Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Ma thèse porte sur l'étude des rôles régulateurs des GTPases Rho et de leurs effecteurs ROCK sur l'expression de ligands du système immunitaire, sur des cellules de mélanomes murins et humains ainsi que les conséquences sur le développement tumoral de modulateurs de la voie RhoA/ROCK. A l'heure actuelle, les traitements du mélanome métastatique ont une efficacité limitée, c'est pourquoi les nouvelles stratégies s'orientent vers l'immunothérapie notamment en recherchant de nouvelles molécules pharmacologiques capables d'amplifier les réponses immunes anti mélanome. Mon travail a porté sur l'étude de trois ligands de l'immunité modulés par la voie RhoA/ROCK : - Nous avons étudié la régulation du ligand MICA qui est exprimé sur des mélanomes humains, mais qui est reconnu par les cellules NK humaines et murines du système immun inné. En utilisant des statines, qui sont des inhibiteurs de l'activité des Rho, nous avons induit une surexpression membranaire de MICA sans toxicité cellulaire. Cette surexpression s'accompagne d'une sensibilisation des mélanomes à la lyse par les cellules NK. Elle induit également un ralentissement de leur croissance tumorale sous-cutanée en souris NMRI nu/nu et une diminution de l'implantation des métastases pulmonaires. Nous avons aussi montré que cette régulation de MICA induite par les statines ne dépendait pas de l'inhibition des GTPases Ras ou Rho mais de la voie de PPAR?. - Nous avons ensuite étudié la régulation de la molécule de costimulation CD70 par les GTPases Rho sur des mélanomes humains et son rôle dans ces tumeurs. Nous avons montré que les mélanomes primitifs expriment CD70, que cette expression diminue au cours de la maladie et que la GTPase RhoA et la voie des MAPK contrôlent positivement l'expression de CD70 sur nos lignées de mélanome humain. De façon surprenante, nous avons aussi montré que CD70 possède une fonction non immunologique dans ces tumeurs. En effet, la trimérisation de CD70 favorise l'invasion tumorale et l'apparition de métastases en activant la voie de signalisation BRAF/MEK/ERK/RhoE et en inhibant les fibres de stress d'actine et des points focaux d'adhésion. - Enfin, nous nous sommes intéressés aux conséquences de la modulation de FasL sur le développement tumoral du mélanome murin B16F10. Des travaux précédents de l'équipe ont montré que la protéine RhoA et ses effecteurs ROCK régulent de façon négative l'expression de FasL à la membrane des cellules B16F10. Nous avons étudié le rôle in vivo de la surexpression de FasL induite par l'inhibition de ROCK par le H1152. Nous avons mis en évidence un ralentissement de la croissance tumorale in vivo chez les souris immunocompétentes. Ce contrôle du développement tumoral est dépendant de la voie Fas/FasL et de l'activité des lymphocytes TCD8+ et de l'IFN-?. De plus, l'inhibition de ROCK réduit le nombre de métastases pulmonaires sans intervention de la réponse immune adaptative. L'ensemble de mes travaux montre que le ciblage de la voie des GTPases Rho et de leurs effecteurs ROCK constitue une approche nouvelle pour amplifier les réponses immunes protectrices innées et adaptatives anti mélanome, suggérant que des inhibiteurs de cette voie pourraient être envisagés dans de nouveaux protocoles d'immunothérapie du mélanome / My thesis focuses on the study of the regulatory roles of Rho GTPases and their effectors ROCK on the expression of immune system ligands in murine and human melanoma cell lines and the impact on tumor development of modulators of the RhoA/ROCK pathway. Current therapies for metastatic melanoma have poor efficiency. It is the reason why new immunotherapeutic strategies are developed for to find new pharmacological molecules that could improve anti-melanoma immune responses. My work is based on the study of three immune ligands: - We studied the regulation by Rho GTPases of MICA ligand expression in human melanoma cell lines and their recognition