The homoprotocatechuate degradative pathway of Escherichia coli C contains two isomerisation reactions with chemically similar intermediates, which were thought to be catalysed by distinct but genetically linked enzymes. The possibility that these two isomerases may have arisen from the same ancestral precursor, given their similar substrate structures and close physical location of their genes, was investigated by nucleotide sequencing and purification of the individual enzymes. The purified proteins are of very different subunit molecular weight and have been shown by kinetic measurements to be specific for their respective substrates. The two isomerisation events are separated by an enzyme catalysed decarboxylation and it has been shown that the second isomerisation and the decarboxylation reactions are distinct activities of the same protein subunit. Comparison of the amino acid sequence of the latter with that of the first isomerase of the pathway, reveals a very low level of similarity, suggesting that the two enzymes are unlikely to be derived from a common ancestor. Subcloning of the rest of hpc gene cluster has revealed that the gene order and direction of transcription are not as previously reported. All the genes for the pathway enzymes are transcribed in the same direction and are subject to negative regulation by a protein which appears to be transcribed in the opposite direction. A putative operator site to which the regulatory protein could bind has been located in the same region as a mapped promoter for the pathway genes, which also contains a binding site for the catabolite activator protein. Pairwise comparison of the amino acid sequences of the rest of the Hpc enzymes have shown only low levels of similarity. However, the single dehydrogenase enzyme of the pathway is similar to isoforms of human aldehyde dehydrogenase. The subcloning procedures used in this study have enabled high level expression of several of the pathway enzymes. This has enabled preliminary crystallographic analysis of the isomerase and decarboxylase/isomerase enzymes.

Um dos maiores objetivos na ciência atual é poder relacionar alterações nos genes a mudanças nas morfologias de organismos multicelulares. Além disso, é importante poder determinar se estas modificações foram obras do acaso ou se a seleção natural teve um papel central moldando a forma e o tamanho das criaturas vivas. A busca por nutrientes e sua utilização é uma das questões mais básicas para a sobrevivência de uma espécie. Em mamíferos a diversificação e especialização dos dentes para triturar, rasgar e mastigar diferentes tipos de comida possibilitou um incremento na geração de energia e representou uma inovação chave para a sobrevivência deste grupo. No presente estudo foi investigado o gene PAX9, que codifica um fator de transcrição chave no desenvolvimento da dentição de mamíferos. Para 125 indivíduos de origem ameríndia foi seqüenciado o exon 3 (138 pb), conjuntamente com as regiões intrônicas flanqueadoras 5´e 3´(232 pb e 220 pb, respectivamente) e os dados integrados com a informação disponível para a mesma região de 115 indivíduos de diferentes origens geográficas. Além disso, os exons 2, 3 e 4 (627 pb, 138 pb e 240 pb respectivamente) foram seqüenciados do DNA de 25 espécies de mamíferos e agrupados com os dados disponíveis de mais 29 espécies. Em humanos, o polimorfismo Ala240Pro possui uma distribuição variada entre os Ameríndios da América do Sul e está presente em Esquimós, Asiáticos e Europeus, mas não está presente entre os Afro-Americanos. O panorama que surge é que provavelmente a partir da saída da África a freqüência da mutação Ala240Pro aumenta, sendo possivelmente selecionada positivamente, o que pode estar relacionado à agenesia do terceiro molar, ou ainda, estar associado a genes conectados a adaptações ao frio. Com a chegada dos Ameríndios a regiões equatoriais, outro cenário parece dominar a evolução do exon 3, seja pela perda inicial da possível vantagem adaptativa, ou por causa da ação da deriva genética amplamente documentada nestas populações. Provavelmente em algum momento na história destas populações, fatores casuais poderiam ter sido preponderantes às restrições funcionais da proteína. Em geral, há uma maior variabilidade em nível de aminoácidos no exon 3 considerando todos os mamíferos estudados quando comparada com a do exon 2, ficando o exon 4 numa posição intermediária. O exon 3 seria um exemplo notável de uma situação que conferiria “evolvabilidade” ao PAX 9. / One of the main goals in science today is to establish the relation between gene changes and variations in the morphologies of multicellular organisms. In addition, it is important to determine if these changes were randomic or whether natural selection had a central role shaping the form and size of living beings. Searching for nutrients and its use is one of the most basic issues for a species survival. In mammals teeth diversification and specialization to grind, tear and chew different types of food were a key innovation that allowed an increase in the generation of energy and in the survival of this group. In this study an investigation was performed in the Paired box gene 9 (PAX9), which codes for a transcription factor that was a key factor in the development of mammal dentition. A total of 125 persons from Amerindian populations were studied by sequencing the PAX9 gene exon 3 (138 base pairs) as well as its 5´and 3´flanking intronic segments (232 bp and 220 bp, respectively) and the data integrated with the information available for the same genetic region from 115 individuals of different geographical origins. Moreover, exons 2, 3 and 4 (627 bp, 138 bp and 240 bp, respectively) were sequenced from DNA of 25 mammalian species and the results combined with the data available from other 29 additional species. In humans, the Ala240Pro polymorphism has a varied distribution among the South American Amerindians and is present in Eskimos, Asians and Europeans, but it is not present among Afro-Americans. The pattern that emerges is that probably starting with the out-Africa migration, and possibly as a result of positive selection, the Ala240Pro mutation frequency increased, that could be related to third molar agenesis or an associated gene connected to cold adaptation. With the Amerindian arrival again in equatorial regions, another pattern seems prevalent in exon 3 evolution, either due to the loss of a possible initial adaptive advantage, or to the action of genetic drift, widely documented in these populations. Probably at some point in the history of these populations, random factors could have been dominant despite the protein functional restrictions. In a general way, there is a greater variability at the amino acid level in exon 3 of all mammals considered when compared to exon 2, exon 4 occupying an intermediary position. Exon 3 would be a remarkable example of a condition that would confer PAX9 evolvability.

