A Doença de Gaucher (DG) é a doença de depósito mais comum. É causada pela deficiência da enzima -glicosidase (-gli), necessária para o catabolismo intralisossômico do glicocerebrosídio, sendo herdada de modo autossômico recessivo. Esta deficiência resulta em um acúmulo de glicocerebrosídio nos lisossomos de macrófagos derivados de monócitos em tecidos do sistema reticuloendotelial. No período de janeiro de 1982 a outubro de 2003 foram analisadas, bioquimicamente, 1081 amostras de sangue de pacientes com suspeita de DG. Nestas amostras foram medidas as atividades das enzimas -gli e quitotriosidase (QT). Foram diagnosticados 412 casos de DG (38,1%), sendo na sua grande maioria DG tipo 1. As regiões brasileiras de maior concentração destes pacientes foram as regiões sudeste, sul e nordeste. A idade média destes pacientes ao diagnóstico foi de 19 anos. A atividade da -gli de indivíduos com DG foi em média 10,7% daquela apresentada pelos indivíduos normais. A QT apresentou-se em média 269 vezes mais elevada no grupo de pacientes com DG. Nos 669 casos em que não foi confirmada a presença de DG, houve pacientes com Doença de Niemann-Pick tipos A, B ou C (44 casos), possíveis heterozigotos para DG (59 casos), pacientes com outras DL (19 casos) e outros EIM (3 casos) Em 508 casos não foi encontrado nenhum distúrbio metabólico. Foram analisadas as mutações de 128 indivíduos com DG, sendo que o genótipo N370S/L444P foi o mais freqüente (48,4%). Este estudo mostra que o protocolo bioquímico empregado foi eficiente para a detecção de DG, uma doença que se mostra bastante freqüente também no Brasil. Neste estudo também foi possível caracterizar o comportamento do pH ótimo, termoestabilidade, Km e Vmax da -gli em leucócitos de pacientes com DG e heterozigotos obrigatórios com diferentes genótipos comparando-os com indivíduos normais. Os resultados mostraram um comportamento diferente da enzima nos três grupos analisados. Esse comportamento variou conforme a mutação presente nos indivíduos. Não foi observado somente um único pH ótimo nos 3 grupos. A enzima de indivíduos normais mostrou uma faixa de pH de 5,0 a 5,4, a de heterozigotos, um único pH ou uma estreita faixa e a de indivíduos com DG, 2 picos de pH ótimo. O Km e a Vmax da enzima de heterozigotos variou desde igual até maior que aquele da enzima normal. Quando comparamos a enzima de indivíduos normais com aquela de pacientes com DG, observamos que nos genótipos N370S/N370S e N370S/IVS2+1 o Km foi maior e no grupo N370S/L444P o Km foi significativamente menor. A Vmax nos indivíduos com DG apresentou valores menores em relação aos indivíduos normais. A enzima de leucócitos de indivíduos normais, heterozigotos e homozigotos para DG, foi inativada a 60ºC. As diferenças de comportamento entre as enzimas dos três grupos analisados permitiram discriminá-los, ou seja, a enzima de indivíduos homozigotos apresentou uma maior atividade residual após 60 minutos de pré-incubação, sendo mais termoestável que os grupos de indivíduos normais e heterozigotos. . A mutação N370S produziu uma enzima mais estável e cataliticamente mais ativa que aquela da mutação L444P. Esta por sua vez, foi mais estável e ativa do que a mutação D409H. O mesmo aconteceu com os indivíduos homozigotos para DG, onde o comportamento bioquímico da b-gli foi determinado pela presença do alelo N370S. Portanto há um gradiente de estabilidade que vai de uma condição mais estável a uma condição menos estável. Este gradiente assemelha-se aquele da classificação do fenótipo clínico da DG. Os resultados nos permitem correlacionar diretamente a mutação N370S, mais estável cineticamente, com a forma clínica não neurológica da doença e a mutação menos estável cataliticamente (D409H) com a forma clínica neurológica da DG. Através deste trabalho foi possível obter informações sobre o comportamento da proteína em cada mutação estudada, seja ela em homo ou em heterozigose e estes dados podem colaborar para uma melhor distinção entre a enzima de indivíduos normais, heterozigotos e homozigotos para DG.

