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Determinação de alterações na expressão gênica, fenótipos comportamentais e padrões neurobiológicos em ratos adultos com elevada e baixa atividade exploratória privados de sono paradoxal na adolescência / Determination of alterations in gene expression, behavioral phenotypes and neurobiological patterns in adult rats with high and low exploratory activity deprived of paradoxical sleep in adolescence

Lima, Camila Nayane de Carvalho 09 December 2016 (has links)
LIMA, C. N. C.; Determinação de alterações na expressão gênica, fenótipos comportamentais e padrões neurobiológicos em ratos adultos com elevada e baixa atividade exploratória privados de sono paradoxal na adolescência. 2016.186 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Farmacologia Pós-Graduação (posgfarmacologia@gmail.com) on 2017-05-26T14:23:32Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_cnclima.pdf: 4350214 bytes, checksum: 8b2239f6c5fb992701c8fda52c8102cd (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-05-26T14:32:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_cnclima.pdf: 4350214 bytes, checksum: 8b2239f6c5fb992701c8fda52c8102cd (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-26T14:32:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_cnclima.pdf: 4350214 bytes, checksum: 8b2239f6c5fb992701c8fda52c8102cd (MD5) Previous issue date: 2016-12-09 / Temperament can be considered the basis of humor, behavior and personality, they have strong biological basis, early development of the individual. Evidences suggests that temperament and personality traits predispose to the mood disorders. Because of this, it is important to identify biological factors associated with various temperament characteristics, such as differences in gene expression and neurochemical markers to help further evidence related to the etiopathogenesis of mental disorders such as depression and BD. (HE) and low exploratory activity (LE) exposes or not paradoxical sleep deprivation in adolescence. In the evaluation of the neurobiological basis of temperament, HE and LE tests were selected according to their exploratory profile in an open field test, a model of mania induced by temperamental sleep deprivation was used. Behavioral tests for locomotor activity and exploratory analysis, anxiety, cognition, depression, gene expression investigation of the clock genes, oxidative stress and inflammation were evaluated. The results of this study show that as individual behavioral factors, the exploratory patterns can be characterized in rats. By doing a translation for the human being these exploratory patterns reflect temperamental characteristics that influence a variety of behaviors and neurochemical and genetic parameters in response to the environment. Thus, our results for a strong interaction between exploratory patterns in animals and stressful events in adolescence contributing to the development of behavioral control type depression or mania in adulthood, showing that a selection of animals based on their exploratory pattern may be an alternative Interesting for conducting research with models with translational validity in psychiatry. / O temperamento pode ser considerado como a base do humor, do comportamento e da personalidade, tem uma base biológica forte, manifesta-se cedo no desenvolvimento do indivíduo, norteia a formação dos hábitos sendo relativamente estável no decorrer do tempo. Evidências sugerem que o temperamento e os traços de personalidade predispõem aos transtornos de humor. Em função disso, é importante identificar fatores biológicos associados às distintas características do temperamento, como diferenças na expressão gênica e marcadores neuroquímicos para ajudar a dar mais evidências relacionadas à etiopatogenia de transtornos mentais como depressão e TAB. Dessa forma, o presente estudo tem como objetivo determinar alterações geno-fenotípicas em ratos adultos com elevada (HE) e baixa atividade exploratória (LE) expostos ou não à privação de sono paradoxal na adolescência. Na avaliação das bases neurobiológicas do temperamento foram selecionados ratos HE e LE de acordo com o seu perfil exploratório em um teste campo aberto, dessa forma foi utilizado um modelo de mania induzido por privação do sono de base temperamental. Foram avaliados testes comportamentais para atividade locomotora e exploratória, ansiedade, cognição, depressão, investigação de expressão gênica dos genes do relógio, estresse oxidativo e inflamação. Os resultados deste estudo mostraram que as diferenças comportamentais individuais, aqui chamadas padrões exploratórios podem ser caracterizadas em ratos. Fazendo uma translação para o ser humano estes padrões exploratórios refletem características temperamentais que influenciam uma variedade de comportamentos e parâmetros neuroquímicos e genéticos em resposta ao meio ambiente. Dessa forma, nossos resultados apontam para uma forte interação entre padrões exploratórios em animais (associados ao temperamento no ser humano) e eventos estressores na adolescência contribuindo para o desenvolvimento de alterações comportamentais tipo depressão ou mania na idade adulta, mostrando que a seleção de animais com base no seu padrão exploratório pode ser uma alternativa interessante para a condução de pesquisas com modelos animais com validade translacional em psiquiatria.