A coloração dos animais é uma característica que apresenta uma grande diversidade de fenótipos nas diferentes espécies. Diferentes abordagens podem ser utilizadas para o entendimento da diversidade na coloração existente nas espécies animais. Através da análise de genes candidatos as mutações responsáveis pela variação na coloração têm sido descritas em diferentes espécies, demonstrando o envolvimento de mecanismos moleculares variados na sua regulação. Este trabalho tem por objetivo a utilização de duas abordagens genéticas para o estudo da variação na coloração, a análise de genes candidatos e a predição computacional do efeito de polimorfismos não sinônimos. Em ovinos a coloração da lã é uma característica com importância na produção e para a identificação das raças. Polimorfismos em diferentes genes foram associados com a coloração da lã, entretanto, estes não foram estudados em muitas raças que apresentam variação fenotípica. A ovelha crioula é uma raça local existente no sul do Brasil que apresenta uma ampla diversidade de cores na lã, incluindo branco, preto e diversos tons intermediários. O gene receptor de melanocortina 1 (MC1R) foi previamente associado com a coloração na raça crioula, entretanto, outros genes também devem estar envolvidos na regulação da coloração na raça. Este trabalho avaliou a influência dos genes MC1R, ASIP (proteína sinalizadora agouti), TYRP1 (proteína relacionada à tirosinase 1) e KIT (homólogo do oncogene de sarcoma felino viral v-kit Hardy-Zuckerman 4) na coloração da lã na raça ovina crioula. Amostras de 410 animais de diferentes cores foram analisadas, sendo a variação na coloração da lã determinada por colorimetria. O padrão de herança dos fenótipos foi avaliado através de cruzamentos dirigidos entre indivíduos de diferentes cores. Os polimorfismos nos genes foram avaliados através da realização do sequenciamento e da análise de fragmentos e a quantificação da expressão do gene ASIP foi realizada por PCR em Tempo Real. Foi observada a associação significativa entre polimorfismos nos genes MC1R e ASIP e a cor da lã na raça crioula. O alelo dominante do gene MC1R, provocado pelas mutações p.M73K e p.D121N, foi encontrado apenas em indivíduos pigmentados. Este alelo resulta na ativação constitutiva do receptor, e consequentemente na produção constante de eumelanina, sendo epistático sobre o gene ASIP. Nos animais homozigotos para o alelo selvagem do MC1R a manifestação do fenótipo branco ocorreu somente nos portadores de um alelo contendo a duplicação do gene ASIP. Os portadores da duplicação do ASIP apresentaram níveis elevados de expressão do gene enquanto os homozigotos para a cópia simples do ASIP não expressaram o gene e apresentaram fenótipos pigmentados. Os resultados obtidos permitiram identificar a influência da interação epistática dos genes MC1R e ASIP na coloração da lã nos ovinos crioulos. O estudo de genes candidatos envolvidos na rota da pigmentação mostrou-se uma abordagem adequada para a análise da variação na coloração nestes animais. Espera-se que o conhecimento adquirido neste trabalho auxilie na criação e na preservação da raça através da manutenção da diversidade fenotípica existente. A avaliação computacional dos polimorfismos não sinônimos vem sendo utilizada recentemente a fim de determinar os SNPs que potencialmente afetam o funcionamento dos genes e identificar os mecanismos responsáveis por doenças complexas e pela variação nos fenótipos. A predição do efeito de polimorfismos nos genes utilizando ferramentas computacionais apresenta-se como uma abordagem alternativa para o estudo da genética da coloração. O gene MC1R humano apresenta uma grande quantidade de polimorfismos alguns dos quais foram associados com a variação na pigmentação e com suscetibilidade a tumores de pele. Entretanto, muitas das variações existentes no gene não foram avaliadas quanto às suas consequências funcionais e o seu papel na variação da pigmentação. Foi realizada a predição computacional dos polimorfismos não sinônimos no gene MC1R humano com o objetivo de identificar os nsSNPs mais provavelmente danosos, e estabelecer aqueles com potencial efeito na função do MC1R. Foram utilizadas 11 ferramentas de predição individuais (SIFT, MutPred, Polyphen-2, PROVEAN, I-Mutant 3.0, PANTHER, SNPs3D, Mutation Assessor, PhD-SNP, SNPs&GO e SNAP) e dois programas consenso (PON-P e PredictSNP 1.0) para a análise de 92 nsSNPs localizados no gene. Os programas utilizados baseiam-se em métodos evolutivos, estruturais e computacionais, resultando na identificação dos 14 nsSNPs mais danosos (L48P, R67W, H70Y, P72L, S83P, R151H, S172I, L206P, T242I, G255R, P256S, C273Y, C289R e R306H). Apesar das diferenças nos resultados de cada programa a combinação dos diferentes métodos permitiu diferenciar os polimorfismos neutros dos danosos, mostrando concordância com os programas consenso. A predição computacional demonstrou ser uma abordagem eficiente para a identificação dos alelos danosos no gene