Introdução: A Doença de Gaucher (DG) é causada pela atividade reduzida da enzima lisossomal glucocerebrosidase, o que leva ao acúmulo de glicocerebrosídeo nas células e a uma estimulação crônica do sistema imune. Células natural killer (NK) possuem um papel importante na resposta imune e sua atividade é alterada na DG. Os receptores KIR (Killer Immunoglobulin-like Receptors) regulam a atividade das células NK através da interação com moléculas de HLA (Human Leukocyte Antigen) de classe I das célulasalvo. Objetivo: Analisar a variabilidade dos genes KIR em uma coorte de pacientes com DG do Sul do Brasil, compará-las a um grupo controle e buscar associações com manifestações clínicas. Metodologia: Trinta e um pacientes com DG tipo I (24 com forma leve, 4 com forma moderada e 3 com forma grave) foram analisados e comparados a 250 controles saudáveis quanto a frequência dos genes HLA e KIR. Resultados/Discussão: Não houve diferença significativa nas frequências de variantes dos genes KIR entre os grupos. O alelo HLA B37 é mais frequente nos pacientes com DG do que no grupo controle (p=0,011). A idade de início dos sintomas mostrou associação com a combinação das variantes KIR2DL2 e KIR2DS2 com seu ligante HLA-C1 (p=0,038). Pacientes que apresentam a variante HLA-C2 parecem apresentar maior susceptibilidade a desenvolver bandas mono ou policlonais na eletroforese de proteínas (p=0,007, OR=21,3). Foi encontrada associação entre os alelos DR11 (p=0.008) e DR13 (p=0.011) e gravidade da doença. O alelo DR11 parece estar associado a comprometimento neurológico, enquanto o alelo DR13 ao desenvolvimento de osteonecrose. Conclusão: Nossos dados sugerem uma possível associação entre variantes dos genes KIR e HLA e a DG. Devem ser estudadas em outras coortes de pacientes já que parecem ser um fator modificador de fenótipo. / Background: Gaucher disease (GD) is caused by the reduced activity of a lysosomal enzyme glucocerebrosidase, which leads to the accumulation of glucocerebroside in the cells and a chronic stimulation of the immune system. Natural Killer (NK) cells play an important role in the immune response, and their activity is impaired in GD. Killer immunoglobulin-like receptors (KIR) regulate the activity of NK cells through an interaction with specific human leukocyte antigen (HLA) class I molecules on target cells. Objectives: To analyze the variability of KIR genes in a Southern Brazilian sample of GD patients, to compare it with controls, and to look for associations with clinical manifestations. Methodology: Thirty one GD type I patients (24 mild, 4 moderate, and 3 severe) were analyzed and compared to 250 healthy controls regarding the frequency of HLA and KIR genes. Results/Discussion: There was no significative difference in the frequencies of KIR gene variants between the groups. The HLA B37 allele is more frequent in patients with GD than in control group (p=0.011). The age of onset of symptoms was associated with KIR2DL2 and KIR2DS2 combination with the ligand HLA-C1 (p=0.038). Patients who have the HLA-C2 variant appear to have more mono/polyclonal bands in protein electrophoresis (p=0.007, OR=21.3). An association between the DR11 (p=0.008) and DR13 (p=0.011) alleles and disease severity was found. The DR11 allele appears to be associated with neurological impairment, while the DR13 allele to the development of osteonecrosis. Conclusion: Our data suggest a possible association between KIR genes and HLA genes and GD. They should be studied in other cohorts of GD patients as they seem to be a phenotype modifying factor.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第19178号 / 医博第4020号 / 新制||医||1010(附属図書館) / 32170 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 髙橋 淳, 教授 渡邉 大, 教授 村井 俊哉 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

A Doença de Gaucher (DG) é a Doença Lisossômica de Depósito mais frequente com prevalência de 1:50.000. Ela é causada pela deficiência da betaglicosidase ácida (GBA), gerando acúmulo de glicosilceramidas (glicocerebrosídio) nos lisossomos. Outra enzima relacionada é a quitotriosidase (QT), onde a atividade está aumentada nos pacientes em até 1000 vezes. Atualmente o diagnóstico é baseado na atividade específica de enzimas em leucócitos ou fibroblastos. O uso de sangue impregnado em papel filtro (SPF) vem sendo ampliado, porém somente como forma de triagem, pois não há forma validada de estabelecer a atividade específica da enzima. A utilização de sangue em papel filtro tem diversas vantagens, tais como: fácil transporte, fácil armazenagem das amostras, menor volume de reação e segurança de manipulação das amostras. Esse estudo tem como objetivo validar técnicas fluorimétricas para o estabelecimento da atividade específica da GBA e QT em sangue impregnado em papel filtro eluido com tampão universal (20 mmol/L de fosfato de sódio, pH 7,0) através da correção do volume amostral pela quantificação de proteínas totais. Além disso, foram miniaturizadas as técnicas padrão para a triagem em SPF e as técnicas confirmatórias padrão ouro em leucócitos da DG. Foram estabelecidos novos valores de referência para todas as técnicas estabelecidas. Foi possível diferenciar os controles saudáveis dos pacientes com DG utilizando as técnicas miniaturizadas em SPF e leucócitos. A atividade específica em SPF se mostrou valida e os coeficientes de variação foram considerados aceitáveis. A estabilidade enzimática