Orientadora : Profª. Drª. Lucélia Donatti / Coorientador : Prof. Dr. Edson Rodrigues / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 20/02/2017 / Inclui referências : p. 139-169 / Resumo: O gastrópode antártico Nacella concinna habita a zona entremarés da Antártica, uma região naturalmente instável, que apresenta flutuações termo-salinas diárias, além de ser vulnerável à ação de contaminantes de origem antrópica, como o despejo de efluentes de esgoto de estações científicas e navios. Somado a isso, os organismos que habitam essa região precisam lidar com os níveis naturalmente elevados de metais pesados. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo avaliar as respostas fisiológicas de N. concinna à variações termo-salinas de curto prazo, bem como verificar o efeito do esgoto da Estação Antártica Comandante Ferraz (EACF) sobre o metabolismo energético, nitrogenado e defesa antioxidante desse molusco. Também objetivamos avaliar o efeito direto de metais pesados sobre a atividade da arginase branquial e do pé muscular de N. concinna, bem como a distribuição tecidual e subcelular dessa enzima. Os bioensaios de temperatura e salinidade, ao longo do tempo, mostraram que o aquecimento e hipossalinidade modulam a defesa antioxidante, basicamente os níveis de SOD e G6PDH, de forma tecido-específica. No estresse hipossalino e térmico de curta duração, a defesa antioxidante glandular de N. concinna foi eficaz em prevenir lesões oxidativas em lipídeos e proteínas. O aquecimento é capaz de modular positivamente o metabolismo anaeróbio do pé muscular desse gastrópode. Contudo, nas brânquias, enquanto o aquecimento não modulou as enzimas do metabolismo energético, a hipossalinidade induziu resposta metabólica aeróbica. O estresse hipossalino elevou os níveis de AST e GDH no pé muscular, sugerindo a participação dessas enzimas na regulação osmótica desse tecido. Também foram observadas interações entre temperatura, salinidade e tempo, capazes de modular os níveis das enzimas analisadas nos três tecidos. Os níveis de ARG cerca de duas vezes superiores aos de ODH no pé muscular de N. concinna sugere a participação de ARG no catabolismo de L-arginina, durante a decomposição do "tampão energético" fosfo-Larginina. Apesar de ser considerado um bom biomonitor, a complexidade das respostas metabólicas de N. concinna, frente ao aquecimento e hipossalinidade, sugerem cautela na utilização dessas respostas como biomarcadores de mudanças naturais e antrópicas. Em relação ao efeito do esgoto, a indução de SOD, GST e CAT na glândula digestiva foi eficaz em prevenir danos oxidativos em lipídeos, mas não em proteínas na diluição de esgoto a 0,05% (v/v). A exposição ao esgoto foi capaz de elevar o potencial gerador de ATP aeróbio e anaeróbio das brânquias. Já no pé muscular o esgoto modulou positivamente a PFK, enzima reguladora da via glicolítica. Os estudos com metais pesados mostraram que as arginases branquial e do pé muscular de N. concinna apresentam características cinéticas distintas quanto ao KM e ação de cátions de metais pesados. Tanto a arginase branquial como a do pé muscular estão localizadas prioritariamente na fração citosólica dos tecidos. Também ficou evidente que as arginases das brânquias e do pé muscular são resistentes à inibição por cobre, o que sugere uma adaptação metabólica desse gastrópode, que pode ter contribuído para a ocupação de nichos naturalmente ricos em metais pesados. Palavras-chave: Nacella concinna. Antártica. Temperatura. Salinidade. Esgoto. Metais. / Abstract: The antarctic gastropod Nacella concinna inhabits the intertidal zone of Antarctica, a naturally unstable region that exhibits daily thermo-saline fluctuations, besides being vulnerable to the action of contaminants of anthropic origin, such as the discharge of sewage effluents from scientific stations and ships. In addition, organisms living in this region must deal with naturally high levels of heavy metals. In this context, the present study aimed to evaluate the physiological responses of N. concinna to shortterm thermo-saline variations, as well as to verify the effect of the Anarctic Station Comandante Ferraz (EACF) sewage on energy and nitrogen metabolism and antioxidant defense of this mollusk. We also aimed to evaluate the direct effect