MC1R e para a priorização de mutações para posteriores estudos funcionais e populacionais. / Animal color is a characteristic that presents a large diversity of phenotypes. Different approaches can be used to understand the color diversity existing among and within species. Through analysis of candidate genes the mutations responsible for the color variation have been described in different species, showing the involvement of various molecular mechanisms of regulation. The objective of this work is the use of two genetic approaches to the study of color variation, the analysis of candidate genes and the computational prediction of non-synonym polymorphism effects (nsSNPs). In sheep the wool color is a feature with commercial importance and in identifying breeds. Polymorphisms in different genes have been associated with wool color, but they have not been studied in many breeds that show phenotypic variation regarding such a charactere. The Creole is a local breed from southern most Brazil that presents a wide range of wool color, varying from white to black, and including several intermediate hues. The melanocortin 1 receptor (MC1R) was previously associated with the wool color in the Creole, however, other genes might also be involved in the regulation of color in the breed. This study evaluated the influence of the genes MC1R, ASIP (agouti signaling protein), TYRP1 (tyrosinase related protein 1) and KIT (v-kit Hardy- Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog) in the Creole breed wool color. Samples from 410 specimens of different colors were analyzed. The variation in the color of the wool was performed by colorimetry. The inheritance pattern of the phenotypes was assessed by crossbreeding individuals of different colors. Polymorphisms in the genes were evaluated by performing sequencing and fragment analysis, and the quantification of the ASIP gene expression was performed by Real Time-PCR. It was observed a significant association between polymorphisms in MC1R and ASIP gene and the wool color in Creole breed. The dominant allele of the MC1R gene, caused by p.M73K and p.D121N mutations was found only in pigmented individuals. This allele leads to the constitutive activation of the receptor and therefore in constant production of eumelanin and is epistatic on the ASIP gene. In the homozygous to the wild-type allele of MC1R the manifestation of white phenotype occurred only in individuals with one allele containing a duplication of the ASIP gene. The carriers of the duplicated copy of ASIP showed high levels of gene expression while homozygous for the simple copy of the ASIP did not expressed the gene, and showed pigmented phenotypes. The results allowed the identification of the influence of epistatic interaction of MC1R and ASIP gene in the wool color in Creole breed. The study of candidate genes involved in the pigmentation pathway proved to be a suitable approach for the analysis of variation in pigmentation in these animals. It is expected that the knowledge acquired in this work will assist on stablishment of commercial breeding and preservation policies of this sheep breed. The computational evaluation of non-synonymous polymorphism has been used to determine SNPs that potentially affect the function of the genes and identify the mechanisms responsible for complex diseases and by the variation in phenotypes. The prediction of the effect of polymorphisms in genes using computational tools presents an alternative approach to the study of the genetic of coloration. The human MC1R gene has a large number of know polymorphisms, some of which were associated with changes in pigmentation and susceptibility to skin tumors. However, many existing variations in the gene have not been evaluated regarding the functional consequences and its role in the variation of pigmentation. Computational prediction of nonsynonymous polymorphisms was performed in the human MC1R gene in order to identify the most likely harmful nsSNPs and to establish those with potential effect on the function of MC1R. Eleven individual tools (SIFT, MutPred, Polyphen-2, PROVEAN, I-Mutant 3.0, PANTHER, SNPs3D, Mutation Assessor, PhD-SNP, SNPs&GO and SNAP) and two consensus programs (PON-P and PredictSNP 1.0) were used to the analysis of 92 nsSNPs located in the gene. The programs used are based in evolutionary, structural and computational methods, resulting in the identification of the 14 most damaging nsSNPs (L48P, R67W, H70Y, P72L, S83P, R151H, S172I, L206P, T242I, G255R, P256S, C273Y, C289R and R306H). Despite the differences in the results of the each program the combination of different methods allowed the differentiation of the neutral polymorphisms from the most damaging, showing agreement with the consensus programs. The computational prediction has proved to be an efficient approach for the identification of harmful alleles in the MC1R gene and for the prioritization of mutations for further functional and population studies.