by NK cells. Using statins, inhibitors of Rho GTPases activity, we have induced MICA over-expression without any cell toxicity. This MICA over-expression enhanced melanoma cells sensitivity to NK cells lysis, then reduced subcutaneous tumor growth in NMRI nu/nu mice and also decreased pulmonary metastases implantation. We also showed that statins-induced MICA over-expression was not linked to Ras or Rho GTPases inhibition but to PPAR? pathway. - Then, we studied the expression and the function of a co-stimulatory molecule, CD70, and its regulation by the Rho pathway in human melanomas. We demonstrated that the RhoA GTPase and MAPK pathway positively regulate CD70 expression in our melanoma cell lines. Surprisingly, we observed a non-immunological function of CD70 in melanoma. Indeed, CD70 trimerization enhanced melanomas invasion and metastatic capacities through an activation of BRAF/MEK/ERK/RhoE pathway, which inhibited stress fibers and focal adhesions. - Finally, we analyzed the consequences of FasL over-expression on B16F10 murine melanoma development in vivo. Our previous studies have showed that RhoA/ROCK pathway negatively regulates membrane FasL expression on B16F10 cells. We studied in vivo the role of this FasL over-expression induced by ROCK inhibitor H1152, on melanoma cells. We showed tumor growth shrinkage in immunocompetent mice, when B16F10 cells were pretreated with H1152. The Fas/FasL pathway and the activity of TCD8+ cells and IFN- ? induced this tumor slowing down. Moreover, ROCK inhibition induced a reduction of pulmonary metastases implantation independently of T lymphocytes response. Altogether, my work showed that targeting Rho GTPases/ROCK pathway could be interesting in order to improve innate and adaptative anti melanoma immune responses, suggesting that inhibitors of this pathway could be envisaged in new melanoma immunotherapy protocols

Titre de l'écran-titre (visionné le 30 octobre 2023) / Le processus complexe de division des cellules eucaryotes repose en grande partie sur l'organisation et la régulation méticuleuses de divers composants cellulaires, tels que les microtubules et le cortex d'actine. La coordination entre ces deux structures est essentielle au cours de la division cellulaire car un défaut de cette dernière peut conduire à une aneuploïdie. Le rôle des microtubules est central dans la division cellulaire, en particulier lors de la mitose. Lorsque les cellules entrent en mitose, elles subissent un processus de remodelage rapide et dynamique, au cours duquel les microtubules de l'interphase se désassemblent et se réassemblent, à partir des centrosomes, en microtubules plus courts et plus dynamiques. Lorsque la rupture de l'enveloppe nucléaire (NEBD) se produit, ces microtubules s'étendent et atteignent les chromosomes, formant un fuseau bipolaire au centre duquel les chromosomes seront alignés. Une fois les chromosomes alignés correctement, le point de contrôle d'assemblage du fuseau est satisfait et les cellules entrent en anaphase, au cours de laquelle les chromosomes se séparent. L'importance du cytosquelette d'actine au cours de la mitose est largement reconnue. Lors de l'entrée en mitose, les cellules perdent leurs adhésions focales, leurs extrémités se rétractent, elles s'arrondissent et le fuseau mitotique se forme. La mise en place de cette réorganisation cellulaire nécessite l'activation du complexe Cyclin B/CDK1 puis sa relocalisation vers le noyau. La géométrie de l'adhésion cellulaire peut influencer la position du fuseau mitotique et la mémoire des événements cellulaires entre générations, soulignant l'importance du cytosquelette d'actine dans le processus d'entrée en mitose. Alors que les changements dans la dynamique des microtubules et du cytosquelette d'actine lors de l'entrée en mitose semblent indépendant l'un de l'autre, des observations récentes suggèrent qu'il y aurait des interactions entre le fuseau mitotique et le cortex d'actine par l'intermédiaire