foi analisada por 21 dias de armazenamento a 4°C e foi observado que a há um decaimento da atividade da GBA, mas não da QT. Deste modo a atividade específica em SPF pode ser utilizada de forma confiável como método de triagem e confirmação do diagnóstico de DG. / Gaucher disease (GD) is the most frequent Lysosomal Storage Disorder with a prevalence of 1:50,000. It is caused by the deficiency of acid betaglucosidase (GBA), generating glucosylceramide (glucocerebroside) accumulation in the lysosomes. Another enzyme related to GD is chitotriosidase (CT), which activity is increased in patients up to 1000 times. Currently the diagnosis is based on the specific activity of enzymes in leukocytes or fibroblasts. The use of dried blood spots (DBS) has been extended, but only as screening, because there is no validated specific activity of the enzymes. The use of DBS has several advantages, such as easy transport and easy storage of samples, smaller reaction volume and safety of handling samples. This study aims to validate fluorometric techniques for establishing specific activity of the GBA and CT in DBS eluted with universal buffer (20 mmol/L sodium phosphate, pH7.0) by correcting for sample volume quantification of total protein. Moreover, standard screening techniques in DBS and standard diagnosis techniques in leukocytes for GD have been miniaturized. New reference values and cut-off points were established for all techniques. It was possible to differentiate healthy controls from patients with GD using miniaturized techniques in DBS and leukocytes. The specific activity of DBS proved valid and coefficients of variation were acceptable. The enzymatic stability was analyzed by 21 days of storage at 4° C and it was observed that there is a decrease of the activity of GBA, but not of CT. Thus the specific activity on DBS can be used as a reliable screening method and as diagnosis of GD.

A Doença de Gaucher (DG) é a Doença Lisossômica de Depósito mais frequente com prevalência de 1:50.000. Ela é causada pela deficiência da betaglicosidase ácida (GBA), gerando acúmulo de glicosilceramidas (glicocerebrosídio) nos lisossomos. Outra enzima relacionada é a quitotriosidase (QT), onde a atividade está aumentada nos pacientes em até 1000 vezes. Atualmente o diagnóstico é baseado na atividade específica de enzimas em leucócitos ou fibroblastos. O uso de sangue impregnado em papel filtro (SPF) vem sendo ampliado, porém somente como forma de triagem, pois não há forma validada de estabelecer a atividade específica da enzima. A utilização de sangue em papel filtro tem diversas vantagens, tais como: fácil transporte, fácil armazenagem das amostras, menor volume de reação e segurança de manipulação das amostras. Esse estudo tem como objetivo validar técnicas fluorimétricas para o estabelecimento da atividade específica da GBA e QT em sangue impregnado em papel filtro eluido com tampão universal (20 mmol/L de fosfato de sódio, pH 7,0) através da correção do volume amostral pela quantificação de proteínas totais. Além disso, foram miniaturizadas as técnicas padrão para a triagem em SPF e as técnicas confirmatórias padrão ouro em leucócitos da DG. Foram estabelecidos novos valores de referência para todas as técnicas estabelecidas. Foi possível diferenciar os controles saudáveis dos pacientes com DG utilizando as técnicas miniaturizadas em SPF e leucócitos. A atividade específica em SPF se mostrou valida e os coeficientes de variação foram considerados aceitáveis. A estabilidade enzimática foi analisada por 21 dias de armazenamento a 4°C e foi observado que a há um decaimento da atividade da GBA, mas não da QT. Deste modo a atividade específica em SPF pode ser utilizada de forma confiável como método de triagem e confirmação do diagnóstico de DG. / Gaucher disease (GD) is the most frequent Lysosomal Storage Disorder with a prevalence of 1:50,000. It is caused by the deficiency of acid betaglucosidase (GBA), generating glucosylceramide (glucocerebroside) accumulation in the lysosomes. Another enzyme related to GD is chitotriosidase (CT), which activity is increased in patients up to 1000 times. Currently the diagnosis is based on the specific activity of enzymes in leukocytes or fibroblasts. The use of dried blood spots (DBS) has been extended, but only as screening, because there is no validated specific activity of the enzymes. The use of DBS has several advantages, such as easy transport and easy storage of samples, smaller reaction volume and safety of handling samples. This study aims to validate fluorometric techniques for establishing specific activity of the GBA and CT in DBS eluted with universal buffer (20 mmol/L sodium phosphate, pH7.0) by correcting for sample volume quantification of total protein. Moreover, standard screening techniques in DBS and standard diagnosis techniques in leukocytes for GD have been miniaturized. New reference values and cut-off points were established for all techniques. It was possible to differentiate healthy controls from patients with GD using miniaturized techniques in DBS and leukocytes. The specific activity of DBS proved valid and coefficients of variation were acceptable. The enzymatic stability was analyzed by 21 days of storage at 4° C and it was observed that there is a decrease of the activity of GBA, but not of CT. Thus the specific activity on DBS can be used as a reliable screening method and as diagnosis of GD.