Na levedura Saccharomyces cerevisiae, o gene KIN3 codifica uma serina-treonina cinase cuja função ainda é desconhecida. A proteína Kin3 é homóloga estrutural da proteína NIMA, de Aspergillus nidulans, a qual é necessária para a transição da fase G2/M do ciclo celular, e ainda possui papel na resposta a danos no DNA. Cinases relacionadas à NIMA (Nek´s) foram identificadas em diferentes espécies, e mamíferos contêm 11 Nek´s. Algumas destas cinases apresentam propriedades semelhantes a NIMA, estando envolvidas na progressão do ciclo celular e na resposta a danos no DNA. A proteína Kin3 possui propriedades semelhantes a Nek1 e Nek2. Nek1 interage com proteínas envolvidas na sinalização e reparação de danos no DNA. Linhagens mutantes kin3Δ são defectivas na parada da fase G2/M do ciclo celular em resposta a danos no DNA e apresentam uma pronunciada sensibilidade a diversos agentes mutagênicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a interação do gene KIN3 com os genes do complexo MRX (MRE11/RAD50/XRS2), envolvido na sinalização e reparação de danos no DNA, bem como na manutenção da integridade dos cromossomos. O perfil de sensibilidade dos simples e duplos mutantes sugerem uma interação epistática entre o gene KIN3 e os genes do complexo MRX, na resposta a danos causados por 8-metoxipsoraleno fotoativado, cisplatina e mustarda nitrogenada. A expressão do gene KIN3 durante estresse mutagênico não apresentou diferenças significativas entre a linhagem selvagem e as linhagens mutantes mre11Δ, rad50Δ e xrs2Δ. Os resultados obtidos ainda indicam que a proteína Kin3 possa estar agindo junto com o complexo MRX na via Mec1/Tel1 de sinalização de danos no DNA. / In the yeast Saccharomyces cerevisiae, the KIN3 gene codifies a serine-threonine cinase whose function is still unknown. The Kin3 protein is a structural homolog of NIMA protein of Aspergillus nidulans, which is necessary to G2/M transition, and has a role in DNA damage response. NIMA-related kinases (Nrk´s) were identified in different species, and mammals contain eleven Nrk´s. Some of these kinases display similar properties with NIMA, being involved in cell cycle progression and DNA damage response. The Kin3p have similar properties with Nek1 and Nek2. Nek1 interacts with proteins involved in signaling and repair of DNA damage. Mutant strains in KIN3 are defective in the G2/M-phase checkpoint in response to DNA damage and display a pronounced sensitivity to several mutagens. The aim of this work was to evaluate the interaction between KIN3 gene and the genes of MRX complex (MRE11/RAD50/XRS2), involved in signaling and repair of DNA damage, as well in the maintenance of chromosome integrity. The sensitivity profile of single and double mutants suggests an epistatic interaction between the KIN3 gene and the genes of MRX complex, in damage response induced by photo-activated methoxypsoralen, cisplatin and nitrogen mustard. The KIN3 gene expression during mutagenic stress does not show significant differences between the wild type and mutant strains mre11Δ, rad50Δ and xrs2Δ. The obtained results indicate that the Kin3 protein can act together with the MRX complex in the Mec1/Tel1 pathway of DNA damage signaling.

Orientador: Maricilda Palandi de Mello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T10:04:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Calais_FlaviaLeme_M.pdf: 2545885 bytes, checksum: 01651078ede5d0d74599fe9cf524b8bd (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Para um correto desenvolvimento sexual masculino em humanos, é necessária a presença, entre outros, de dois hormônios esteróides: a testosterona (T) e a diidrotestosterona (DHT). A T é o hormônio responsável pelo desenvolvimento da genitália interna masculina, já a DHT é o hormônio chave da virilização da genitália externa masculina e responsável pelo estabelecimento dos caracteres sexuais secundários durante a puberdade. Duas enzimas são responsáveis pela produção destes hormônios: a enzima 17?-hidroxiesteróide desidrogenase tipo 3 (gene HSD17B3), a qual é responsável pela conversão do hormônio androstenediona em T, reação realizada na última etapa da biossíntese da T e a enzima 5?-redutase tipo 2 (gene SRD5A2), que é responsável por catalisar a conversão da T em DHT. Mutações nos genes HSD17B3 ou SRD5A2 causam alterações que levam à não produção ou à síntese defeituosa das enzimas 17?-hidroxiesteróide desidrogenase tipo 3 e 5?-redutase tipo 2, promovendo deficiência na virilização de indivíduos 46,XY. Indivíduos estes cujas gônadas são representadas por testículos, apresentam pseudo-hermafroditismo masculino (PHM), agora denominado distúrbio da diferenciação do sexo em indivíduos 46,XY (DDS-XY). Estes podem apresentar genitália ambígua, sendo o sexo de criação predominantemente feminino, com virilização na puberdade. O diagnóstico pode ser confirmado com a identificação de mutações nos genes específicos HSD17B3 e SRD5A2. Assim, o objetivo desse estudo foi investigar alterações moleculares nos genes HSD17B3 e SRD5A2, em pacientes com ambiguidade genital com cariótipo 46,XY, e contribuir para a confirmação do diagnóstico clínico e laboratorial de DDS em indivíduos 46,XY por deficiências nas enzimas 17?