Gegenstand der Arbeit ist eine umfassende Charakterisierung von Struktur und Funktion des G-Protein-gekoppelten Rezeptors GPR34 auf genomischer, mRNA und Proteinebene, die mögliche Rückschlüsse auf physiologische Funktionen oder den natürlichen Agonisten zulassen. Dazu wurde die genomische Organisation des GPR34 in Mensch, Maus und Ratte analysiert und festgestellt, dass neben der intronlosen kodierenden Sequenz auch der 5´-Bereich des GPR34 mit seiner nicht-kodierenden Intron-Exon-Struktur stark konserviert ist. Es wurden in der Ratte und der Maus mindestens zwei, beim Menschen ein putativer Transkriptionsstart identifiziert. Beim Menschen konnte ein kryptisches Intron innerhalb der kodierenden Sequenz des GPR34 gefunden werden, was zu einer Verkürzung des N-Terminus um 47 Aminosäuren führt. Auf der Transkriptionsebene wurde der GPR34 und der GPR34-like Rezeptor im Haushuhn (Gallus gallus) und die GPR34-Expression in der Ratte mittels quantitativer RT-PCR analysiert und die ubiquitäre Gewebeverteilung des Rezeptors bestätigt. Beim menschlichen GPR34 konnte festgestellt werden, dass die fünf putativen Translationsstarts innerhalb der kodierenden Sequenz auch als solche funktionstüchtig sind und der zweite Translationsstart bevorzugt genutzt wird. Die genetische Variabilität des GPR34 in der menschlichen Population ist sehr gering. Es konnte innerhalb einer weltweiten DNA-Probensammlung nur ein einziges Mal eine Mutation in der kodierenden Sequenz lokalisiert werden. Mithilfe des während dieser Arbeit entstandenen Mausmodelles ist eine weitere Charakterisierung der physiologischen Relevanz des GPR34 möglich.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion des G-Protein-gekoppelten Rezeptors 34 (GPR34) in Mikroglia untersucht. Dieser Rezeptor weist eine hohe Expression auf Gliazellen auf, jedoch ist über dessen Aufgabe innerhalb dieser Zellpopulation bisher nichts bekannt. In bisherigen Arbeiten wurde dem GPR34 eine Rolle in der Immunantwort zugeschrieben. Knock-out (ko)-Mäuse, welche mit Cryptococcus neoformans infiziert wurden, zeigten im Vergleich zum infizierten Wildtyp (wt) eine deutlich höhere Pathogenlast in verschiedenen Geweben u.a. im Gehirn, was für eine inadäquate Immunantwort spricht. In dieser Arbeit konnte mittels morphologischer Studien gezeigt werden, dass eine GPR34- Defizienz zu einer veränderten Gestalt der Mikroglia im Cortex sowie der Retina führt. Mikrogliazellen aus ko-Mäusen sind kleiner und deutlich weniger ramifiziert. Mit Hilfe von Transkriptomanalysen wurde eine große Vielfalt an unterschiedlich exprimierten Genen zwischen ko- und wt-Tieren identifiziert. Hierunter befanden sich Gene, die die Motilität, aber auch die Phagozytose der Mikroglia beeinflussen. Um den Einfluss der GPR34-Defizienz auf diese Vorgänge zu untersuchen, wurden zahlreiche funktionelle Untersuchungen an murinen Mikrogliazellen durchgeführt. Mittels basalen Motilitätsstudien aber auch unter Stimulation durch Laserläsion und Läsion des entorhinalen Cortex konnten keine Unterschiede in der Beweglichkeit von Mikroglia aufgedeckt werden. Jedoch zeigten ko- Mikrogliazellen des Cortex und der Retina eine deutlich geringere Phagozytoseaktivität. Dies ist ein möglicher Erklärungsansatz für die beschriebene erhöhte Pathogenlast in den GPR34- defizienten Tieren. Da die Phagozytoseaktivität von Mikroglia in neurodegenerativen Erkrankungen wie Multipler Sklerose oder der Alzheimer´schen Demenz eine bedeutende Rolle spielt, sollte zukünftig die Relevanz des GPR34 bei diesen Erkrankungen untersucht werden.