des GTPases (Matthews et al., 2012). Les GTPAses de la famille RHO sont activées par les facteurs d'échange nucléotidiques (GEFs) en réponse à une pléthore de stimuli extracellulaires, régulant plusieurs réponses cellulaires telles que la prolifération, la différentiation et le mouvement. De nombreux événements de signalisation cellulaire sont contrôlés par les GTPAses de la famille RHO, notamment les changements dans la morphologie cellulaire, l'adhésion, la motilité, la progression du cycle cellulaire, la survie, l'apoptose et la cytokinèse. ARHGEF17, aussi appelé TEM4 (tumor endothelial marker 4), une protéineGEF de la famille RHO, qui est spécifique de RHOA/B/C, est impliquée dans la régulation du cytosquelette interphasique. Il a été démontré que TEM4 se lie directement à l'actine et aux filaments d'actine dynamiques nouvellement assemblés via son extrémité N-terminale, indépendamment de son activité RHOGEF. Dans les cellules en interphase, il est suspecté que TEM4 et RHOC suppriment la contractilité de la myosine et contrôlent le désassemblage des adhésions focales. TEM4 a aussi été identifiée comme une protéine essentielle à la mitose requise pour la localisation du fuseau monopolaire 1 (MPS1) au kinétochore. L'objectif de cette thèse est d'identifier les fonctions de TEM4 au cours du cycle cellulaire. Cette étude met en évidence le manque de spécificité de l'anticorps commercial le plus communément utilisé pour marquer TEM4 et démontre que cette protéine joue un rôle crucial dans l'entrée en mitose, l'alignement des chromosomes et la formation du fuseau mitotique. L'inhibition de l'expression de TEM4 empêche les cellules de s'arrondir et altère l'actine corticale dans les cellules mitotiques, entrainant une augmentation de RHOA actif, comme le montre la quantification de la RHOA-GTP au niveau du cortex mitotique, ce qui confirme sa fonction de régulateur de la contractilité cellulaire. Les phénotypes mitotiques observés en absence de TEM4 sont dus en partie à de faible niveaux de Cyclin B, expliquant le délai mitotique observé. L'expression exogène de Cyclin B rétablit la progression du cycle cellulaire, augmente l'index mitotique et résout l'excès de chromosomes retardés observé en absence de TEM4. Dans l'ensemble, cette étude apporte un nouvel éclairage sur l'importance de TEM4 dans le cycle cellulaire et contribue aux connaissances de son rôle dans les mécanismes cellulaires. / The intricate process of eukaryotic cell division relies heavily on the meticulous organization and regulation of various cellular components, such as the microtubules and the actin-based cortex. Proper coordination between these two structures is essential during cell division, as failure to do so can result in aneuploidy. The role of microtubules is central to cell division, particularly during mitosis. When cells enter mitosis, they undergo a rapid and dynamic remodeling process, during which the interphase microtubules disassemble and give rise to shorter, more dynamic microtubules emanating from centrosomes. Once Nuclear Envelope Breakdown (NEBD) occurs, these microtubules extend and reach the chromosomes, forming a bipolar spindle in the midzone of which captured chromosomes will align. Upon achieving proper orientation and satisfying the spindle assembly checkpoint, cells enter anaphase, during which the chromosomes separate. The importance of the actin cytoskeleton during the process of mitosis is widely recognized. Mitotic entry is characterized by the retraction of the cell margin, followed by the rounding up of the cell and the formation of the mitotic spindle. CDK1-Cyclin B activation and subsequent translocation into the nucleus are required for this process to occur. Upon activation of the complex and its translocation to the nucleus, there is a loss of cellular adhesion, followed by cell rounding up, culminating in mitotic entry. The geometry of cell adhesion can also impact the position of the mitotic spindle