Dans le contexte de la bioéconomie, la découverte et la caractérisation des enzymes capables de dégrader la paroi végétale est particulièrement intéressante pour l’utilisation de la biomasse lignocellulosique dans l’industrie. A cet égard, la métagénomique fonctionnelle est un outil puissantpour découvrir de nouvelles enzymes à partir d’écosystèmes microbiens variés, comme l’illustrent les travaux sur le tube digestif du termite Pseudacanthotermes militaris. Cette étude a fourni une mine d’informations et identifié un hypothétique locus d’utilisation du xylane (XUS), codant pour cinq glycosides hydrolases (GH) et une carbohydrate esterase (CE) de Bacteroidales.Le XUS du métagénome de Pseudacanthotermes militaris contient une xylanase de la famille GH10 qui possède une organisation modulaire complexe dans laquelle la séquence du domaine GH10 est interrompue par une insertion de deux carbohydrate binding modules (CBM). Des travaux préliminaires ont montré que cette enzyme modulaire, désignée Pm25, est active sur xylane. Par conséquent, un des objectifs de cette étude a été la caractérisation détaillée des propriétés biochimiques et catalytiques de Pm25. Le rôle des CBM a également été examiné en quantifiant les interactions protéines-sucres et permettant ainsi une meilleure compréhension du rôle spécifique de ces modules, les résultats obtenus permettent de cerner l’impact de la modularité de Pm25 sur ses propriétés fonctionnelles.Dans une deuxième partie de l’étude, nous avons entrepris d’étudier la fonction de Pm25 dans le contexte du cluster XUS. Pour ce faire, nous avons étudié les enzymes adjacentes à Pm25 sur le locus,une autre GH10, une GH11, une GH115 et une GH43. La comparaison des paramètres cinétiques et une étude détaillée des produits d’hydrolyse ont été analysés par spectrométrie de masse et ont révélé que la GH10 et la GH11 étaient les enzymes clefs de la dépolymérisation en étant 20 fois plus efficaces que Pm25. En parallèle, nous avons développé un protocole pour l’utilisation de la micro-thermophorèse (MST) pour quantifier les interactions CBM-sucres, une approche intéressante qui nécessite peut d’échantillon et de ligand contrairement à d’autres méthodes biophysiques. Dans l’ensemble, cette étude a révélé le rôle important de Pm25 et ses homologues dans les locus d’utilisation des xylanes chez les Bacteroidetes et a permis d’identifié le sens de cette architecture particulière. / In the context of bioeconomy, the discovery and study of plant-cell wall degrading enzymes is particularly relevant for the use of lignocellulosic biomass for industrial purposes. In this respect, functional metagenomics has proven to be a powerful tool to discover new enzymes from a variety of microbial ecosystems, as exemplified by work performed on the gut of the termite Pseudacanthotermes militaris. This study provided a wealth of information and identified an interesting hypothetical xylan utilization system, encoding five glycoside hydrolases (GH) and one carbohydrate esterase (CE) annotated from bacteroidales. The Pseudacanthotermes militaris-derived putative XUS cluster contains a GH10 xylanase that displays a quite complex modular arrangement wherein the GH10 catalytic module contains two insertional carbohydrate binding modules (CBM). During the preliminary work, this modular enzyme, designated Pm25, was shown to be active on xylan, thus in the present research we set out to more thoroughly characterize its biochemical and catalytic properties.The role of the CBM was also investigated, quantifying protein-carbohydrate interactions and thus providing better insight into the specific role of the modules. Taken together, the results obtained provide insight into how Pm25 modularity translates into functional properties. In second part of our study, we set out investigate the function of Pm25 in the context of the XUS cluster. To achieve this we studied a xylan utilization system, which is constituted by another GH10, GH11, GH115 and GH43. The comparison of kinetic parameters and a detailed end product analysis by mass spectrometry showed that GH10 and GH11 outweigh over 20 fold Pm25 catalytic efficiency. In parallel, we developed the use of MicroScale Thermophoresis (MST) to quantify CBM-carbohydrates interactions, an interesting approach requiring smaller concentration of proteinsand ligands compared to other biophysical methods. Overall this study highlighted the important role of Pm25 homologs in the xylan utilization system in Bacteroidetes, and pinpointed the meaning of its unusual architecture.