A Doença de Gaucher (DG) é a Doença Lisossômica de Depósito mais frequente com prevalência de 1:50.000. Ela é causada pela deficiência da betaglicosidase ácida (GBA), gerando acúmulo de glicosilceramidas (glicocerebrosídio) nos lisossomos. Outra enzima relacionada é a quitotriosidase (QT), onde a atividade está aumentada nos pacientes em até 1000 vezes. Atualmente o diagnóstico é baseado na atividade específica de enzimas em leucócitos ou fibroblastos. O uso de sangue impregnado em papel filtro (SPF) vem sendo ampliado, porém somente como forma de triagem, pois não há forma validada de estabelecer a atividade específica da enzima. A utilização de sangue em papel filtro tem diversas vantagens, tais como: fácil transporte, fácil armazenagem das amostras, menor volume de reação e segurança de manipulação das amostras. Esse estudo tem como objetivo validar técnicas fluorimétricas para o estabelecimento da atividade específica da GBA e QT em sangue impregnado em papel filtro eluido com tampão universal (20 mmol/L de fosfato de sódio, pH 7,0) através da correção do volume amostral pela quantificação de proteínas totais. Além disso, foram miniaturizadas as técnicas padrão para a triagem em SPF e as técnicas confirmatórias padrão ouro em leucócitos da DG. Foram estabelecidos novos valores de referência para todas as técnicas estabelecidas. Foi possível diferenciar os controles saudáveis dos pacientes com DG utilizando as técnicas miniaturizadas em SPF e leucócitos. A atividade específica em SPF se mostrou valida e os coeficientes de variação foram considerados aceitáveis. A estabilidade enzimática foi analisada por 21 dias de armazenamento a 4°C e foi observado que a há um decaimento da atividade da GBA, mas não da QT. Deste modo a atividade específica em SPF pode ser utilizada de forma confiável como método de triagem e confirmação do diagnóstico de DG. / Gaucher disease (GD) is the most frequent Lysosomal Storage Disorder with a prevalence of 1:50,000. It is caused by the deficiency of acid betaglucosidase (GBA), generating glucosylceramide (glucocerebroside) accumulation in the lysosomes. Another enzyme related to GD is chitotriosidase (CT), which activity is increased in patients up to 1000 times. Currently the diagnosis is based on the specific activity of enzymes in leukocytes or fibroblasts. The use of dried blood spots (DBS) has been extended, but only as screening, because there is no validated specific activity of the enzymes. The use of DBS has several advantages, such as easy transport and easy storage of samples, smaller reaction volume and safety of handling samples. This study aims to validate fluorometric techniques for establishing specific activity of the GBA and CT in DBS eluted with universal buffer (20 mmol/L sodium phosphate, pH7.0) by correcting for sample volume quantification of total protein. Moreover, standard screening techniques in DBS and standard diagnosis techniques in leukocytes for GD have been miniaturized. New reference values and cut-off points were established for all techniques. It was possible to differentiate healthy controls from patients with GD using miniaturized techniques in DBS and leukocytes. The specific activity of DBS proved valid and coefficients of variation were acceptable. The enzymatic stability was analyzed by 21 days of storage at 4° C and it was observed that there is a decrease of the activity of GBA, but not of CT. Thus the specific activity on DBS can be used as a reliable screening method and as diagnosis of GD.