and the memory of cellular events between cell generations, highlighting the significance of the actin cytoskeleton to the mitotic entry process. While changes in the dynamics of the microtubule and actin cytoskeletons at the onset of mitosis appear to occur independently, recent evidence suggests that there may be crosstalk between the mitotic spindle and the actin cortex through GTPases (Matthews et al., 2012). RHO family GTPases are activated by guanine nucleotide-exchange factors (GEFs) in response to a plethora of extracellular stimuli, regulating several cellular responses, such as proliferation, differentiation, and movement. Among the numerous signaling events driven by RHO family GTPases are changes in cell morphology, adhesion, motility, cell cycle progression, survival, apoptosis, and cytokinesis. ARHGEF17, also called TEM4 (tumor endothelial marker 4), a RHO family GEF specific for RHOA/B/C, has been shown to regulate the interphase cytoskeleton. TEM4 has been shown to directly bind actin, specifically dynamic newly assembled actin filaments, via its N-terminus independently of its RHOGEF activity. In interphase cells, TEM4 and RHOC are proposed to suppress myosin contractility and to control focal adhesion disassembly. TEM4 has also been identified as an essential mitotic protein required for the localization of Monopolar Spindle 1 (MPS1) at the kinetochore. This thesis aims to understand the functions of TEM4 during the cell cycle. This study highlights the lack of specificity of the most commonly used commercial antibody against TEM4 and provides evidence that TEM4 plays a crucial role in mitotic entry, chromosome alignment, and spindle formation. The downregulation of TEM4 prevents cells from rounding up and alters cortical actin in mitotic cells, leading to an increased activation of RHOA, as shown by quantification of RHOA-GTP at the mitotic cortex, confirming its function as a regulator of cellular contractility. The mitotic phenotypes observed in the absence of TEM4 are found to be partially due to low levels of Cyclin B, explaining the observed mitotic delay. The expression of exogenous Cyclin B restores cell cycle progression, increases the mitotic index, and rescues the excessively lagging chromosomes observed in the absence of TEM4. Overall, despite the limited literature available on TEM4, this study sheds new light on the importance of TEM4 in the cell cycle and contributes to our understanding of this protein's role in cellular processes.

L'os est un tissu dynamique résultant de l'équilibre entre l'activité de résorption des ostéoclastes (OCs) et l'activité de formation des ostéoblastes. Cette fonction ostéoclastique se met en place à l'intérieur de la zone de scellement qui est formée à travers une profonde réorganisation du cytosquelette médiée par la GTPase Rho, Rac1. Récemment, le laboratoire a démontré l'implication essentielle de Dock5, un facteur d'échange de Rac1, dans la formation de la zone de scellement et consécutivement, dans la dégradation du tissu osseux. En effet, les analyses des OCs matures issus de souris Dock5-/- différenciés sur support minéralisé, montrent une diminution importante du nombre de cellules présentant cette structure. Ce résultat est corrélé à la diminution drastique de la surface des lacunes de résorption formées par les OCs Dock5-/-. De plus, les études in vivo révèlent une augmentation de la masse de l'os trabéculaire des souris Dock5-/- adultes.Dans ce contexte, d'une part, nous avons analysé la voie de signalisation de Dock5 et de ces partenaires impliqués dans cette réorganisation du cytosquelette d'actine. Nos études protéomiques nous ont conduit à porter un intérêt plus particulier à la Tensine3 (Tns3), une protéine d'adhésion. Le domaine END de la Tns3 interagit avec Dock5 et nous avons localisé ces deux protéines au niveau de la ceinture de podosomes des OCs matures. De plus, nous avons montré que l'inhibition de la Tns3 perturbe l'organisation