Os ciclos claro-escuro (CE) são considerados importantes pistas para o ajuste de relógios biológicos. Alças de retroalimentação positiva e negativa de transcrição e tradução de genes de relógio são a base molecular subjacente tanto a relógios centrais como periféricos. A opsina não visual, melanopsina (Opn4), expressa na retina de mamíferos, é considerada o fotopigmento circadiano pois é responsável pelo ajuste do relógio biológico endógeno. Este fotopigmento também está presente nos melanóforos de Xenopus laevis, onde ele foi descrito pela primeira vez, mas seu papel nestas células ainda não está completamente esclarecido. Espécies de vertebrados não mamíferos expressam duas ou mais melanopsinas e, no caso de X. laevis, há dois genes, Opn4m and Opn4x. Melanóforos de X. laevis respondem à luz com dispersão dos grânulos de melanina, a resposta máxima sendo atingida no comprimento de onda correspondente àquele de excitação máxima da melanopsina. Entre vários hormônios, endotelinas também dispersam os melanossomos em melanóforos de Xenopus através de via similar àquela evocada pela luz. Tendo esses fatos em mente, decidimos investigar se a luz e a endotelina modulam a expressão de genes de relógio em melanóforos de Xenopus, usando PCR quantitativo para avaliar os níveis relativos de RNAm de Per1, Per2, Clock e Bmal1. Ciclos CE promoveram alterações temporais na expressão de Per1, Per2 e Bmal1. Pulsos de 10 min de luz azul aumentaram a expressão de Per1 e Per2, diminuíram a expressão de Opn4x, mas não tiveram efeito sobre Opn4m. Ainda mais, diferentes localizações foram mostradas para cada melanopsina: imunorreatividade para OPN4x foi vista principalmente na membrana celular, enquanto OPN4m foi imuno-localizada no núcleo. Estes resultados em conjunto apontam para funções diferenciais das duas melanopsinas neste modelo. A translocação de grânulos de melanina foi maior quando um pulso de luz azul foi aplicado na presença de endotelina ET-3. E os níveis de RNAm de Clock exibiram variação temporal em melanóforos submetidos a CE após tratamento com ET-3 10-9M, enquanto a expressão de Per1 não foi afetada pelo tratamento hormonal. Em adição, ensaios farmacológicos indicaram que as respostas de Per1 e Per2 à luz azul são evocadas através da ativação da via de fosfoinositídeos, com crosstalks com GMPc/proteina quinase G (PKG) para ativar os genes de relógio. Estes dados sugerem a participação de melanopsina na foto-ativação de genes de relógio, e apontam para uma participação menor de endotelina como sincronizador desta linhagem celular. Nossos resultados constituem uma importante contribuição ao campo emergente dos relógios periféricos os quais, em espécies de não mamíferos têm sido mais extensivamente estudados em Drosophila melanogaster e Danio rerio. Dentro deste contexto, nós mostramos que os melanóforos de Xenopus laevis representam um modelo ideal para a compreensão da modulação de ritmos circadianos por luz e hormônios / Light-dark cycles (LD) are considered important cues to entrain biological clocks. Positive and negative feedback loops of clock gene transcription and translation are the molecular basis underlying the mechanism of both central and peripheral clocks. The non-visual opsin, melanopsin (Opn4), expressed in the mammalian retina, is considered a circadian photopigment because it is responsible of entraining the endogenous biological clock. This photopigment is also present in the melanophores of Xenopus laevis, where it was first described, but its role in these cells is not fully understood. Non-mammalian vertebrate species express two or more melanopsins, and in X. laevis there are two melanopsin genes, Opn4m and Opn4x. X. laevis melanophores respond to light with melanin granule dispersion, the maximal response being achieved at the wavelength of melanopsin maximal excitation. Among various hormones, endothelins also disperse melanosomes in Xenopus melanophores through a similar pathway as light does. Therefore, we decided to investigate whether light and endothelin modulate