of heavy metals on the activity of the branchial and foot muscle arginase of N. concinna, as well as the tissue and subcellular distribution of this enzyme. Temperature and salinity bioassays, over time, have shown that heating and hyposalinity modulate the antioxidant defense, basically the levels of SOD and G6PDH, in a tissue-specific way. In short-term hyposaline and thermal stress, the antioxidant glandular defense of N. concinna was effective in preventing oxidative lesions in lipids and proteins. Heating is able to positively modulate the anaerobic metabolism of the foot muscle of this gastropod. However, in the gills, while heating did not modulate the enzymes of energy metabolism, hyposalinity induced an aerobic metabolic response. Hyposaline stress increased AST and GDH levels in the foot muscle, suggesting the participation of these enzymes in the osmotic regulation of this tissue. It was also observed interactions between temperature, salinity and time capable of modulating the levels of the enzymes analyzed in the three tissues. ARG levels about twice higher than that of ODH in the foot muscle of N. concinna suggest the participation of ARG in L-arginine catabolism during the decomposition of the phospho-L-arginine "energy buffer". In spite of being considered a good biomonitor, the complexity of N. concinna metabolic responses to heating and hyposalinity suggests caution in the use of these responses as biomarkers of natural and anthropogenic changes. Regarding the effect of the sewage, the induction of SOD, GST and CAT in the digestive gland was effective in preventing oxidative damage in lipids, but not in proteins in the dilution of 0.05% (v/v) of sewage. Exposure to the sewage was able to raise the aerobic and anaerobic ATP generating potential of the gills. In the foot muscle, the sewage positively modulated PFK, a glycolytic pathway regulating enzyme. Studies with heavy metals have shown that the branchial and foot muscle arginases of N. concinna have different kinetic characteristics regarding KM and action of heavy metal cations. Both the branchial and foot muscle arginases are located primarily in the cytosolic fraction of the tissues. It was also evident that the arginases of the gills and of the foot muscle are resistant to inhibition by copper, suggesting a metabolic adaptation of this gastropod, which may have contributed to the occupation of niches naturally rich in heavy metals. Keywords: Nacella concinna. Antarctica. Temperature. Salinity. Sewage. Metals.

Orientador : Drª. Lucélia Donatti - UFPR / Coorientador : Lars Tomanek, PhD. California Polytechnic State University, EUA / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 27/08/2015 / Inclui referências : f. 132-159 / Área de concentração : Biologia celular e molecular / Resumo: O impacto de metais sobre os organismos vivos pode ser evidenciado em diferentes níveis de organização biológica a partir de moléculas e células, chegando a comunidades e aos ecossistemas. A lapa Nacella conccina e encontradas na região litorânea e zona de infralitoral da Antártida onde na Baia do Almirantado se localiza a Estação Antártica Brasileira Comandante Ferraz (EACF), local deste estudo. Durante os experimentos N. concinna (N=6/metal/concentracao/tempo) foram expostos a duas concentrações de chumbo (0,9 PgL-1 e 3,0 PgL-1) e cobre (0,12 PgL-1 e 0,25 PgL-1) nos tempos de 12, 24, 48 horas para ambos os metais e 168 horas somente para o chumbo. A temperatura de 0°C e a salinidade de 34% foram mantidas constantes. As brânquias foram congeladas em nitrogênio liquido e analisadas através de técnicas de proteomica. Foram quantificadas as mudanças na abundancia de proteinas a partir de géis gerados por eletroforese 2D. As proteinas foram identificadas por espectrometria de massa tandem. Para as brânquias de N. concinna expostas ao chumbo e ao cobre um grupo semelhante de proteinas alteradas foi observado. Foram identificadas proteínas antioxidantes, incluindo a Mn-superoxido dismutase e a Ferri tina indicando maior produção de especies reativas de oxigênio. As chaperonas envolvidas na maturação de proteínas presentes no reticulo endoplasmático apresentaram alterações possivelmente devido a uma mudança no estado redox deste compartimento celular. A maior abundancia