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Modulação da expressão dos genes para melanopsina, clock, per1, per2 e bmal1 por melatonina em melanóforos dérmicos do anfíbio Xenopus laevis / Modulation of the expression of melanopsin, clock, per1, per2 e bmal1 , and by melatonin in dermal melanophores of Xenopus laevis

Bluhm, Ana Paula Canel 11 July 2008 (has links)
O ritmo diário de atividade é uma característica de todos os organismos vivos, que tem a capacidade de se orientar no tempo e no espaço, e distinguir entre tempo linear e tempo cíclico. O ciclo claro:escuro é um importante indicador circadiano para todos os organismos. O trabalho do relógio circadiano envolve mecanismos de retroalimentação positiva e negativa dos genes CLOCK e BMAL1 (brain and muscle Arnt-like protein 1) que formam um heterodímero, funcionando como fator de transcrição para a expressão dos genes per (period), cry (cryptochrome) e o receptor órfão REV-ERB. Em geral, o ciclo circadiano tem início nas primeiras horas da manhã com a ativação da transcrição de per e cry por CLOCK/BMAL1. A periodicidade do relógio circadiano resulta da combinação entre retroalimentação transcricional positiva e negativa destes genes. Hoje já se sabe que os vertebrados, além do relógio central (NSQ) possuem vários relógios, distribuídos pelo corpo, os chamados relógios periféricos. A resposta ao estímulo luminoso é resultado da interpretação da informação luminosa por diferentes tipos celulares. A molécula fotorreceptora de melanóforos dérmicos embrionários de X. laevis foi denominada melanopsina (Opn4/Opn4). Neste anfíbio, cones e bastonetes, continuam a exibir ritmo circadiano em cultura durante vários dias, e a sua capacidade de se ajustar pelo estímulo luminoso indica a presença do sistema circadiano. Os objetivos deste projeto foram: verificar qual é o padrão de expressão para Opn4, per1, per2, bmal1 e clock em melanóforos de X. laevis submetidos a diferentes fotofases; verificar se a expressão para Opn4, per1, per2 ,bmal1 e clock nos melanóforos de X. laevis é modulada pela melatonina. Opn4, per1, per2 ,bmal1 e clock Dados obtidos no presente estudo demonstram que nesta linhagem celular estes genes apresentam um padrão de expressão aparentemente rítmico, quando estas células são expostas a um ciclo claro:escuro (14C:10E), que difere do padrão obtido quando mantidas em regime de escuro constante. Em geral, estas células mantidas em escuro constante durante 5 dias tendem a apresentar aumento de expressão de RNAm para estes genes e, quando mantidas em escuro constante também durante 5 dias, mas com adição de melatonina por 1h, 24 h antes de sua extração, estes níveis de RNAm tendem a diminuir. Porém, quando comparamos as três situações, podemos observar que a adição da melatonina restaura, em geral, o padrão de expressão dos genes analisados em 14C:10E. O conjunto de resultados, que obtivemos em melanóforos dérmicos de Xenopus laevis, sugere que esta linhagem celular possue características de relógio periférico. / The daily rhythm of activity is a characteristic of all living organisms, which have the ability of to behave accordingly time and space, and distinguish between linear and cyclic time. The dark:light cycle is an important time cue for all organisms. The work of circadian clock involves mechanisms of positive and negative feedback of CLOCK and BMAL1 which as a heterodimer act as a transcription factor for the expression of per (period), cry (cryptochrome) and the orphan receptor REV-ERB. A typical circadian cycle begins in the first hours of daytime, which the activation of the transcription of per and cry by CLOCK/BMAL1. It is well known that the vertebrates, besides the central clock (SCN), have several other clocks distributed by the body, the so called peripheric clock. The responses to light are the result of the interpretation of light signal by several cell types The photoreceptor molecule in the dermal melanophores of X. laevis was denominated melanopsin (Opn4/Opn4). In this amphibian, rods and cones maintain circadian rhythm during several days in culture, and their ability to synchronize by light suggest the presence of a circadian system. The objectives of this project were: verify the expression pattern for Opn4, per1, per2 ,bmal1 e clock in dermal melanophores of X. laevis, under different photo phases; and verify whether the expression for Opn4, per1, per2, bmal1 and clock were modulated by melatonin. Our data show that these genes have a rhythmic pattern expression, when these cells are under a 14L:10D, which is different from the pattern exhibited in constant dark. In general, these cells in constant dark have a higher mRNA expression, and in the same condition, but with melatonin applied for 1h, 24h before the data collect, these mRNA levels are lower. However, when we compared these three different experimental conditions, we observed that melatonin resets, in overall, the expression pattern of 14L:10D. These data, taken together, suggest that Xenous laevis dermal melanophores have characteristics of a peripheric clock.
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Modulação da expressão dos genes para melanopsina, clock, per1, per2 e bmal1 por melatonina em melanóforos dérmicos do anfíbio Xenopus laevis / Modulation of the expression of melanopsin, clock, per1, per2 e bmal1 , and by melatonin in dermal melanophores of Xenopus laevis

Ana Paula Canel Bluhm 11 July 2008 (has links)