Glucosidases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações glicosídicas liberando unidades monossacarídicas de um terminal não redutor de um oligossacarídeo ou glicoconjugado. Iminoaçúcares são alcalóides piperidínicos polihidroxilados isolados de plantas (gênero Morus) e microrganismos (Bacillus), como nojirimicina (NJ) (1) e 1-desoxinojirimicina (DNJ) (2), os quais são descritos como inibidores de glucosidase. O potencial uso destes inibidores no tratamento de infecções virais, crescimento tumoral, metástases, diabetes, doença de Gaucher e osteoartrite tem motivado a comunidade científica na busca por novos derivados iminoaçúcares. Desse modo, a síntese de pseudodissacarídeos, contendo ambos resíduos de iminoaçúcar e glicopiranose, constitui uma estratégia interessante de obtenção desses derivados, apesar dos desafios envolvidos na geração da ligação entre estes dois açúcares. Por esta razão, foi utilizada a estratégia de click chemistry como uma ferramenta para introduzir uma ponte de grupo 1,2,3-triazol entre os açúcares a partir do acoplamento de azido-glicosídeo com N-propargil-iminoaçúcar. Desta forma, a síntese do iminoaçúcar N-propargílico (73), com função acetileno terminal, foi realizada em cinco etapas e foi usado na reação de cicloadição 1,3- dipolar com três derivados glicosídicos contendo grupo azido nas posições anomérica (C-1), C-3 ou C-6. A partir desta reação CuAAC (Copper(I)-catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition), três novos pseudo-dissacarídeos (77, 81 e 85) foram sintetizados em rendimentos moderados e foram, então, avaliados em ensaios de - D-glucosidase isolada de Sacharomyces cerevisiae. Nestes testes preliminares, o composto 77 foi o mais ativo, o qual foi capaz de inibir a atividade da enzima em 40% a 1mM. Esses resultados encorajam a realização de novos experimentos, principalmente, a determinação de Ki e avaliação da atividade relativa à replicação do vírus HIV. Portanto, a obtenção destes pseudodissacarídeos trouxe uma contribuição importante no que diz respeito à química de carboidratos e também ao tratamento das doenças citadas. / Glucosidases are enzymes that catalyze the hydrolysis of glycosidic bonds releasing monosaccharide units from a non-reducing end of an oligosaccharide or glycoconjugate. Iminosugars are polihydroxilate piperidinic alkaloids isolated from plants (Morus alba) and microorganisms (Bacillus), such as nojirimicin (NJ) (1) and 1- deoxynojirimicin (2), which are described as glucosidase inhibitors. The potential use of these inhibitors in the treatment of viral infection, tumoral growing, metastasis, diabetes, Gaucher´s disease and osteoarthritis has stimulated the scientific community on the search for novel iminosugar derivatives. Thereby, the synthesis of pseudodisaccharides, having both iminosugar and glycopyranose residues, represents an interesting strategy to obtain these derivatives, despite the challenges involved in generating the link between these two sugars. For this reason, we have used click chemistry as a tool to introduce a 1,2,3-triazole bridge between the sugars from the coupling of azide-glycosides with N-propargyl-iminosugar. Thus, the synthesis of N-propargyl-iminosugar (73), containing the terminal acetylene function, was performed in five steps, and was used in the 1,3-dipolar cycloaddition reaction with three glycosidic derivatives containing the azide group at anomeric (C-1), C-3 or C-6 positions. By applying this CuAAC (Copper(I)-catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition), three novel pseudo-disaccharides (77, 81 and 85) were synthesized in moderate yields and then, evaluated in -D-glucosidase assays isolated from Sacharomyces cerevisiae. In these preliminary test, compound 77 was the most active from the series, which was able to inhibit 40% of the enzyme activity at 1 mM. These results encourage us to perform new experiments, notably the determination of Ki and evaluation towards HIV replication. Thus, a contribution regarding carbohydrate chemistry and treatment of the supracited diseases was achieved by the synthesis of these pseudodisaccharides.