de subunidades do proteassoma pode evidenciar maiores taxas de desnaturação de proteínas pelo proteassoma. Os metais também levaram a alterações na anidrase carbonica, provavelmente decorrente de alterações no equilíbrio acida-base das células branquiais. Proteínas metabólicas, como a arginina quinase, a triose fosfato isomerase glicolitica e a enolase, bem como a piruvato desidrogenase, tiveram seu volume alterado, o que pode estar relacionado a uma maior taxa de renovação de ATP. Finalmente, observamos a alteração na abundancia de uma isoforma da Cdc42, uma proteína de sinalização com função de modificar componentes do citoesqueleto. Possíveis efeitos em cascata da alteração da Cdc42 incluem mudanças da miosina e paramiosina. Nós supomos que, a substituição de metais ligados a proteínas pelo chumbo ou cobre causou um aumento de ROS e um desafio acida-base em brânquias, provocando uma inibição de maturação de proteínas no reticulo endoplasmatico, um aumento no tamponamento de ATP por arginina quinase e proteínas glicoliticas, bem como mudanças na abundancia de Cdc42 que afetaram filamentos do citoesqueleto. Estes fatos colaboram na elucidacao das ligações entre o metabolismo, balanço energético e tolerância ao estresse em organismos antárticos, neste caso, a lapa antartica N. concinna. Palavras-chave: Antártica, anidrase carbonica, Cdc42, chaperoninas, metabolismo energético, metal, estresse oxidativo, homeostase proteica. / Abstract: The impact of metals on living organisms may be evidenced at different levels of biological organization from molecules and cells, reaching communities and ecosystems. The limpet Nacella conccina is found in the coastal region and subtidal zone of Antarctic, including the South Shetlands archipelago islands and the King George Island where is the Brazilian Antarctic Station Comandante Ferraz (EACF), local of this study. Samples of N. concinna were collected in Admiralty Bay at Punta Plaza (62 ° 04'14,5 "S, 58 ° 24'11,9" W) and Botany Point (62 ° 06'15 7 "S, 58 ° 21'14,0" W) during 2011 and 2012 austral summer. During the experiments specimens (n = 6 / metal / concentration / time) were exposed to two concentrations of lead (0.9 ?gL -1 and 3.0 ?gL-1) and copper (0.12 ?gL-1 and 0.25 ?gL-1) during 12, 24, 48 hours for both metls and 168 hours for lead. The temperature was 0 ° C and salinity was maintained constant at 34%. The gills were frozen in liquid nitrogen and analyzed by proteomic techniques. Changes in abundance of proteins were quantified in 2D gels generated by electrophoresis. Proteins were identified by tandem mass spectrometry. Gills exposed to lead and copper had a similar changed proteins. Antioxidant proteins were identified, including Mn-superoxide dismutase and ferritin indicating increased production of reactive oxygen species. The chaperone involved in the maturation of proteins in the endoplasmic reticulum showed significant differences possibly due to a change in redox state of this cellular compartment. The greater abundance of proteasome subunits may indicate higher rates of denaturation of proteins by the proteasome. Metals also led to a change in carbonic anhydrase, which may be due to changes in acidbase balance of gill cells. Metabolic proteins, such as arginine kinase, triose phosphate isomerase and glycolytic enolase and pyruvate dehydrogenase, had changed their volumes in gels, which can be related to a higher rate of ATP renewal. Finally, we note the change in the abundance of an isoform of cdc42, a signaling protein related to modify cytoskeletal structures. Possible downstream effects of cdc42 included possible shifts in myosin and paramyosin. We assume that the substitution of metals bound to proteins by lead or copper caused an increase of ROS and a challenge in acid based on gills, causing inhibition of the protein maturation in the endoplasmic reticulum, an increase in buffering ATP and the glycolytic protein arginine kinase, as well as changes in the abundance of cdc42 affecting cytoskeletal filaments. Facts those who collaborate in the elucidation of links between metabolism, energy balance and stress tolerance. Keywords: Antarctic, carbonic anhydrase, Cdc42, chaperonins, energy metabolism, ferritin, gills, heavy metal, oxidative stress, protein homeostasis.