O ritmo diário de atividade é uma característica de todos os organismos vivos, que tem a capacidade de se orientar no tempo e no espaço, e distinguir entre tempo linear e tempo cíclico. O ciclo claro:escuro é um importante indicador circadiano para todos os organismos. O trabalho do relógio circadiano envolve mecanismos de retroalimentação positiva e negativa dos genes CLOCK e BMAL1 (brain and muscle Arnt-like protein 1) que formam um heterodímero, funcionando como fator de transcrição para a expressão dos genes per (period), cry (cryptochrome) e o receptor órfão REV-ERB. Em geral, o ciclo circadiano tem início nas primeiras horas da manhã com a ativação da transcrição de per e cry por CLOCK/BMAL1. A periodicidade do relógio circadiano resulta da combinação entre retroalimentação transcricional positiva e negativa destes genes. Hoje já se sabe que os vertebrados, além do relógio central (NSQ) possuem vários relógios, distribuídos pelo corpo, os chamados relógios periféricos. A resposta ao estímulo luminoso é resultado da interpretação da informação luminosa por diferentes tipos celulares. A molécula fotorreceptora de melanóforos dérmicos embrionários de X. laevis foi denominada melanopsina (Opn4/Opn4). Neste anfíbio, cones e bastonetes, continuam a exibir ritmo circadiano em cultura durante vários dias, e a sua capacidade de se ajustar pelo estímulo luminoso indica a presença do sistema circadiano. Os objetivos deste projeto foram: verificar qual é o padrão de expressão para Opn4, per1, per2, bmal1 e clock em melanóforos de X. laevis submetidos a diferentes fotofases; verificar se a expressão para Opn4, per1, per2 ,bmal1 e clock nos melanóforos de X. laevis é modulada pela melatonina. Opn4, per1, per2 ,bmal1 e clock Dados obtidos no presente estudo demonstram que nesta linhagem celular estes genes apresentam um padrão de expressão aparentemente rítmico, quando estas células são expostas a um ciclo claro:escuro (14C:10E), que difere do padrão obtido quando mantidas em regime de escuro constante. Em geral, estas células mantidas em escuro constante durante 5 dias tendem a apresentar aumento de expressão de RNAm para estes genes e, quando mantidas em escuro constante também durante 5 dias, mas com adição de melatonina por 1h, 24 h antes de sua extração, estes níveis de RNAm tendem a diminuir. Porém, quando comparamos as três situações, podemos observar que a adição da melatonina restaura, em geral, o padrão de expressão dos genes analisados em 14C:10E. O conjunto de resultados, que obtivemos em melanóforos dérmicos de Xenopus laevis, sugere que esta linhagem celular possue características de relógio periférico. / The daily rhythm of activity is a characteristic of all living organisms, which have the ability of to behave accordingly time and space, and distinguish between linear and cyclic time. The dark:light cycle is an important time cue for all organisms. The work of circadian clock involves mechanisms of positive and negative feedback of CLOCK and BMAL1 which as a heterodimer act as a transcription factor for the expression of per (period), cry (cryptochrome) and the orphan receptor REV-ERB. A typical circadian cycle begins in the first hours of daytime, which the activation of the transcription of per and cry by CLOCK/BMAL1. It is well known that the vertebrates, besides the central clock (SCN), have several other clocks distributed by the body, the so called peripheric clock. The responses to light are the result of the interpretation of light signal by several cell types The photoreceptor molecule in the dermal melanophores of X. laevis was denominated melanopsin (Opn4/Opn4). In this amphibian, rods and cones maintain circadian rhythm during several days in culture, and their ability to synchronize by light suggest the presence of a circadian system. The objectives of this project were: verify the expression pattern for Opn4, per1, per2 ,bmal1 e clock in dermal melanophores of X. laevis, under different photo phases; and verify whether the expression for Opn4, per1, per2, bmal1 and clock were modulated by melatonin. Our data show that these genes have a rhythmic pattern expression, when these cells are under a 14L:10D, which is different from the pattern exhibited in constant dark. In general, these cells in constant dark have a higher mRNA expression, and in the same condition, but with melatonin applied for 1h, 24h before the data collect, these mRNA levels are lower. However, when we compared these three different experimental conditions, we observed that melatonin resets, in overall, the expression pattern of 14L:10D. These data, taken together, suggest that Xenous laevis dermal melanophores have characteristics of a peripheric clock.
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Generation and expression of circadian oscillation in the stingless bee Melipona quadrifasciata (Hymenoptera; Apinae; Meliponini) / Geração e expressão da oscilação circadiana na abelha sem ferrão Melipona quadrifasciata (Hymenoptera; Apinae; Meliponini)

Yamashita, Cintia Etsuko 25 October 2013 (has links)
Daily rhythms of insects are generated by a circadian system localized in the protocerebrum and in the optic lobes of the central nervous system. The circadian system is composed by coupled oscillators connected to input and output pathways. The oscillator generates rhythms by molecular processes, linked in feedback loops. In the input pathways the components are involved in light mediated-transduction. In the output, several neuropeptides are involved. Foragers of the stingless bee Melipona quadrifasciata exhibit a daily activity rhythm. Foragers have been used here to identify circadian components, through three different approaches: I) analysis of gene expression; II) identification of structures in the central nervous system; III) comparative study of neuropeptides possibly related with the circadian system, using Apis mellifera as the reference species. I) Fragments of putative clock genes were cloned. Only period (per) gene showed rhythmic expression, peaked at 1h after lights off. Non statistically significant rhythms were detected in cryptochrome (cry), clock and cycle genes expression. II) Antibodies against PER, CRY (an input pathway protein) and pigment dispersing hormone (an output pathway neuropeptide) evinced several areas in the brain and in the optic lobes. PER and CRY were localized in the optic lobes and in fibers in the protocerebral region, in a rhythmic pattern. PDH was observed in cell bodies in the lateral protocerebrum, in projections in the brain and in some fibers in the optic lobes. III) Neuropeptides probably related to the circadian system, were found in A. mellifera and M. quadrifasciata. Some of them: tachykinin-related peptide, allatostatin, and FMRF-related peptide were rhythmic and present in specie-specific patterns. The circadian system of M. quadrifasciata showed particularities in the putative clock components when compared with A. mellifera and other insects. The expression, localization, distribution and temporal dynamics of the circadian