-hidroxiesteróide desidrogenase tipo 3 e 5?-redutase tipo 2. A metodologia empregada neste estudo teve por base a amplificação dos 11 exons do gene HSD17B3 e dos 5 exons do gene SRD5A2 pela reação em cadeia da polimerase (PCR), seguida por rastreamento das mutações através do sequenciamento direto dos produtos de amplificação. Das 2 famílias estudadas para diagnóstico de alterações no gene HSD17B, foi encontrada uma alteração, p.R80Q, em homozigose em um paciente. E para o para o gene SRD5A2, foram estudadas 45 famílias, e foi verificada a presença de três mutações: a c.418delT em homozigose em um paciente, a c.278delG em heterozigose em um paciente e a p.Q126R em homozigose em duas irmãs. Vários polimorfismos freqüentes foram observados e, também, algumas riações nucleotídicas novas ou raras foram identificadas. Fez parte do estudo a avaliação in vitro da mutação g.49529G>A, já descrita previamente como uma mutação missense (p.G183S), quanto ao efeito deletério no processo de splicing, uma vez que esta alteração encontra-se no último nucleotídeo do exon 3 do gene SRD5A2. Foi verificado que esta alteração promove a excisão do exon 3, mostrando que o efeito primário desta mutação não é a troca de aminoácidos e sim uma alteração no processo de splicing deste gene. / Abstract: The male sexual development requires the production of normal amounts of two steroid hormones: testosterone (T) and dihydrotestosterone (DHT). The T is responsible for development of male internal genitalia, whereas DHT is the key for the virilization of the male external genitalia and responsible for the establishment of secondary sexual characteristics during puberty. Two enzymes are responsible for the production of these hormones: 17?-hydroxysteroid dehydrogenase type 3 enzyme (HSD17B3 gene), which is responsible for converting androstenedione to T, the last step of the biosynthesis of T; and 5?-reductase type 2 enzyme (SRD5A2 gene), which is responsible for catalyzing the conversion of T into DHT. Individuals with 46,XY karyotype and mutations in either HSD17B3 gene or SRD5A2 gene, present a deficiency of enzyme activity that leads to phenotypes ranging from male with ambiguous genitalia to normal female. Such individuals may be assigned at birth and raised as females. The gonads of those individuals are represented by testes. This condition defines the male-pseudohermaphroditism (MPH), recently renamed as disorder of sexual development in 46,XY karyotype (DSD-XY). The diagnosis of these deficiencies can be confirmed with the identification of mutations in either HSD17B3 or SRD5A2 genes. The aim of this investigation was to identify nucleotide alterations in the HSD17B3 gene or in the SRD5A2 gene in patients with clinical and hormonal characteristics suggestive of 17?-hydroxysteroid dehydrogenase type 3 deficiency, or 5?-redutase type 2 deficiency. Molecular analysis was performed by amplification of the eleven exons of HSD17B3 gene, and the five exons of SRD5A2 gene followed by sequencing. In two families studied for the HSD17B3 gene, one alteration was detect, p.R80Q, in a homozygous patient. Forty-five families were studied for SRD5A2 gene and the presence of three mutations was verified: the c.418delT in one homozygous patient, the heterozygosis for c.278delG in one patient and the homozygosis for p.Q126R in two sisters. Several frequent polymorphisms in the SRD5A2 gene were observed and some novel or rare variations were identified as well. The study in vitro with the g.49529G>A mutation was also performed due to the possibility of deleterious effect on the splicing process, although his mutation had been previously described as a missense mutation (p.G183S). It was verified exon 3 skipping in the mRNA as a result of the mutation, showing that the primary effect is not the change of amino acids but the anomalous splicing process of the SRD5A2 gene. / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular

As sÃndromes mielodisplÃsicas (SMD) representam um grupo heterogÃneo de doenÃas clonais que acometem a cÃlula precursora hematopoÃtica pluripotente, caracterizando-se por baixa contagem de cÃlulas no sangue perifÃrico, displasia em uma ou mais linhagens celulares, hematopoese ineficiente, alÃm do risco aumentado de progressÃo para leucemia mielÃide aguda. Embora a doenÃa possa acometer pacientes de outras faixas etÃrias, Ã mais frequente naqueles com idade avanÃada, com mÃdia ao diagnÃstico de 60 a 75 anos. As anormalidades cromossÃmicas sÃo observadas em aproximadamente 50% de todos os casos de SMD, estando, em alguns casos, relacionadas com achados clÃnicos e morfolÃgicos. O objetivo deste trabalho foi determinar, atravÃs da tÃcnica de FISH (hibridizaÃÃo in situ por fluorescÃncia), a frequÃncia de alteraÃÃes envolvendo os genes MLL, RB e TP53 em pacientes