changes in the GC structure and/or function. Besides, 24 rare mutations that were previously described were also identified in this work leading to the definition of patients´ genotype. The identification of mutant alleles is crucial for improving the knowledge of GBA mutation spectrum in our country and to the better understanding of molecular basis of the disease. Furthermore, such information may also contribute to the establishment of genotype-phenotype correlations as well as for more specific genetic counseling and/or to offer a customized molecular analysis for families at risk.