system point out a novel, specific feature / Ritmos diários em insetos são gerados por um sistema circadiano localizado no protocerebrum e nos lobos ópticos do sistema nervoso central. O sistema circadiano é composto por osciladores acoplados às vias de aferência e eferência. O oscilador gera ritmos através de mecanismos moleculares, integrantes de alças de retroalimentação. Nas vias de aferência estão envolvidos componentes que participam da transdução mediada da luz. Diversos neuropeptídeos fazem parte das vias de eferência. Forrageiras da abelha sem ferrão Melipona quadrifasciata exibem um ritmo diário de atividade. Forrageiras foram utilizadas neste trabalho para identificar componentes circadianos, através de três diferentes abordagens: I) análise da expressão gênica, II) identificação de estruturas no sistema nervoso central, III) estudo comparado de neuropeptídeos possivelmente relacionados com o sistema circadiano, utilizando como espécie referência Apis mellifera. Fragmentos de prováveis genes do relógio foram clonados. Somente o gene period (per) mostrou expressão rítmica, o pico ocorreu 1h após o início do escuro. cryptochrome (cry), clock e cycle não apresentaram diferença estatística na expressão rítmica. I) Anticorpos contra PER, CRY (proteína da via de aferência) e \"pigment dispersing hormone\" (PDH, neuropeptídeo da via de eferência) marcaram diversas áreas no cérebro e nos lobos ópticos. PER e CRY foram localizados nos lobos ópticos, em fibras da região protocerebral, com um padrão rítmico. PDH foi observado em corpos celulares no protocerebrum lateral, em projeções no cérebro e em algumas fibras nos lobos ópticos. II) Neuropeptídeos, provavelmente relacionados com o sistema circadiano, foram detectados em A. mellifera e M. quadrifasciata. Alguns deles: \"tachykinins-related peptides\", alatostatinas, e \"FMRF-related peptides\" são rítmicos, com padrões espécie-específicos. O sistema circadiano de M. quadrifasciata mostrou particularidades nos prováveis componentes do relógio quando comparados com A. mellifera e outros insetos. A expressão, localização, distribuição e dinâmicas temporais apontam para características específicas da organização do sistema circadiano
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Efeitos de glicocorticoide sobre a expressão de genes de relógio nas células ZEM-2S de Danio rerio / Glucocorticoid effects on clock gene expression in Danio rerio ZEM-2S cells

Sousa, Jennifer Caroline de 23 February 2015 (has links)
O estudo da expressão circadiana de genes de relógio tem sugerido hormônios como potenciais agentes sincronizadores. A regulação da ritmicidade de relógios periféricos é, aparentemente, mais um dentre os diferentes efeitos fisiológicos atribuídos aos glicocorticoides (GCs), que se constituem como candidatos a zeitgeber dado ao fato de que seus níveis circulantes apresentam padrões diários robustos e são uma das principais eferências do relógio central em mamíferos. Entretanto, em outros vertebrados, o papel dessa classe hormonal em relação a este aspecto ainda é pouco explorado e se a regulação é direta ou indireta, quais suas consequências e de que maneira ela ocorre são indagações a serem respondidas. Empregando a técnica do PCR quantitativo, avaliamos o perfil de expressão dos genes da alça negativa do núcleo da maquinaria molecular do relógio, per1b e cry1b, em células ZEM-2S do teleósteo Danio rerio expostas ao regime fotoperiódico 12:12 CE ou mantidas em escuro constante (EE) e mantidas em EE, mas condicionadas a trocas diárias de meio de cultura ou a pulsos diários de dexametasona a 10-7 M (DEXA), agonista sintético de glicocorticoide. Em 12:12 CE, ambos os genes apresentaram variação temporal, com picos de expressão observados na fase clara do ciclo. Em EE, per1b mostrou um perfil oscilatório de amplitude atenuada, enquanto para cry1b, não foi detectada oscilação ao longo das 24 h. Trocas de meio em EE alteraram significativamente o padrão de expressão de per1b e cry1b, no entanto, os pulsos diários de DEXA promoveram uma oscilação temporal muito mais pronunciada para per1b, modulando positiva ou negativamente sua expressão nos diferentes pontos temporais. O emprego do antagonista RU 486 na concentração de 10-5 M aboliu o pico de expressão detectado no ZT 16, porém, na concentração de 10-6 M, a expressão gênica foi aumentada em cerca de 3 vezes comparado ao tratamento apenas com DEXA. O gene cry1b, por sua vez, não se apresentou suscetível aos pulsos diários de DEXA. Estes resultados permitem confirmar as células ZEM-2S como modelo de relógios periféricos em cultura dada a fotossensibilidade intrínseca das mesmas, reafirmando o papel do ciclo CE como principal agente sincronizador. Os glicocorticoides certamente exercem modulação de per1b por meio da via genômica direta, sem, no entanto excluir uma possível ação via receptor de membrana, tendo em vista a atividade agonista de RU 486, podendo se constituir em um dos fatores que regulam o complexo funcionamento da maquinaria molecular do relógio biológico de zebrafish / Studies on the circadian expression of clock genes have suggested hormones as potential synchronizing agents. Regulation of rhythmicity of peripheral clocks is among the various physiological effects of glucocorticoids (GCs), which are candidate to zeitgeber, since their circulating levels present robust daily patterns and are one of the major outputs of the mammalian central pacemaker. However, in other vertebrates, such a feature has yet to be clarified as well as if the hormonal regulation is direct or indirect, what are its mechanisms and consequences. Applying qPCR technique, we evaluated the gene expression profile of per1b and cry1b, negative feedback loop members of the molecular machinery of biological clock, in ZEM-2S cells of the teleost Danio rerio. The cells were exposed to photoperiod regimen of 12:12 LD; kept in constant darkness (DD); kept in DD but subject to medium changes or treated with daily pulses of 10-7 M dexamethasone (10-7 M DEXA), a glucocorticoid synthetic analogue. In 12:12 LD, both genes presented temporal variation, with peaks of expression in the light phase. In DD, per1b showed an oscillatory profile with attenuated amplitude, whereas cry1b did not oscillate