Gegenstand der Arbeit ist eine umfassende Charakterisierung von Struktur und Funktion des G-Protein-gekoppelten Rezeptors GPR34 auf genomischer, mRNA und Proteinebene, die mögliche Rückschlüsse auf physiologische Funktionen oder den natürlichen Agonisten zulassen. Dazu wurde die genomische Organisation des GPR34 in Mensch, Maus und Ratte analysiert und festgestellt, dass neben der intronlosen kodierenden Sequenz auch der 5´-Bereich des GPR34 mit seiner nicht-kodierenden Intron-Exon-Struktur stark konserviert ist. Es wurden in der Ratte und der Maus mindestens zwei, beim Menschen ein putativer Transkriptionsstart identifiziert. Beim Menschen konnte ein kryptisches Intron innerhalb der kodierenden Sequenz des GPR34 gefunden werden, was zu einer Verkürzung des N-Terminus um 47 Aminosäuren führt. Auf der Transkriptionsebene wurde der GPR34 und der GPR34-like Rezeptor im Haushuhn (Gallus gallus) und die GPR34-Expression in der Ratte mittels quantitativer RT-PCR analysiert und die ubiquitäre Gewebeverteilung des Rezeptors bestätigt. Beim menschlichen GPR34 konnte festgestellt werden, dass die fünf putativen Translationsstarts innerhalb der kodierenden Sequenz auch als solche funktionstüchtig sind und der zweite Translationsstart bevorzugt genutzt wird. Die genetische Variabilität des GPR34 in der menschlichen Population ist sehr gering. Es konnte innerhalb einer weltweiten DNA-Probensammlung nur ein einziges Mal eine Mutation in der kodierenden Sequenz lokalisiert werden. Mithilfe des während dieser Arbeit entstandenen Mausmodelles ist eine weitere Charakterisierung der physiologischen Relevanz des GPR34 möglich.:Bibliographische Beschreibung 4 1 Einleitung 5 1.1 Das GPCR-Repertoire in Vertebraten 5 1.1.1 Signaltransduktion 5 1.1.2 GPCR - Klassifikation 6 1.1.3 „Orphan“ G-Protein-gekoppelte Rezeptoren 7 1.2 Die Familie der Purin- und Pyrimidinrezeptoren 8 1.2.1 Strukturelle Besonderheiten der P2Y-Rezeptoren 8 1.2.2 Rolle der Nukleotidrezeptoren im kardiovaskulären System 9 1.3 GPR34 - ein „orphan“ G-Protein-gekoppelter Rezeptor 10 1.3.1 Gewebeexpression des GPR34 10 1.3.2 Genomische Organisation und Proteinstruktur des GPR34 11 1.3.3 Lysophosphatidyl-L-Serin – möglicher Agonist des GPR34 12 1.4 GPR34–like ein verwandter „orphan“ G-Protein-gekoppelter Rezeptor 15 2 Zielstellung 16 3 Originalarbeit 17 4 Ergänzungen zur vorgenannten Originalarbeit 29 4.1 Vergleich der Expression von GPR34 und GPR34-like Rezeptoren im Huhn 29 4.2 Populationsgenetische Untersuchungen des humanen GPR34 30 5 Zusammenfassung der Arbeit 31 5.1 Spezifische Promotoraktivität in verschiedenen Organen der Maus 31 5.2 Alternative Translationsstarts im hGPR34 32 5.3 Geringe allelische Variabilität des GPR34-Gens in der menschlichen Population 33 5.4 Ubiquitäre Expression von GPR34 und GPR34-like Rezeptoren 34 5.5 Etabliertes Mausmodell ist vital und fortpflanzungsfähig 34 6 Referenzen 36 Anlagen 38 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 38 Eigene Publikationen 39 Danksagung 42

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion des G-Protein-gekoppelten Rezeptors 34 (GPR34) in Mikroglia untersucht. Dieser Rezeptor weist eine hohe Expression auf Gliazellen auf, jedoch ist über dessen Aufgabe innerhalb dieser Zellpopulation bisher nichts bekannt. In bisherigen Arbeiten wurde dem GPR34 eine Rolle in der Immunantwort zugeschrieben. Knock-out (ko)-Mäuse, welche mit Cryptococcus neoformans infiziert wurden, zeigten im Vergleich zum infizierten Wildtyp (wt) eine deutlich höhere Pathogenlast in verschiedenen Geweben u.a. im Gehirn, was für eine inadäquate Immunantwort spricht. In dieser Arbeit konnte mittels morphologischer Studien gezeigt werden, dass eine GPR34- Defizienz zu einer veränderten Gestalt der Mikroglia im Cortex sowie der Retina führt. Mikrogliazellen aus ko-Mäusen sind kleiner und deutlich weniger ramifiziert. Mit Hilfe von Transkriptomanalysen wurde eine große Vielfalt an unterschiedlich exprimierten Genen zwischen ko- und wt-Tieren identifiziert. Hierunter befanden sich Gene, die die Motilität, aber auch die Phagozytose der Mikroglia beeinflussen. Um den Einfluss der GPR34-Defizienz auf diese Vorgänge zu untersuchen, wurden zahlreiche funktionelle Untersuchungen an murinen Mikrogliazellen durchgeführt. Mittels basalen Motilitätsstudien aber auch unter Stimulation durch Laserläsion und Läsion des entorhinalen Cortex konnten keine Unterschiede in der Beweglichkeit von Mikroglia aufgedeckt werden. Jedoch zeigten ko- Mikrogliazellen des Cortex und der Retina eine deutlich geringere Phagozytoseaktivität. Dies ist ein möglicher Erklärungsansatz für die beschriebene erhöhte Pathogenlast in den GPR34- defizienten Tieren. Da die Phagozytoseaktivität von Mikroglia in neurodegenerativen Erkrankungen wie Multipler Sklerose oder der Alzheimer´schen Demenz eine bedeutende Rolle spielt, sollte zukünftig die Relevanz des GPR34 bei diesen Erkrankungen untersucht werden.

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