A produção de proteínas recombinantes, principalmente para uso farmacêutico, tem sido intensamente estudada, juntamente com suas propriedades físico-químicas, o que possibilita uma melhor escolha da técnica de purificação, e assim, evitar perdas no rendimento e custos elevados. A glicocerebrosidase (GCR) é uma enzima lisossomal, e sua deficiência ocasiona um distúrbio autossômico recessivo denominado doença de Gaucher. Atualmente o tratamento para essa patologia é por meio da Terapia de Reposição Enzimática (TRE), a qual tem sido realizada com grande êxito. Tendo em vista fornecer dados que possam auxiliar na redução do número de etapas cromatográficas no processo de downstream, este trabalho teve como objetivo, a purificação da GCR expressa por células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), em meio livre de soro fetal bovino (SFB). Para se alcançar tais resultados, realizou-se o cultivo das células CHO-GCR em meio quimicamente definido livre de SFB (CHO-S-SFM II). Foram realizadas três técnicas cromatográficas (troca iônica, interação hidrofóbica e afinidade), com base em suas propriedades físico-químicas. E para o ensaio da atividade enzimática, foi utilizado o substrato fluorogênico 4-Methylumbeliferyl β-D-glucopyranoside (4MU-G). As células CHO-GCR cultivadas em meio CHO-S-SFM II, apresentando viabilidade maior que 95%, e produção da GCR ativa, durante todo o período de cultivo. Os protocolos aplicados para a purificação da GCR, não apresentaram resultados significativos. Com o volume não retido após cromatografia por interação hidrofóbica, se estimou os valores de KM 2,13 e VMAX 0,0295 UFR/h para as constantes cinéticas da GCR. A diálise no processo de purificação mostrou ser uma etapa necessária para a atividade enzimática da GCR. No cultivo das células CHO-GCR para a formação do banco de trabalho, nos meios RPMI 1640 e α-MEM, ambos com a adição de 10% SFB, não houve diferença significativa no crescimento entre eles, e apresentaram 100% de viabilidade durante todo o período de cultivo. Porém, ao analisar de forma isolada a fase exponencial de cada curva, notou-se que às células cultivadas no meio RPMI 1640, apresentaram taxa de crescimento superior, às cultivadas em meio α-MEM. Concluiu-se que a expressão da GCR em meio livre de SFB, proporciona amostras menos complexas, em relação aos meios de cultura que necessitam de suplementação com SFB, o que pode reduzir o número de etapas cromatográficas, melhorando o rendimento e a redução da perda da atividade da GCR. O meio basal RPMI 1640 com a adição de SFB foi uma alternativa satisfatória para o cultivo das células CHO-GCR. Este estudo forneceu dados que podem contribuir para a melhoria do processo de purificação da GCR. Novas pesquisas podem ser desenvolvidas a fim de melhorar o processo de purificação da GCR. / The production of recombinant proteins, mainly for pharmaceutical use, has been intensively studied along with its physico-chemical properties, which allows a better choice of the purification technique, and thus avoid losses in yield and high costs. Glucocerebrosidase (GCR) is a lysosomal enzyme, and its deficiency causes an autosomal recessive disorder called Gaucher\'s disease. Currently the treatment for this pathology is through Enzymatic Replacement Therapy (ERT), which has been successfully performed. In order to provide data that may help reducing the number of chromatographic steps in the downstream process, this work aimed to purify GCR expressed by Chinese Hamster Ovary (CHO) cells in fetal bovine serum free (FBS). To achieve such results, the CHO-GCR cells were cultured in chemically defined Serum-free medium (CHO-S-SFM II). Three chromatographic techniques (ion exchange, hydrophobic interaction and affinity) were performed, based on their physicochemical properties. And for the enzymatic activity assay, the fluorogenic substrate 4-Methylumbeliferyl β-D-glucopyranoside (4MU-G) was used. CHO-GCR cells cultured in CHO-S-SFM II medium, presenting viability greater than 95% and GCR production active, throughout the culture period. The protocols applied for GCR purification did not present significant results. With the volume not retained after chromatography by hydrophobic interaction, KM values of 2.13 and VMAX 0.0295 UFR/h were estimated for GCR kinetic constants. Dialysis in the purification process was shown to be a step necessary for the enzymatic activity of GCR. In the culture of the CHO-GCR cells for the formation of the working bank, in the media RPMI 1640 and α-MEM, both with the addition of 10% FBS, there was no significant growth difference between them, and they showed 100% viability during all the growing period. However, when analyzing in isolation, the exponential phase of each curve, it was observed that the cells grown in RPMI 1640 medium showed higher growth rates, tham grown in α-MEM medium. It was concluded that the expression of GCR in serum-free medium provides less complex samples, relative to the culture media requiring FBS supplementation, which may reduce the number of chromatographic steps, improving yield and loss reduction of GCR activity. The basal medium RPMI 1640 with the addition of FBS was a satisfactory alternative for culturing the CHO-GCR cells. This study provided data that may contribute to the improvement of the GCR purification process. New research can be developed to improve the GCR purification process.