de la ceinture de podosomes des OCs et que la coexpression de la Tns3 et de Dock5 augmente le niveau de Rac1 actif dans les cellules HEK293. L'ensemble de nos résultats suggèrent, à travers son rôle de recruteur et d'activateur de Dock5, une importante implication de la Tns3 dans l'organisation de la ceinture de podosomes dépendante de Dock5.D'autre part, pour déterminer le stade développemental à partir duquel la fonction de résorption des OCs est nécessaire au développement normal de l'os, nous avons effectué des analyses histologiques sur les souris Dock5-/- durant l'ossification endochondrale. Nos données démontrent que l'activité de résorption des OCs n'est pas impliquée dans la dégradation du tissu cartilagineux minéralisé. Notre modèle d'étude, les souris Dock5-/-, nous a permis de dissocier l'implication de l'activité de résorption des OCs de la fonction de la métalloprotéase 9 (MMP9) ostéoclastique. La MMP9 ostéoclastique est un acteur crucial de la physiologie du cartilage hypertrophique durant le processus d'ossification endochondrale. Nos études sur l'os trabéculaire révèlent que l'activité de résorption des OCs devient essentielle à 7 jours de développement post-natal pour dégrader l'os minéralisé. L'ensemble de nos résultats suggèrent pour la première fois une implication spatiale et temporelle, complémentaire de l'activité de résorption des OCs et de la fonction MMP9 ostéoclastique durant le développement endochondral. / Bone is a dynamic tissue resulting from the bone resorption activity of osteoclasts (OCs) compensated by the bone formation activity of osteoblasts. This osteoclastic function takes place inside a structure called sealing zone. It is formed through a deep actin cytoskeleton remodeling involving the RhoGTPase Rac1. Recently, the laboratory demonstrated the essential implication of Dock5, a Rac1 exchange factor, in establishing the sealing zone and consequently in bone degradation. Indeed, in vitro analyses of OCs differentiated from Dock5-/- mice show an important decrease of cells having a sealing zone. This result is correlated with a drastic diminution of resorption pits surface as compared to control OCs. In addition, in vivo studies revealed an increase of Dock5 -/- adult mice trabecular bone mass. In this context, on one hand, part of my work was to investigate the signaling pathway of Dock5 and its partners implicated in this actin cytoskeleton reorganization. Proteomic analysis led us to focus our interest on Tensine3 (Tns3), an adhesion protein. We defined the END domain of Tns3 as a Dock5 interaction domain and localized these two proteins in podosomes belt of mature osteoclasts. Moreover, we shown that silencing of Tns3 disturbed podosomes belt organization of osteoclasts and that coexpression of Tns3 and Dock5 increased Rac1 activity in HEK293 cells. Taken together, our results suggest an important implication of Tns3 in Dock5-dependent podosomes belt organization, through a Dock5 localization and a Dock5 activation role.My second aim was to determine the developmental stage from which OCs resorption function is necessary for bone to develop normally. We performed histological analyses of Dock5-/- mouse bone during endochondral ossification. Our analyzes demonstrate that OCs resorption activity is not implicated in mineralized hypertrophic cartilage degradation. Our model of study, the Dock5-/- mice, allowed us to distinguish the implication of OCs resorption activity from osteoclastic metalloprotease 9 (MMP9) function. This led us to define osteoclastic MMP9 as crucial actor in physiology of hypertrophic cartilage during the endochondral ossification process whereas Ocs resorption activity becomes essential at 7 days of post-natal development to degrade mineralized bone. Taken together, our results suggest for the first time, a complementary spatial and temporal implication of resorption activity of OCs and osteoclastic MMP9 function during endochondral development.