throughout 24 h. DEXA-free medium changes in constant DD conditions altered significantly per1b and cry1b expression profiles. Nevertheless, DEXA daily pulses promoted a temporal oscillation much more pronounced for per1b, modulating positively or negatively its expression at different time points, whereas cry1b was not susceptible to the hormone. RU 486 at 10-5 M abolished the peak of expression of per1b previously observed at ZT 16. On the other hand, RU 486 at 10-6 M increased the gene expression around 3-fold in comparison to just DEXA treatment. These results confirm ZEM-2S cells as a model of peripheral clocks in culture due to their intrinsec photosensitivity, emphasizing the light/dark cycle as a major synchronizing agent. The glucocorticoid modulates per1b expression, probably through a direct genomic pathway, without excluding however its possible action through membrane receptors, since RU 486 exerted agonistic activity. Glucocorticoids could, therefore, be one of the factors that regulate the complex molecular machinery of zebrafish biological clock
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Modulação da expressão dos genes do relógio por glutamato na retina de Gallus gallus / Modulation of clock genes expression by glutamate in the retina of Gallus gallus

Dias, Rafael Benjamin Araújo 31 January 2014 (has links)
A evolução da vida na terra foi possível graças ao desenvolvimento de mecanismos temporais precisos capazes de ajustar processos fisiológicos que ocorriam no interior do organismo com os ciclos ambientais, promovendo assim, ganhos na capacidade adaptativa e comportamental desses indivíduos. A retina exerce função de suma importância nesse processo através da percepção da informação fótica que possibilita o ajuste dos ritmos circadianos. Nesse tecido, o glutamato apresenta um importante papel tanto na transmissão da informação fótica direcionada ao processo de formação de imagem quanto nos ajustes dos relógios biológicos. O objetivo desse trabalho foi avaliar como o glutamato, aplicado por períodos diferentes (6 e 12h), é capaz de modular a expressão dos genes de relógio na retina de Gallus gallus. Através de diferentes protocolos que envolveram a administração de glutamato na concentração de 100μM por 6 e 12 horas e em diferentes repetições (1 e 3 pulsos) avaliou-se através de PCR quantitativo a expressão dos genes Clock, Per2 e Bmal1. Os diferentes genes de relógio na retina de Gallus gallus apresentam diferentes respostas frente às trocas de meio e frente ao tratamento com o glutamato. O gene Clock responde com ativação da transcrição para ambos os tratamentos, de forma dependente da repetição dos estímulos. Já para o gene Per2 o tratamento com glutamato impõe uma oscilação de expressão com um ritmo ultradiano, enquanto que as trocas de meio não determinam alterações na transcrição. A expressão do gene Bmal1 não é afetada nem por trocas de meio, nem por glutamato. Novos estudos devem ser fomentados no sentido de se elucidar as vias pelas quais o glutamato leva ao perfil de oscilação observado e qual o mecanismo pelo qual a repetição de trocas de meio atua como sinalizador para o estabelecimento da sincronização celular / The evolution of life on earth was possible thanks to the development of precise temporal mechanisms to adjust physiological processes to environmental cycles, thus promoting gains in the individual adaptive and behavioral ability. The retina plays a very important role of paramount importance in this process through the perception of photic information that allows the adjustment of circadian rhythms. In this tissue, glutamate functions in the transmission of photic information directed to both image formation and biological clock entrainment. The aim of this study was to evaluate how glutamate, applied for different periods (6 and 12h), is able to modulate the expression of the clock genes in the retina of Gallus gallus. Using different protocols involving the administration of 100μM glutamate for 6 and 12 hours and with different repetitions (1 and 3 pulses) the expression of Clock, Per2 and Bmal1 genes was evaluated by quantitative PCR. Clock gene responds with activation of transcription to both treatments depending on the repetition of the stimulus. As for Per2 gene, glutamate treatment imposes an oscillation with an ultradian expression rhythm, whereas medium changes do not affect its transcription. The expression of Bmal1 gene is not affected by either medium changes or glutamate. Further studies should be encouraged in order to elucidate the pathways by which glutamate leads to observed oscillation profile, and which mechanism triggered by the repetition of medium changes acts as signal to establish cell synchronization
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Generation and expression of circadian oscillation in the stingless bee Melipona quadrifasciata (Hymenoptera; Apinae; Meliponini) / Geração e expressão da oscilação circadiana na abelha sem ferrão Melipona quadrifasciata (Hymenoptera; Apinae; Meliponini)

Cintia Etsuko Yamashita 25 October 2013 (has links)
Daily rhythms of insects are generated by a circadian system localized in the protocerebrum and in the optic lobes of the central nervous system. The circadian system is composed by coupled oscillators connected to input and output pathways. The oscillator generates rhythms by molecular processes, linked in feedback loops. In the input pathways the components are involved in light mediated-transduction. In the output, several neuropeptides are involved. Foragers of the stingless bee Melipona quadrifasciata exhibit a daily activity rhythm. Foragers have been used here to identify circadian components, through three different approaches: I) analysis of gene expression; II) identification of structures in the central nervous system; III) comparative study of neuropeptides possibly related with the circadian system, using Apis mellifera as the reference species. I) Fragments of putative clock genes were cloned. Only period (per) gene showed rhythmic expression, peaked at 1h after lights off. Non statistically significant rhythms were detected in cryptochrome (cry), clock and cycle genes expression. II) Antibodies against PER, CRY (an input pathway