com SMD e associar estas alteraÃÃes com os achados citogenÃticos. Os casos inseridos no estudo foram oriundos do ambulatÃrio de SMD do Hospital UniversitÃrio Walter CantÃdio. Dos 33 pacientes selecionados, 17 pertenciam ao grupo com idade acima de 60 anos. 52% dos pacientes foram classificados, segundo a OMS, como citopenia refratÃria com displasia em mÃltiplas linhagens (CRDM) e 61% estratificados, segundo o IPSS, como de risco intermediÃrio 1 (INT-1). Um total de 78% dos pacientes apresentaram alteraÃÃes citogenÃticas, dentre eles 31% possuÃam cariÃtipos complexos (mais de 3 alteraÃÃes por metÃfase). A tÃcnica de FISH permitiu identificar em 18% dos pacientes alteraÃÃes envolvendo um dos trÃs genes avaliados. TrÃs pacientes apresentaram alteraÃÃo do gene TP53, sendo detectada em dois deles (registros 31 e 6) a deleÃÃo de um Ãnico alelo ou de ambos os alelos do gene, respectivamente, e no terceiro (registro 2), detectou-se a amplificaÃÃo do gene TP53, sendo estas alteraÃÃes nÃo visualizadas atravÃs da citogenÃtica clÃssica, por se tratar de um tÃcnica menos sensÃvel. Detectou-se em 6% dos pacientes (registros 7 e 22) rearranjo do gene MLL, no primeiro a FISH descartou a suposta deleÃÃo do gene alegada pela citogenÃtica, provando que o mesmo estava presente no genoma do paciente, porÃm de forma rearranjada e no segundo a citogenÃtica nÃo conseguiu demonstrar o rearranjo do gene. Quanto ao gene RB, a FISH permitiu identificar apenas um paciente (3%) com deleÃÃo de um dos alelos do gene, sendo esta alteraÃÃo tambÃm nÃo detectada pela citogenÃtica clÃssica. A FISH possibilitou identificar, durante a avaliaÃÃo do gene TP53, dois pacientes (registros 5 e 10) apresentando pelo menos 6 cÃpias extras do cromossomo 17, devendo essa alteraÃÃo se tratar de um pequeno clone hiperdiplÃide detectado parcialmente no primeiro paciente e nÃo detectado no segundo. Nos seis pacientes que apresentaram alteraÃÃo dos genes avaliados, a FISH proveu informaÃÃes que adicionaram, confirmaram ou alteraram o resultado previamente emitido pela citogenÃtica clÃssica, sendo estas uma das principais aplicaÃÃes desta tÃcnica devido sua alta sensibilidade quando comparada ao mÃtodo clÃssico. / Myelodysplastic syndromes (MDS) represent a heterogeneous group of clonal disorders affecting the hematopoietic pluripotent cell, characterized by low cell counts in peripheral blood, dysplasia in one or more cell lines, inefficient hematopoiesis and increased risk of progression to acute myeloid leukemia. Although the disease can affect patients of other age groups, they are more frequent in those with advanced age with an average 60 to 75 years at diagnosis. Chromosomal abnormalities are observed in approximately 50% of all cases of MDS and are related with clinical and morphological findings. The aim of this study was to determine, through the technique of FISH (fluorescence in situ hybridization), the frequency of changes involving the MLL, RB, and TP53 genes in patients with MDS and associate these changes with cytogenetic findings. The cases included in the study were selected in the ambulatory of SMD from University Hospital Walter CantÃdio. Thirty three patients were selected, 17 had aged over 60 years. 52% of patients were classified, according to WHO criteria, as refractory cytopenia with dysplasia in multiple lineages (RCDM) and 61% stratified, according to IPSS, as intermediate risk 1 (INT-1). 78% of patients had abnormalities detected by cytogenetics, among them 31% had complex karyotypes (more than 3 changes per metaphase). 18% of patients had changes at least in one of the three genes valued in this study by FISH. Three patients showed alterations of TP53 gene, being detected in two patients (records 31 and 6) the deletion of a single allele or both alleles of the gene, respectively, and in the third (record 2), we detected amplification of TP53 gene, all this changes were not detected by classical cytogenetics, because it is a less sensitive technique. 6% of patients (records 7 and 22) had rearrangement of MLL gene. In the first case, FISH discarded the gene deletion alleged by cytogenetic, proving that it was present in the genome of the patient, but in a rearranged form, and in the second case cytogenetics failed to demonstrate rearrangement of the gene. For the RB gene, FISH identified only one patient (3%) with deletion of one allele of the gene, and this change was also not detected by classical cytogenetics. During evaluating the TP53 gene, FISH allowed identification of two patients (records 5 and 10) presenting at least six extra copies of chromosome 17, probably representing a small hyperdiploid clone partially detected in the first patient and not detected in the second . In the six patients who showed abnormalities of the genes analyzed, FISH has provided information that added, changed or confirmed the result previously given by classical cytogenetics, which are a major application of this technique due to its high sensitivity compared to the traditional method.