O Corpo Ciliar (CC) é uma fonte de células tronco da retina de animais adultos, mas sua ativação permanece desconhecida. GTPases Rho são proteínas que reorganizam do citoesqueleto de actina, regulam vias de sinalização e transcrição gênica, sobrevivência celular e proliferação. Neste trabalho, investigamos a expressão das GTPases Rho nas células do CC e seu efeito na regulação do ciclo celular. As GTPases RhoA, RhoB e Rac1 foram expressas nas células do CC e sua ativação pelo ácido lisofosfatidico (LPA) aumentou a expressão dos genes progenitores retinianos Pax6 e Chx10. A inibição das proteínas por Toxina A de Clostridium difficile aumentou a proliferação no CC e potencializou o efeito proliferativo dos fatores de crescimento. A inibição especifica destas proteínas diminuiu a expressão dos transcritos de p21cip, p27kip, p16INK4a e p19INK4d e aumentou de Ki67, CiclinaA e D1. O estudo da via de Wnt indicou que Rac1 regulou os genes de componentes da degradação de -catenina e Lef1. Concluímos que a inativação das GTPases Rho induziu a proliferação das células progenitoras retinianas localizadas no CC e regulou a via de Wnt. Sua ativação induziu o perfil de célula progenitora, sugerindo uma nova ferramenta para o mecanismo de reparo retiniano. / Ciliary Body (CB) is a potential source of stem cells in the adult retina, but its activation is still unknown. Rho GTPases play a role in actin-based cytoskeleton reorganization, regulate signaling pathways and gene transcription, cell survival and cell proliferation. In this study we investigated the expression of Rho GTPases in CB cells and their role on cell cycle regulation. The GTPases RhoA, RhoB and Rac1 were present in CB cells and the activation by lysophosphatidic acid (LPA) increased the expression of the progenitor genes Pax6 and Chx10. The inhibition by Clostridium difficile Toxin A increased the proliferation of CB cells and potentiated the proliferative effect of growth factors. The specific inhibition decreased the expression of p21cip, p27kip, p16INK4a and p19INK4d as well as increased Ki67, cyclinA and D1 transcripts. The Wnt pathway study indicated that Rac1 regulated -catenin degradation genes components and Lef1. Taken together, the inactivation of Rho GTPases stimulated the proliferation of progenitor cells located in CB as well as regulate the Wnt signaling pathway. The proteins activation was correlated to progenitor profile induction. These different mechanisms may provide a potential new approach on retinal repair.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. [156]-175. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2009. / Bibliogr.: f. 146-173. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

La migration cellulaire collective (MCC) est un processus fondamental qui intervient au cours du développement, de la réparation tissulaire, de l'invasion tumorale et de la formation de métastases. Les cellules qui migrent collectivement possèdent deux types d'interaction avec leur environnement : i) l'un avec leur substrat et ii) l'autre avec les cellules voisines en migration. Deux grandes familles de protéines permettent ces interactions ainsi que la génération de forces mécaniques: i) la famille des intégrines (les récepteurs de la matrice extracellulaire) et ii) la famille des cadhérines (formant les jonctions intercellulaires). Les cadhérines classiques sont impliquées dans la formation des jonctions intercellulaires et sont les principaux acteurs de la MCC au cours du développement normal et tumoral. La transmission de force entre les cellules en migration est nécessaire à leur cohésion et à la communication des cellules entre elles. Des études récentes montrent que les cadhérines sont nécessaires à la transmission des forces au substrat. Néanmoins, les processus par lesquels les cadhérines agissent sur ses forces dans le contexte d'une MCC restent inexplorés. Nous avons identifié l'expression de la P-cadhérine comme étant associée à l'agressivité du rhabdomyosarcome de type alvéolaire (ARMS), sous type ayant le plus mauvais pronostic car très invasif. Nos données, ainsi que de récentes études qui démontrent que la P-cadhérine est impliquée dans l'agressivité des tumeurs du sein, nous ont conduits à étudier le rôle de cette cadhérine dans la migration cellulaire, processus majeur dans le développement tumoral. Nous nous sommes intéressés à l'impact de l'expression de la P-cadhérine sur la migration des myoblastes murins normaux C2C12. Pour ce faire nous utilisons un test de migration in vitro en 2D proche du test de blessure qui consiste à retirer une barrière physique induisant la migration des cellules vers l'espace libre ainsi créé. Nous avons pu monter que l'expression de la P-cadhérine dans les myoblastes C2C12 augmente les paramètres caractéristiques d'une MCC in vitro : la vitesse, la polarité, la persistance et la directionalité de la