Neritina zebra à um gastrÃpode comum em bancos de lama e Ãguas salobras. Este estudo tem como objetivos revisar o conteÃdo da literatura especializada e acrescentar informaÃÃes sobre a anatomia de Neritina zebra. Foram analisados os animais coletados no estuÃrio do rio Cearà - CE, no Parque Estadual do rio Cocà â CE e os espÃcimes tombados na coleÃÃo MalacolÃgica "Prof. Henry Ramos Matthews" (CMPHRM) da Universidade Federal do Cearà (UFC) e na coleÃÃo de Moluscos do Museu de Zoologia da Universidade de SÃo Paulo (MZUSP). A rÃdula foi observada e fotografada atravÃs de microscÃpio Ãptico e microscÃpio eletrÃnico de varredura (MEV). A protoconcha foi observada e fotografada atravÃs do MEV. N. zebra apresenta concha globosa, protoconcha com 1,5 voltas, teleoconcha com 3,5 voltas, lÃbio interno denteado, espira baixa, abertura semilunar. Concha apresentando vÃrias cores e vÃrios padrÃes de âziguezagueâ. A columela forma um septo transversal. O opÃrculo à calcÃrio e liso, com apÃfise bifurcada. O mÃsculo columelar à bem desenvolvido, com duas partes de tamanhos diferentes. BrÃnquia bipectinada. O osfrÃdio encontra-se à frente da membrana suspensÃria da brÃnquia, do lado esquerdo do manto. O coraÃÃo apresenta um Ãtrio e um ventrÃculo. A rÃdula à do tipo rhipidoglossa, apresentando a fÃrmula geral .5.1.5.. EsÃfago e intestino longos. O intestino passa atravÃs da cavidade pericardial, estando envolvido pelo ventrÃculo. O sistema reprodutor masculino apresenta uma abertura genital, ducto espermÃtico longo e enrolado, glÃndula prostÃtica e pÃnis com formato laminar do lado direito da regiÃo cefÃlica. O sistema reprodutor feminino apresenta trÃs poros genitais (um vaginal, um âgonoporo principalâ e um âducto enigmÃticoâ), um saco de reforÃo, saco do espermatÃforo, ovÃrio com vÃrias vilosidades digitiformes paralelas, receptÃculo seminal e glÃndulas de albÃmen e da cÃpsula. / Neritina zebra is a common gastropod on mud bottom and brackish water. This study aims to review the literature and add information about the anatomy of Neritina zebra. We analyzed the animals collected in the estuary of the Cearà river â CE, in âParque Estadual do rio CocÃâ - CE and specimens deposited in âColeÃÃo MalacolÃgica Prof. Henry Ramos Matthews" (CMPHRM) of âUniversidade Federal do CearÃâ (UFC) and âColeÃÃo de Moluscos do Museu de Zoologia da Universidade de SÃo Pauloâ (MZUSP). The radula was observed and photographed through optic and scanning electron microscope (SEM). The protoconch was observed and photographed by SEM. N. zebra presents globose shell, protoconch with 1.5 whorls, teleoconch with 3.5 whorls, small teeth on inner lip, low spire, semilunar aperture. Shells present several different colors and patterns of zigzag. The columella forms a transversal septum. Operculum calcareous, smooth, with bifurcated apophysis. The columellar muscle is well developed, with two parts of different sizes. Bipectinate gill. The osphradium is in front of the suspensory membrane of the gill, on the left side of the mantle. The heart presents one auricle and one ventricle. The radula is rhipidoglossa type, presenting the general formula .5.1.5. . Long esophagus and intestine. The intestine passes through the pericardial cavity, enwrapped by the ventricle. The male reproductive system presents one genital opening, very long and coiled spermatic duct, prostate gland and penis with laminar shape on the right side of the cephalic region. The female reproductive system has three genital pores (vaginal pore, main female gonopore and enigmatic duct), a reinforcement sac, a spermatophore sac, an ovary with many small parallel digitiformes vilosities, a seminal receptacle and the albumen and capsule glands.