Genes envolvidos com a interação hospedeiro-patógeno são fortemente afetados pela seleção natural positiva. O gene codificante do antígeno sangüíneo Duffy, também conhecido como DARC (Duffy Antigen Receptor for Chemokines), tem um importante papel na invasão dos eritrócitos pelos parasitas causadores da malária, Plasmodium vivax em humanos e Plasmodium knowlesi em outros primatas. A estrutura do gene DARC já é conhecida, estando este presente na região 1q22q23 do cromossomo 1, e sendo composto por dois éxons separados por um grande íntron. Em uma população africana a deleção de um nucleotídeo no domínio GATA-1 da região promotora do gene é responsável pela não expressão de DARC nos eritrócitos e pela resistência à invasão pelo P. Vivax. Além disso, o antígeno DARC age como um receptor promíscuo de quimiocinas, sendo expresso nos eritrócitos, células endoteliais de vênulas e outros tecidos. Devido a esse papel dual, no presente estudo seqüenciou-se regiões homólogas do gene DARC em macacos do Novo e Velho Mundo e utilizando métodos estatísticos procurou-se indícios da seleção natural positiva na sua história evolutiva. Nenhuma nova mutação foi encontrada no promotor ou na região codificante. As árvores filogenéticas pelos métodos de máxima parcimônia, máxima verossimilhança e neighbor-join apresentaram topologias semelhantes com três grande clados monofiléticos reconhecíveis e com a espécie Macaca fascicularis apresentando um perfil polifilético. O teste de seleção positiva pelos métodos de Nei-Gojobori, máxima verossimilhança por ramos e máxima verossimilhança por sítios não demonstraram, estatisticamente, à ação da seleção positiva sobre o gene DARC. Porém, o teste de máxima verossimilhança por sítio em domínios demonstrou que existem regiões do gene DARC sujeitas à diferentes pressões seletivas, mas também falhou em detectar a assinatura da seleção positiva. Os resultados indicam a presença da seleção darwiniana sobre a região de ligação do P. vivax, porém os testes de máxima verossimilhança utilizados, aparentemente, não possuem poder suficiente para detectar a sua assinatura. Além disso, os resultados sugerem que a região de ligação do P. vivax está sob influência de duas pressões seletivas antagônicas (seleção positiva exercida pelo parasita e seleção purificadora exercida pelas quimiocinas) o que pode, também, explicar a não detecção da seleção positiva. / Genes involved in pathogen-host interactions are strongly affected by positive natural selection. The gene of blood Duffy antigen, also known as DARC (Duffy Antigen Receptor for Chemokines), has an important role in the invasion of red blood cells by the parasites that cause malaria, Plasmodium vivax in humans and Plasmodium knowlesi in other primates. The structure of the DARC gene is known, it was mapped in 1q22-q23 region of chromosome 1, and is composed by two exons separated by a large intron. In an African population a nucleic acid deletion in GATA-1 of the gene promoter is responsible for the non-expression of DARC on red blood cells and the resistance to invasion by P. vivax. Moreover, the DARC antigen acts as a promiscuous receptor for chemokines and is expressed in red blood cells, endothelial venules cells and other tissues. Because of this dual role, in this study we sequenced homologous regions of the DARC gene in monkeys of the New and Old World and using statistical methods we tried to detect positive natural selection in their evolutionary history. New mutations were not found at promoter or in coding region. The phylogenetic trees by the methods of maximum parsimony, maximum likelihood and neighbor-join showed similar topologies with three large monophyletic clades recognizable and with the Macaca fascicularis showing a poliphyletic profile. The test of positive selection by the methods of Nei-Gojobori, maximum likelihood by branchs and maximum likelihood by sites not shown, statistically, the action of positive selection on the DARC gene. But the maximum likelihood test using sites divided in domains showed that some regions of the DARC gene are subject to different selective pressures, but also failed to detect the signature of positive selection. The results indicate the presence of darwinian selection on P. vivax binding region, but the maximum likelihood tests used, apparently, do not have enough power to detect its signature. Moreover, the results suggest that P. vivax binding region is under the influence of two opposing selective pressures (positive selection exerted by the parasite and purifying selection exerced by chemokines) that can also explain the non-detection of positive selection.