migration des cellules du front et au sein du feuillet. De plus, à l'aide de techniques microscopiques de mesure des forces nous avons montré une augmentation des forces intercellulaires allant du front vers le feuillet cellulaire au cours de la migration des cellules exprimant la P-cadhérine. Cela suggère une augmentation de la cohésion cellulaire. L'ensemble de ces résultats démontrent clairement que l'expression de la P-cadhérine induit une MCC. Nous avons aussi mesuré et cartographié les forces de traction au substrat connues pour être le moteur de la migration cellulaire. Nos données indiquent que l'expression de la P-cadhérine augmente l'anisotropie de ces forces de traction ainsi que leur intensité, et ce, uniquement au front de migration. L'expression de la P-cadhérine remodèle et stimule la dynamique des plaques focales d'adhérence à cet endroit.Afin de mieux comprendre comment la P-cadhérine modifie la dynamique des adhésions focales et augmente les forces de traction, nous avons étudié l'activité spatiotemporelle des petites protéines G de la famille Rho. Nous montrons que l'expression de la P-cadhérine active Rac1 et Cdc42 au front de migration, entrainant ainsi le remodelage et l'organisation des plaques focales d'adhérence à cet endroit. L'inhibition de Rac1 et Cdc42 bloque la MCC induite par la P-cadhérine. Pour conclure, en combinant la mesure des paramètres de migration cellulaire avec la mesure des forces mécaniques intercellulaires et au substrat, nous avons démontré que la P-cadhérine induit un comportement collectif des cellules et ce dépendamment de l'activité de Rac1 et de Cdc42. De plus nous mettons en avant l'existence de propriétés mécano-transductrices de cette cadhérine au cours de la MCC. / Collective cell migration (CCM), the coordinated movement of multiple cells that are connected by cell-cell adhesion, is a fundamental process in development, tissue repair and tumor invasion and metastasis. Cells part of a moving collective have two different types of interactions, i) one with the substratum, and ii) one with surrounding moving cells. Two protein families allow these interactions and also the generation of mechanical forces: i) typically integrins on the underlying extracellular matrix (ECM) and ii) cadherins at intercellular adhesion sites. Classical cadherins are involved in cell-cell adhesion and are major drivers of collective cell migration in embryonic development and tumorigenesis.Mechanical coupling between migratory cells may result in the production of force-dependent signals by which the cells influence each other. Moreover, whereas recent data showed that cadherin-dependent cell-cell adhesions are important for the force transmission to the ECM, how intercellular adhesion impacts on cell-ECM forces in the context of collective cell migration is totally unexplored. We identified P-cadherin expression to be associated with alveolar rhabdomyosarcoma (ARMS) aggressiveness, tumors with a bad prognosis due to the propensity for early and wide dissemination. Our data and recent findings showing that P-cadherin is associated with breast tumor invasiveness and aggressiveness, led us to investigate the role of P-cadherin in cell migration. We analyzed cell migration of normal mouse C2C12 myoblasts that express P-cadherin using a “wound-healing like assay” in which migration is analyzed after removal of a physical barrier. We observed that P-cadherin expression in C2C12 myoblasts increased the speed, polarity, persistence and directionality of migration toward the free space of both cells at the border and cells into the sheet. Using monolayer stress microscopy we showed that P-cadherin increases inter-cellular stresses and force transmission across the cell sheet. According to those observations we concluded that P-cadherin induces CCM.Traction forces exerted by the cells on the substrate are important for cell migration. Using traction force microscopy, we demonstrated that P-cadherin expression increases the traction forces anisotropy specifically at the multicellular leading row. To better understand how these mechanical signals induce CCM, we studied both the organization of the focal adhesions and the spatio-temporal activity of Rho GTPase. We showed that P-cadherin expression activates Rac1 and Cdc42 which induces extensive focal adhesions remodeling at the leading edge of cells at the leading row. Rac1 and Cdc42 inhibition impaired P-cadherin-induced CCM, focal adhesion remodeling and forces generation. In conclusion, combining a detailed measurement of the parameters of cell migration with physical measure of the intercellular stresses and traction forces, we have shown that P-cadherin promotes collective behavior of cells during migration through Rac1 and Cd42 activity. Also, those results provide evidence for mechano-transmission properties of P-cadherin during collective cell migration.