protein) and pigment dispersing hormone (an output pathway neuropeptide) evinced several areas in the brain and in the optic lobes. PER and CRY were localized in the optic lobes and in fibers in the protocerebral region, in a rhythmic pattern. PDH was observed in cell bodies in the lateral protocerebrum, in projections in the brain and in some fibers in the optic lobes. III) Neuropeptides probably related to the circadian system, were found in A. mellifera and M. quadrifasciata. Some of them: tachykinin-related peptide, allatostatin, and FMRF-related peptide were rhythmic and present in specie-specific patterns. The circadian system of M. quadrifasciata showed particularities in the putative clock components when compared with A. mellifera and other insects. The expression, localization, distribution and temporal dynamics of the circadian system point out a novel, specific feature / Ritmos diários em insetos são gerados por um sistema circadiano localizado no protocerebrum e nos lobos ópticos do sistema nervoso central. O sistema circadiano é composto por osciladores acoplados às vias de aferência e eferência. O oscilador gera ritmos através de mecanismos moleculares, integrantes de alças de retroalimentação. Nas vias de aferência estão envolvidos componentes que participam da transdução mediada da luz. Diversos neuropeptídeos fazem parte das vias de eferência. Forrageiras da abelha sem ferrão Melipona quadrifasciata exibem um ritmo diário de atividade. Forrageiras foram utilizadas neste trabalho para identificar componentes circadianos, através de três diferentes abordagens: I) análise da expressão gênica, II) identificação de estruturas no sistema nervoso central, III) estudo comparado de neuropeptídeos possivelmente relacionados com o sistema circadiano, utilizando como espécie referência Apis mellifera. Fragmentos de prováveis genes do relógio foram clonados. Somente o gene period (per) mostrou expressão rítmica, o pico ocorreu 1h após o início do escuro. cryptochrome (cry), clock e cycle não apresentaram diferença estatística na expressão rítmica. I) Anticorpos contra PER, CRY (proteína da via de aferência) e \"pigment dispersing hormone\" (PDH, neuropeptídeo da via de eferência) marcaram diversas áreas no cérebro e nos lobos ópticos. PER e CRY foram localizados nos lobos ópticos, em fibras da região protocerebral, com um padrão rítmico. PDH foi observado em corpos celulares no protocerebrum lateral, em projeções no cérebro e em algumas fibras nos lobos ópticos. II) Neuropeptídeos, provavelmente relacionados com o sistema circadiano, foram detectados em A. mellifera e M. quadrifasciata. Alguns deles: \"tachykinins-related peptides\", alatostatinas, e \"FMRF-related peptides\" são rítmicos, com padrões espécie-específicos. O sistema circadiano de M. quadrifasciata mostrou particularidades nos prováveis componentes do relógio quando comparados com A. mellifera e outros insetos. A expressão, localização, distribuição e dinâmicas temporais apontam para características específicas da organização do sistema circadiano
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Modulação da expressão dos genes do relógio por glutamato na retina de Gallus gallus / Modulation of clock genes expression by glutamate in the retina of Gallus gallus

Rafael Benjamin Araújo Dias 31 January 2014 (has links)
A evolução da vida na terra foi possível graças ao desenvolvimento de mecanismos temporais precisos capazes de ajustar processos fisiológicos que ocorriam no interior do organismo com os ciclos ambientais, promovendo assim, ganhos na capacidade adaptativa e comportamental desses indivíduos. A retina exerce função de suma importância nesse processo através da percepção da informação fótica que possibilita o ajuste dos ritmos circadianos. Nesse tecido, o glutamato apresenta um importante papel tanto na transmissão da informação fótica direcionada ao processo de formação de imagem quanto nos ajustes dos relógios biológicos. O objetivo desse trabalho foi avaliar como o glutamato, aplicado por períodos diferentes (6 e 12h), é capaz de modular a expressão dos genes de relógio na retina de Gallus gallus. Através de diferentes protocolos que envolveram a administração de glutamato na concentração de 100μM por 6 e 12 horas e em diferentes repetições (1 e 3 pulsos) avaliou-se através de PCR quantitativo a expressão dos genes Clock, Per2 e Bmal1. Os diferentes genes de relógio na retina de Gallus gallus apresentam diferentes respostas frente às trocas de meio e frente ao tratamento com o glutamato. O gene Clock responde com ativação da transcrição para ambos os tratamentos, de forma dependente da repetição dos estímulos. Já para o gene Per2 o tratamento com glutamato impõe uma oscilação de expressão com um ritmo ultradiano, enquanto que as trocas de meio não determinam alterações na transcrição. A expressão do gene Bmal1 não é afetada nem por trocas de meio, nem por glutamato. Novos estudos devem ser fomentados no sentido de se elucidar as vias pelas quais o glutamato leva ao perfil de oscilação observado e qual o mecanismo pelo qual a repetição de trocas de meio atua como sinalizador para o estabelecimento da sincronização celular / The evolution of life on earth was possible thanks to the development of precise temporal mechanisms to adjust physiological processes to environmental cycles, thus promoting gains in the individual adaptive and behavioral ability. The retina plays a very important role of paramount importance in this process through the perception of photic information that allows the adjustment of circadian rhythms. In this tissue, glutamate functions in the transmission of photic information directed to both image formation and biological clock entrainment. The aim of this study was to evaluate how glutamate, applied for different periods (6 and 12h), is able to modulate the expression of the clock genes in the retina of Gallus gallus. Using different protocols involving the administration of 100μM glutamate for 6 and 12 hours and with different repetitions (1 and 3 pulses) the expression of Clock, Per2 and Bmal1 genes was evaluated by quantitative PCR. Clock gene responds with activation of transcription to both treatments depending on the repetition of the stimulus. As for Per2 gene, glutamate treatment imposes an oscillation with an ultradian expression rhythm, whereas medium changes do not affect its transcription. The expression of Bmal1 gene is not affected by either medium changes or glutamate. Further studies should be encouraged in order to elucidate the pathways by which glutamate leads to observed oscillation profile, and which mechanism triggered by the repetition of medium changes acts as signal to establish cell synchronization