A produção de proteínas recombinantes, principalmente para uso farmacêutico, tem sido intensamente estudada, juntamente com suas propriedades físico-químicas, o que possibilita uma melhor escolha da técnica de purificação, e assim, evitar perdas no rendimento e custos elevados. A glicocerebrosidase (GCR) é uma enzima lisossomal, e sua deficiência ocasiona um distúrbio autossômico recessivo denominado doença de Gaucher. Atualmente o tratamento para essa patologia é por meio da Terapia de Reposição Enzimática (TRE), a qual tem sido realizada com grande êxito. Tendo em vista fornecer dados que possam auxiliar na redução do número de etapas cromatográficas no processo de downstream, este trabalho teve como objetivo, a purificação da GCR expressa por células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), em meio livre de soro fetal bovino (SFB). Para se alcançar tais resultados, realizou-se o cultivo das células CHO-GCR em meio quimicamente definido livre de SFB (CHO-S-SFM II). Foram realizadas três técnicas cromatográficas (troca iônica, interação hidrofóbica e afinidade), com base em suas propriedades físico-químicas. E para o ensaio da atividade enzimática, foi utilizado o substrato fluorogênico 4-Methylumbeliferyl β-D-glucopyranoside (4MU-G). As células CHO-GCR cultivadas em meio CHO-S-SFM II, apresentando viabilidade maior que 95%, e produção da GCR ativa, durante todo o período de cultivo. Os protocolos aplicados para a purificação da GCR, não apresentaram resultados significativos. Com o volume não retido após cromatografia por interação hidrofóbica, se estimou os valores de KM 2,13 e VMAX 0,0295 UFR/h para as constantes cinéticas da GCR. A diálise no processo de purificação mostrou ser uma etapa necessária para a atividade enzimática da GCR. No cultivo das células CHO-GCR para a formação do banco de trabalho, nos meios RPMI 1640 e α-MEM, ambos com a adição de 10% SFB, não houve diferença significativa no crescimento entre eles, e apresentaram 100% de viabilidade durante todo o período de cultivo. Porém, ao analisar de forma isolada a fase exponencial de cada curva, notou-se que às células cultivadas no meio RPMI 1640, apresentaram taxa de crescimento superior, às cultivadas em meio α-MEM. Concluiu-se que a expressão da GCR em meio livre de SFB, proporciona amostras menos complexas, em relação aos meios de cultura que necessitam de suplementação com SFB, o que pode reduzir o número de etapas cromatográficas, melhorando o rendimento e a redução da perda da atividade da GCR. O meio basal RPMI 1640 com a adição de SFB foi uma alternativa satisfatória para o cultivo das células CHO-GCR. Este estudo forneceu dados que podem contribuir para a melhoria do processo de purificação da GCR. Novas pesquisas podem ser desenvolvidas a fim de melhorar o processo de purificação da GCR. / The production of recombinant proteins, mainly for pharmaceutical use, has been intensively studied along with its physico-chemical properties, which allows a better choice of the purification technique, and thus avoid losses in yield and high costs. Glucocerebrosidase (GCR) is a lysosomal enzyme, and its deficiency causes an autosomal recessive disorder called Gaucher\'s disease. Currently the treatment for this pathology is through Enzymatic Replacement Therapy (ERT), which has been successfully performed. In order to provide data that may help reducing the number of chromatographic steps in the downstream process, this work aimed to purify GCR expressed by Chinese Hamster Ovary (CHO) cells in fetal bovine serum free (FBS). To achieve such results, the CHO-GCR cells were cultured in chemically defined Serum-free medium (CHO-S-SFM II). Three chromatographic techniques (ion exchange, hydrophobic interaction and affinity) were performed, based on their physicochemical properties. And for the enzymatic activity assay, the fluorogenic substrate 4-Methylumbeliferyl β-D-glucopyranoside (4MU-G) was used. CHO-GCR cells cultured in CHO-S-SFM II medium, presenting viability greater than 95% and GCR production active, throughout the culture period. The protocols applied for GCR purification did not present significant results. With the volume not retained after chromatography by hydrophobic interaction, KM values of 2.13 and VMAX 0.0295 UFR/h were estimated for GCR kinetic constants. Dialysis in the purification process was shown to be a step necessary for the enzymatic activity of GCR. In the culture of the CHO-GCR cells for the formation of the working bank, in the media RPMI 1640 and α-MEM, both with the addition of 10% FBS, there was no significant growth difference between them, and they showed 100% viability during all the growing period. However, when analyzing in isolation, the exponential phase of each curve, it was observed that the cells grown in RPMI 1640 medium showed higher growth rates, tham grown in α-MEM medium. It was concluded that the expression of GCR in serum-free medium provides less complex samples, relative to the culture media requiring FBS supplementation, which may reduce the number of chromatographic steps, improving yield and loss reduction of GCR activity. The basal medium RPMI 1640 with the addition of FBS was a satisfactory alternative for culturing the CHO-GCR cells. This study provided data that may contribute to the improvement of the GCR purification process. New research can be developed to improve the GCR purification process.