La sécrétion d'hormones et de neuropeptides par les cellules neuroendocrines est assurée par un processus d'exocytose, contrôlé notamment par les GTPases Rho. La compréhension des mécanismes moléculaires régulant la sécrétion neuroendocrine est primordiale. En effet, la majorité des cancers neuroendocrines tels que les phéochromocytomes, sont associés à une perturbation du processus de sécrétion. Actuellement, les mécanismes moléculaires qui induisent de telles perturbations de la sécrétion ainsi que l’impact de l’activité sécrétrice sur le développement des tumeurs neuroendocrines ne sont pas élucidés. Mes travaux de thèse proposent pour la première fois un lien fonctionnel direct entre l'activité sécrétrice des cellules et la vitesse de développement des phéochromocytomes ainsi qu’une altération des voies moléculaires impliquant certaines protéines Rho, en démontrant un lien entre la baisse de l’activité de Rac1 et Cdc42 observée dans les phéochromocytomes et la diminution de l’expression de leurs régulateurs ARHGEF1 et FARP1. / Neuroendocrine cells secrete hormones and neuropeptides through calcium-regulated exocytosis, controlled especially by Rho GTPases. Neuroendocrine tumours, such pheochromocytomas, are generally associated with a dysfunction of secretion. Although this aspect is well known by clinicians, it has never been explored at the molecular level. Moreover, the potential link between secretion and tumour development remains uninvestigated. Altogether, our results demonstrate for the first time the importance of secretion in tumor development of pheochromocytomas and an alteration of the Rho GTPase pathway, by demonstrating a link between the inhibition of Rac1 and Cdc42 activity observed in pheochromocytomas and the decrease of their activators ARHGEF1 and FARP1 expression.

O Corpo Ciliar (CC) é uma fonte de células tronco da retina de animais adultos, mas sua ativação permanece desconhecida. GTPases Rho são proteínas que reorganizam do citoesqueleto de actina, regulam vias de sinalização e transcrição gênica, sobrevivência celular e proliferação. Neste trabalho, investigamos a expressão das GTPases Rho nas células do CC e seu efeito na regulação do ciclo celular. As GTPases RhoA, RhoB e Rac1 foram expressas nas células do CC e sua ativação pelo ácido lisofosfatidico (LPA) aumentou a expressão dos genes progenitores retinianos Pax6 e Chx10. A inibição das proteínas por Toxina A de Clostridium difficile aumentou a proliferação no CC e potencializou o efeito proliferativo dos fatores de crescimento. A inibição especifica destas proteínas diminuiu a expressão dos transcritos de p21cip, p27kip, p16INK4a e p19INK4d e aumentou de Ki67, CiclinaA e D1. O estudo da via de Wnt indicou que Rac1 regulou os genes de componentes da degradação de -catenina e Lef1. Concluímos que a inativação das GTPases Rho induziu a proliferação das células progenitoras retinianas localizadas no CC e regulou a via de Wnt. Sua ativação induziu o perfil de célula progenitora, sugerindo uma nova ferramenta para o mecanismo de reparo retiniano. / Ciliary Body (CB) is a potential source of stem cells in the adult retina, but its activation is still unknown. Rho GTPases play a role in actin-based cytoskeleton reorganization, regulate signaling pathways and gene transcription, cell survival and cell proliferation. In this study we investigated the expression of Rho GTPases in CB cells and their role on cell cycle regulation. The GTPases RhoA, RhoB and Rac1 were present in CB cells and the activation by lysophosphatidic acid (LPA) increased the expression of the progenitor genes Pax6 and Chx10. The inhibition by Clostridium difficile Toxin A increased the proliferation of CB cells and potentiated the proliferative effect of growth factors. The specific inhibition decreased the expression of p21cip, p27kip, p16INK4a and p19INK4d as well as increased Ki67, cyclinA and D1 transcripts. The Wnt pathway study indicated that Rac1 regulated -catenin degradation genes components and Lef1. Taken together, the inactivation of Rho GTPases stimulated the proliferation of progenitor cells located in CB as well as regulate the Wnt signaling pathway. The proteins activation was correlated to progenitor profile induction. These different mechanisms may provide a potential new approach on retinal repair.