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Efeitos de glicocorticoide sobre a expressão de genes de relógio nas células ZEM-2S de Danio rerio / Glucocorticoid effects on clock gene expression in Danio rerio ZEM-2S cells

Jennifer Caroline de Sousa 23 February 2015 (has links)
O estudo da expressão circadiana de genes de relógio tem sugerido hormônios como potenciais agentes sincronizadores. A regulação da ritmicidade de relógios periféricos é, aparentemente, mais um dentre os diferentes efeitos fisiológicos atribuídos aos glicocorticoides (GCs), que se constituem como candidatos a zeitgeber dado ao fato de que seus níveis circulantes apresentam padrões diários robustos e são uma das principais eferências do relógio central em mamíferos. Entretanto, em outros vertebrados, o papel dessa classe hormonal em relação a este aspecto ainda é pouco explorado e se a regulação é direta ou indireta, quais suas consequências e de que maneira ela ocorre são indagações a serem respondidas. Empregando a técnica do PCR quantitativo, avaliamos o perfil de expressão dos genes da alça negativa do núcleo da maquinaria molecular do relógio, per1b e cry1b, em células ZEM-2S do teleósteo Danio rerio expostas ao regime fotoperiódico 12:12 CE ou mantidas em escuro constante (EE) e mantidas em EE, mas condicionadas a trocas diárias de meio de cultura ou a pulsos diários de dexametasona a 10-7 M (DEXA), agonista sintético de glicocorticoide. Em 12:12 CE, ambos os genes apresentaram variação temporal, com picos de expressão observados na fase clara do ciclo. Em EE, per1b mostrou um perfil oscilatório de amplitude atenuada, enquanto para cry1b, não foi detectada oscilação ao longo das 24 h. Trocas de meio em EE alteraram significativamente o padrão de expressão de per1b e cry1b, no entanto, os pulsos diários de DEXA promoveram uma oscilação temporal muito mais pronunciada para per1b, modulando positiva ou negativamente sua expressão nos diferentes pontos temporais. O emprego do antagonista RU 486 na concentração de 10-5 M aboliu o pico de expressão detectado no ZT 16, porém, na concentração de 10-6 M, a expressão gênica foi aumentada em cerca de 3 vezes comparado ao tratamento apenas com DEXA. O gene cry1b, por sua vez, não se apresentou suscetível aos pulsos diários de DEXA. Estes resultados permitem confirmar as células ZEM-2S como modelo de relógios periféricos em cultura dada a fotossensibilidade intrínseca das mesmas, reafirmando o papel do ciclo CE como principal agente sincronizador. Os glicocorticoides certamente exercem modulação de per1b por meio da via genômica direta, sem, no entanto excluir uma possível ação via receptor de membrana, tendo em vista a atividade agonista de RU 486, podendo se constituir em um dos fatores que regulam o complexo funcionamento da maquinaria molecular do relógio biológico de zebrafish / Studies on the circadian expression of clock genes have suggested hormones as potential synchronizing agents. Regulation of rhythmicity of peripheral clocks is among the various physiological effects of glucocorticoids (GCs), which are candidate to zeitgeber, since their circulating levels present robust daily patterns and are one of the major outputs of the mammalian central pacemaker. However, in other vertebrates, such a feature has yet to be clarified as well as if the hormonal regulation is direct or indirect, what are its mechanisms and consequences. Applying qPCR technique, we evaluated the gene expression profile of per1b and cry1b, negative feedback loop members of the molecular machinery of biological clock, in ZEM-2S cells of the teleost Danio rerio. The cells were exposed to photoperiod regimen of 12:12 LD; kept in constant darkness (DD); kept in DD but subject to medium changes or treated with daily pulses of 10-7 M dexamethasone (10-7 M DEXA), a glucocorticoid synthetic analogue. In 12:12 LD, both genes presented temporal variation, with peaks of expression in the light phase. In DD, per1b showed an oscillatory profile with attenuated amplitude, whereas cry1b did not oscillate throughout 24 h. DEXA-free medium changes in constant DD conditions altered significantly per1b and cry1b expression profiles. Nevertheless, DEXA daily pulses promoted a temporal oscillation much more pronounced for per1b, modulating positively or negatively its expression at different time points, whereas cry1b was not susceptible to the hormone. RU 486 at 10-5 M abolished the peak of expression of per1b previously observed at ZT 16. On the other hand, RU 486 at 10-6 M increased the gene expression around 3-fold in comparison to just DEXA treatment. These results confirm ZEM-2S cells as a model of peripheral clocks in culture due to their intrinsec photosensitivity, emphasizing the light/dark cycle as a major synchronizing agent. The glucocorticoid modulates per1b expression, probably through a direct genomic pathway, without excluding however its possible action through membrane receptors, since RU 486 exerted agonistic activity. Glucocorticoids could, therefore, be one of the factors that regulate the complex molecular machinery of zebrafish biological clock
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Caracterização dos componentes moleculares do ciclo circadiano no desenvolvimento e senescência de Apis mellifera / Molecular characterization of the circadian clock elements during the development and senecence of Apis mellifera

Abreu, Fabiano Carlos Pinto de 06 September 2018 (has links)