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:13:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RigobertoGC_DISSERT.pdf: 2462609 bytes, checksum: 1753126d41dc7df59645485b6308c3f5 (MD5) Previous issue date: 2011-05-30 / Background. Gaucher Disease (GD) is a hereditary lysosomal storage disorder characterized by the accumulation of glucosylceramide, mainly in the cells of the reticuloendothelial system, due to a deficiency of the enzyme acid &#946;-glucosidase (GBA). Diagnosis is usually based on measurement of GBA activity in peripheral leukocytes. The purpose of this study was to evaluate the ability of screening for GBA and chitotriosidase activity using Dried Blood Spots on Filter Paper (DBS-FP) to identify individuals at high risk for GD in high-risk populations such as that of Tabuleiro do Norte, a small town in Northeastern Brazil. Methods. Between June 1, 2007 and May 31, 2008, 740 consented residents and descendants of traditional families from Tabuleiro do Norte were submitted to screening with DBS-FP. Subjects with GBA activity <2.19 nmol/h/mL were referred to analysis of GBA and chitotriosidase activity in peripheral leukocytes and in plasma, respectively. Subjects at highest risk for GD (GBA activity in peripheral leukocytes <5.6 nmol/h/mg protein) were submitted to molecular analysis to confirm diagnosis. Results. Screening with DBS-FP identified 135 subjects (18.2%) with GBA activity <2.19 nmol/h/mL, 131 of whom remained in the study. In 10 of these (7.6%), GBA activity in leukocytes was 2.6 5.5 nmol/h/mg protein. Subsequent molecular analysis confirmed 6 cases of heterozygosity and 4 normals for GD. Conclusion. DBS-FP assay was shown to be an effective initial GD screening strategy for high-prevalence populations in developing regions. Diagnosis could not be established from GBA activity in leukocytes alone, but required confirmation with molecular analysis / A doen?a de Gaucher (DG) ? uma patologia de dep?sito de gordura nos lisossomos, de heran?a autoss?mica recessiva, caracterizada pelo ac?mulo do substrato glicosilceramida, principalmente nas c?lulas do sistema reticuloendotelial, em raz?o da defici?ncia da enzima &#946;-glicosidase ?cida (GBA). O diagn?stico, comumente, ? feito pela dosagem da atividade da GBA em leuc?citos perif?ricos. Tabuleiro do Norte (TN), Cear?, Brasil, ? um munic?pio com cerca de 28.000 habitantes com a preval?ncia da DG de 1:4.000 habitantes, possivelmente a mais elevada do Brasil. O objetivo da disserta??o ? avaliar o rastreamento para DG realizado em TN com base na an?lise das atividades enzim?ticas da GBA e da quitotriosidase em amostras Sangue Seco em Papel de Filtro (SSPF). Entre 01 de junho de 2007 a 31 de maio de 2008, 740 indiv?duos residentes e descendentes de fam?lias de TN participaram do rastreamento para DG a partir de amostras de SSPF. Indiv?duos com atividade GBA<2,19 nmol/h/mL foram selecionados para an?lise da atividade da GBA e da quitotriosidase em leuc?citos perif?ricos e no plasma, respectivamente. Os indiv?duos com maiores riscos de DG (atividade de GBA em leuc?citos perif?ricos <5,6 nmol/h/mg de prote?na) foram referenciados para an?lise molecular para confirma??o diagn?stica. A triagem com amostras de SSPF identificou 135 indiv?duos (18,2%) com atividade da GBA<2,19 nmol/h/mL, dos quais 131 permaneceram no estudo. Em dez destes (7,6%), a atividade da GBA em leuc?citos variou de 2,6-5,5 nmol/ h/mg de prote?na, considerados suspeitos da DG. A an?lise molecular subsequente revelou, entretanto, que se tratava de seis indiv?duos heterozigotos para a muta??o G377S e, em quatro deles, n?o foram identificadas muta??es da DG. A an?lise enzim?tica de amostras de SSPF mostrou ser uma estrat?gia eficaz de triagem da DG em popula??es com alto risco, mas a medida da atividade da GBA em leuc?citos deve ser realizada para confirma??o diagn?stica. O diagn?stico de DG em indiv?duos assintom?ticos n?o deve ser firmado baseando-se apenas na an?lise da atividade da GBA em leuc?citos, sendo necess?ria, tamb?m, a confirma??o diagn?stica pela an?lise molecular