Wood formation or xylogenesis is a fundamental process for so diverse issues as industry, shelter and a sustainable environment. Wood is comprised of secondary xylem, rigid large cells with thick cell walls that are lignified. The basis for the sturdy cells is an advanced composite made up of cellulose fibers cross-linked by hemicelluloses and finally embedded in lignin. This fiber-composite is the secondary cell walls of woody plants. Cell division and differentiation is regulated by switching on and off genes. Proteins encoded by these genes execute the major functions in the cells. They steer the entire machinery operating the structure and function of the cells, maintaining growth and synthesising essential products such as the cell wall carbohydrates.   Here we describe the investigation of genes and proteins involved in xylan formation as well as the development of a model system that will aid the functional analysis of wood formation. Xylan is the main hemicellulose or cross linking glycan in dicot wood and thereby one of the most abundant carbohydrates on earth. We demonstrate that hybrid aspen cell suspension cultures can be used as a model system for secondary cell wall formation. We have also examined glycosyltransferases from CAZy family 43 that play a part in secondary cell wall formation. We have focused on one of these, Pt×tGT43A, a likely ortholog of Arabidopsis IRX9, which plays a crucial role in xylan formation. The protein was transiently expressed in Nicotiana benthamiana and its function and localization is described. Also, we investigate a glycoside hydrolase, Pt×tXyn10A, involved in wood formation. Its role is not clear but it most likely modifies xylan as it gets incorporated into the secondary cell wall after secretion from the Golgi. This influences the interaction between cellulose, xylan and lignin in the finished wood cell. We have also cloned a transcription factor, Pt×tMYB021, a likely ortholog of Arabidopsis MYB46 and we show that it activates GT43A, GT43B and Xyn10A. By analysis of the promoter sequences we identify a CA-rich motif putatively important for xylem-specific genes.   By mastering proteins involved in xylogenesis we will acquire the tools to improve and develop the wood product market. Xylan is an immense unexploited source of renewable carbohydrate. New products envisioned include e.g. faster growing trees, changed fiber characteristics, optimised utilization of wood carbohydrates for biofuels and biomaterials as well as invention of intelligent materials by biomimetic engineering. / Vedbildning, eller xylogenes, är en grundläggande mekanism för så skilda områden som industri, boende och en hållbar miljö. Ved består av sekundärt xylem som är starka, stora celler med tjocka cellväggar som är lignifierade. Grunden för de starka cellerna är en avancerad komposit bestående av cellulosafibrer tvärbundna av hemicellulosa och slutligen ingjutet i lignin. Denna fiberkomposit är den sekundära cellväggen i vedartade växter. Celldelning och differentiering regleras genom att sätta igång och stänga av gener. Proteiner som kodas av dessa gener utför de viktigaste funktionerna i cellerna. De styr hela maskineriet som upprätthåller cellernas struktur och funktion, underhåller tillväxt samt tillverkar nödvändiga produkter såsom cellväggskolhydraterna. Här beskriver vi utforskningen av gener och proteiner som är inblandade i xylanbildning liksom utvecklandet av ett modellsystem som kommer vara en hjälp i den funktionella analysen av vedbildning. Xylan är den vanligaste hemicellulosan, eller korsbindande glykanen, i lövträd och därför en av de vanligaste kolhydraterna på jorden. Vi demonstrerar att hybridaspcellkulturer i suspension kan användas som ett modellsystem för sekundär cellväggsbildning. Vi har också undersökt glykosyltransferaser från CAZy-familj 43 som tycks spela en viktig roll i bildandet av sekundär cellvägg. Vi har fokuserat på en av dessa, Pt×tGT43A, en trolig ortolog till Arabidopsis IRX9 som spelar en viktig roll i xylanbildning. Proteinet har uttryckts övergående i Nicotiana benthamiana och dess funktion och lokalisering beskrivs. Dessutom undersöker vi ett glykosidhydrolas, Pt×tXyn10A, involverad i vedbildning. Dess roll är oklar men högst sannolikt modifierar det xylan medan det inkorporeras i sekundära cellväggen efter sekretion från Golgi. Detta influerar interaktionen mellan cellulosa, hemicellulosa och lignin i den slutliga vedcellen. Vi har också klonat en transkriptionsfaktor, Pt×tMYB021, en trolig ortolog till Arabidopsis MYB46 och vi visar att den aktiverar GT43A, GT43B och Xyn10A. Genom analys av promotorsekvenserna har vi identifierat ett CA-rikt motiv förmodat viktigt för xylemspecifika gener.Genom att bemästra proteinerna som är ansvariga för vedbildning får vi verktyg att utveckla skogsproduktsmarknaden. Xylan är en ofantligt stor outnyttjad källa till förnyelsebara kolhydrater. En vision är nya produkter som till exempel snabbväxande träd, ändrade fiberegenskaper, optimerat användande av vedkolhydrater för biobränsle och biomaterial såväl som utvecklandet av intelligenta material genom biomimetisk ingenjörskonst. / QC20100730