Drosophila meridionalis é uma espécie endêmica da América do Sul, sendo amplamente distribuída na Costa Atlântica do Brasil. Com o objetivo de elaborar uma hipótese filogeográfica para esta espécie foram obtidas sequências do gene nuclear period e do gene mitocondrial COI. Foram calculados os índices de diversidade nucleotídica e realizados os testes: AMOVA, testes de neutralidade, a Mismatch Distribution, Bayesian Skyline Plot, NCPA. Foram obtidas três redes pelo gene COI, denominadas A (populações do interior), B (populações do litoral sul) e C (populações do litoral sudeste e oriental) e uma única rede obtida para o gene period, esta rede divide as populações em dois grupos sendo o primeiro congruente com a rede A e o segundo compreendendo as redes B e C, do gene COI. A AMOVA mostrou uma estruturação alta e significativa entre as populações do interior e o litoral para os dois genes (ct=0,72 gene COI; ct=0,70 gene period), que pode ser explicada pela presença de barreiras geográficas, como a Serra do Mar. Eventos de expansão populacional e de fluxo gênico restrito com isolamento por distância foram detectados nas populações do litoral e o interior respectivamente. A expansão da área de ocorrência de D. meridionalis provavelmente teve inicio com as populações do litoral do Rio Grande de Sul, em direção ao litoral de Santa Catarina com posterior colonização a longa distância dos estados de São Paulo, Rio de Janeiro e Bahia. Migrações assincrônicas de indivíduos de populações litorâneas de São Paulo e Santa Catarina provavelmente colonizaram o interior de São Paulo, e a partir destas populações, se iniciara uma expansão populacional em direção ao sul pelo interior, colonizando o Paraná e Rio Grande do Sul. A análise bayesiana (MCCT) indicou que o tempo do ancestral comum mais recente (TMRCA) para todos os haplótipos de D. meridionalis é de 81.700 anos atrás, data que marca a separação das populações do interior e do litoral aproximadamente no final do Pleistoceno. Eventos similares têm sido sugeridos para explicar a distribuição geográfica de espécies do cluster D. buzzatii, que ocorrem em simpatria em grande parte com populações de D. meridionalis. Esta espécie, como as espécies do cluster D. buzzatii, apresentou indicativos de flutuações demográficas, podendo estar associadas à expansão e contração da distribuição da vegetação xerofítica, durante as oscilações paleoclimáticas do Pleistoceno. / Drosophila meridionalis is an endemic species of South America, being widely distributed in the Atlantic Coast of Brazil. Aiming to develop a phylogeographic hypothesis for this species, sequences of mitochondrial COI and nuclear period genes were obtained. The diversity indexes, AMOVA, neutrality tests, Mismatch Distribution, Bayesan Skyline Plot and NCPA were calculated. We obtained three networks for the COI gene, denominated A (inland populations), B (south coast populations) and C (eastern and southeastern coast populations) and a single network obtained for the period gene, this network divides the population into two groups, being the first congruent with the network A of the COI gene and the second comprising the networks B and C of the COI gene. The AMOVA results, showed a high and significant structuring among inland and coastal populations, for both genes (ct=0,72 COI gene; ct=0,70 period gene), that can be explained by the presence of geographical barriers, such as Serra do Mar. Population expansion events and restricted gene flow with isolation by distance events were detected in coastal and inland populations respectively. The expansion of the area of occurrence of D. meridionalis probably was initiated with the populations of the coast of Rio Grande do Sul, towards the coast of Santa Catarina with subsequent long-distance colonization of the states of São Paulo, Rio de Janeiro and Bahia. Asynchronic migrations of individuals from coastal populations of São Paulo and Santa Catarina probably colonized the inland of São Paulo, and from these populations, a population expansion towards the south through the inland was initiated, colonizing the states of Paraná and Rio Grande do Sul. The bayesian analysis (MCCT) indicated that the time of the most recent common ancestor (TMRCA) for all haplotypes of D. meridionalis is from 81,700 years ago, a date that marks the separation of inland and coastal populations approximately at the end of the Pleistocene. Similar events have been suggested to explain the geographic distribution of species of the cluster D. buzzatii, occurring in sympatry largely with populations of D. meridionalis. This species, as the cluster D. buzzatii species, presented indicatives of demographic fluctuations, which can be associated with the expansion and contraction of the distribution of xerophytic vegetation, during the paleoclimatic fluctuations of the Pleistocene.

Bombardment of intact cells and tissue with DNA-coated microprojectiles represents a novel approach to the genetic transformation of biological material. In this thesis, a gas propulsion particle gun is developed for such a purpose. The particle gun utilises gas dynamics to control particle velocity and spread, thereby enabling optimisation of transformation efficiencies for varying types of target material. The dynamics associated with particle acceleration are shown to relate to transient, shock tube flow. Measurements from schlieren high-speed video photographs of the shock structure of an underexpanded jet demonstrate good agreement with empirical correlations of previous researchers; pitot tube measurements of the nozzle exit Mach number are made and shown to be in good agreement with theoretical contact surface velocities. A novel optical particle velocimeter is used to measure particle time-offlight between axial locations in the system's target chamber, providing a consistent, distance-averaged measurement of particle velocities. Particle velocities are measured for a range of system pressure ratios and driver gases. Variation in particle velocities is seen to be similar to theoretical variation in contact surface velocities. Analytical theory is used to predict small gas-particle velocity lag. Particle velocities with helium as a driver gas are shown to be considerably higher than those with air. High speed video recording of chalk particles exiting the nozzle is used to visualise the spatial and temporal variation in particle spread as a function of nozzle pressure ratio. This technique demonstrates that particle spread increases with increasing nozzle pressure ratio, as gas dynamics theory indicates. Conditions for bombardment of maize suspension cells are experimentally optimised. Significant rates of transient genetic expression are achieved with both air and helium as driver gases. High levels of transient genetic expression are also found with bombardment of maize coleoptiles and the leaves of various dicot species. Transformation efficiencies for bombardment of HL60 human leukaemia cells show dramatic increases over efficiencies seen with conventional techniques not involving cell bombardment. For other cell types the gas propulsion device described here appears to give rates of transient genetic expression similar to those reported for commercial systems using microprojectiles. Other data for the performance of such systems are too limited at present to allow comparisons of controllability and reproducibility of bombardment efficiency.

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