O ciclo circadiano é um sistema adaptativo e vantajoso que permite a antecipação dos organismos e sincronização de suas atividades fisiológicas frente às variações ambientais que ocorrem ao longo do dia. Seu funcionamento molecular acontece pela geração dos ritmos circadianos, os quais surgem a partir da expressão cíclica dos genes do relógio em um feedback autoregulatório. Em insetos, os ritmos circadianos apresentam função importante em coordenar o timing do desenvolvimento e o comportamento. Nos últimos anos, estudos desvendaram que o relógio molecular de insetos sociais apresenta um funcionamento mais similar ao relógio de mamíferos do que com outros insetos como Drosophila melanogaster. Em especial, abelhas sociais têm sido ótimos modelos para investigar como os ritmos circadianos são modulados de acordo com as interações sociais entre os indivíduos, a plasticidade comportamental e a divisão social do trabalho entre as operárias. Operárias jovens (nutrizes) cuidam da cria no interior da colônia e geralmente apresentam uma atividade arrítimica ao longo de 24 horas, enquanto as abelhas mais velhas (forrageiras) são rítmicas e desenvolvem atividades complexas no ambiente externo. Nesse trabalho, nós caracterizamos os perfis de expressão dos genes do relógio period (per), cryptochrome mammalian-like (cry-m), clock (clk), cycle (cyc), timeout 2 (tim2), par domain protein 1 (pdp1), vrille (vri) e clockwork orange (cwo) durante todo o desenvolvimento de abelhas operárias de Apis mellifera. Verificamos que os genes do relógio são expressos antes mesmo da formação do sistema nervoso central no embrião e que seus transcritos podem ser herdados maternalmente. No desenvolvimento de larvas e pupas, revelamos que estes genes são diferencialmente expressos entre as fases investigadas e, com exceção dos genes cwo e tim2, todos respondem ao tratamento com o Hormônio Juvenil (HJ) na fase de pupa de olho branco. A resposta positiva dos genes clk, cyc e pdp1 frente ao tratamento hormonal pode estar relacionada com o envolvimento destes nas vias que respondem à sinalização do HJ, interagindo com os genes Kruppel (Kr-h1) e Methoprene-tolerant (MET). No desenvolvimento adulto, vimos que os genes per e cry-m são potenciais marcadores da plasticidade comportamental e divisão social do trabalho. Em um experimento usando single-cohort colony, estes genes apresentam níveis transcricionais que não oscilam em cabeças de operárias jovens (3 e 7 dias) ao longo de 24 horas, comparado aos níveis de expressão que oscilam de forma robusta em abelhas mais velhas (15 e 25 dias). Ainda, reconstruímos redes de interação proteína-proteína e miRNA-mRNA onde foram identificadas potenciais moléculas que atuam modulando os genes do relógio em nível póstranscricional e traducional. Dentre elas, validamos as interações entre os miRNA-34 e seus sítios de ligação que estão presentes nas 3`UTRS dos genes cyc e cwo, através do ensaio por luciferase, revelando que este miRNA é um regulador negativo da expressão desses genes. Pela primeira vez, realizamos uma análise ampla dos genes do relógio em um inseto social, além de identificar novas moléculas que podem atuar modulando os ritmos circadianos. Nosso trabalho demonstra a importâcia das abelhas sociais como modelos ideais para desvendar os mecanismos moleculares que regem os ritmos circadianos não só em abelhas, como também em outros organismos, inclusive mamíferos. / The circadian clock is an advantageous adaptive system that enables organisms to anticipate and syncronize their biological activities during the daily environmental changes. The circadian clock acts through the ontogeny of circadian rhythms, which are generated by the cyclic expression of the clock genes in an autregulatory feedback loop. In insects, the circadian rhythms have important roles in the coordination of the developmental timing and behavior, interacting with the endocrine system. In the last years, researchers revealed that the molecular clock of social insects is more similar to mammals than to insects. In particular, the social honeybee is an excellent model to investigate how the circadian rhythms are modulated accordingly to the social context, behavioral plasticity, and taskrelated activities. While young bees (nurses) work arrhythmically around the clock inside the colony in brood-care activities, old bees (foragers) need to be strongly rhythmic to develop complex tasks. In this work, we characterized the expression patterns of the clock genes period (per), cryptochrome mammalian-like (cry-m), clock (clk), cycle (cyc), timeout 2 (tim2), par domain protein 1 (pdp1), vrille (vri) e clockwork orange (cwo) in the entire development of Apis mellifera. Our results revealed that the clock genes are expressed before the formation of the central nervous system in embryos and that their transcripts might be inherited maternally. The clock genes are diferentially modulated during the larval and pupal development and, except for tim2 and cwo, all of them respond to the treatment with Juvenile Hormone (JH) in white-eyed pupae. The positive response to JH by clk, cyc and pdp1 might be related to the involvement of these genes on the pathways of the JH signaling, interacting with Kruppel (Kr-h1) and Methoprene-tolerant (MET) genes. In the adult development, the clock genes per and cry-m are potential molecular markers of the behavioral plasticity and division of labor in a single-cohort colony, once they did not exhibit transcriptional oscillations in heads of young bees (3 and 7 days-old) during 24h, compared to the robust transcriptional oscillation in old bees (15 and 25 days-old). Additionally, we reconstructed protein-protein and miRNA-mRNA interaction networks and identified putative molecules involved in the post-transcriptional and translational regulation of the clock genes. Among those molecules, we validated interactions between the miR-34 and its binding sites in the 3`UTR of cyc and cwo by luciferase assay, showing that this miRNA is a negative regulator of both clock genes. We showed for the first time a broad analysis of the circadian clock elements in a social insect, and also identified news molecules with potential to act as modulators of the circadian rhythms. This work expands the knowledge about the biological roles of the circadian clock in honeybees. Our work also contributes to highlight the importance of honeybees as an ideal model to uncover the molecular mechanisms that govern the circadian rhythms, not only in bees, but in other organisms, including mammals.

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