clock gene expression in Xenopus melanophores, using quantitative PCR to evaluate the relative mRNA levels of Per1, Per2, Clock and Bmal1. LD cycles elicited temporal changes in the expression of Per1, Per2 and Bmal1. A 10 min pulse of blue light increased the expression of Per1 and Per2, decreased Opn4x expression, but had no effect on Opn4m. In addition, a different localization was shown for each melanopsin: immunoreactivity for OPN4x was mainly seen in the cell membrane, whereas OPN4m was immunolocalized in the nucleus. These results taken together point to a differential role for each melanopsin in this model. Melanosome translocation was greater when a blue light pulse was applied in the presence of endothelin ET-3. And mRNA levels of Clock exhibited temporal variation in melanophores under LD cycles after 10-9 M ET-3 treatment, whereas Per1 expression was not affected by the hormone treatment. In addition, pharmacological assays indicated that Per1 and Per2 responses to blue light are evoked through the activation of the phosphoinositide pathway, which crosstalks with cGMP/protein kinase G (PKG) to activate the clock genes. These data suggest the participation of melanopsin in the photo-activation of clock genes and point to a minor role of endothelin as synchronizer for this cell line. Our results add an important contribution to the emerging field of peripheral clocks, which in non-mammalian species have been mostly studied in Drosophila melanogaster and Danio rerio. Within this context, we show that Xenopus laevis melanophores represent an ideal model to understanding circadian rhythms modulation by light and hormone

A adaptação temporal é fundamental para a sobrevivência de espécies que precisam coordenar sua fisiologia e comportamentos ajustando-se a sinais externos. Ritmos biológicos não são simplesmente uma resposta às mudanças de 24 horas no ambiente físico impostas pela rotação da Terra sobre o seu próprio eixo, ao contrário, surgem a partir de um sistema de cronometragem endógeno. No teleósteo Danio rerio, ainda não foi identificada a presença de uma região que atue como relógio central; alguns estudos têm evidenciado a existência de células e tecidos que contêm relógios circadianos autônomos, fotossensíveis, comprovando um outro tipo de regulação dos ritmos circadianos onde a percepção do ambiente e o ajuste do período circadiano são efetivados diretamente em nível celular. As consequências deletérias do aumento da temperatura são impedidas, em certa medida, por uma resposta adaptativa que assegura a sobrevivência celular na presença de calor. Esta via de sobrevivência ativada por calor, conhecida como resposta ao choque térmico, é composta por uma cascata de eventos que conduzem à indução de proteínas de choque térmico (HSPs) que minimizam a lesão celular aguda. Acredita-se que os sistemas de percepção dos ciclos diários de temperatura e luminosidade sofreram as mesmas pressões seletivas em sua co-evolução, resultando em sua associação. As bases da sensação térmica estão em um grupo de canais altamente conservados, presente em todos os metazoários estudados até o momento e envolvidos em uma série de modalidades sensoriais, os canais de potencial receptor transiente (TRP); os que respondem a estímulos térmicos foram agrupados em uma subfamília e denominados termoTRPs. O objetivo deste trabalho foi investigar a influência do pulso de temperatura (33 ºC) na expressão de genes de relógio e de proteínas de choque térmico, bem como o papel do canal TRPV1, em células embrionárias de blástula de Danio rerio, denominadas ZEM-2S, submetidas a escuro constante (DD) ou ciclos claro-escuro (LD 12:12). Através de PCR em tempo real (quantitativo) demonstrou-se que as células ZEM-2S expressam os genes dos seguintes canais TRP: trpA1a, trpA1b, trpV1/2, trpV4, trpC6, trpM2, trpM4a, trpM4b/c e trpM5. Após um pulso de temperatura, observou-se um aumento no transcrito de hsp90 aa1 em células mantidas tanto em DD como em LD, sendo a expressão de hsp90 aa1 em LD, no ponto uma hora, duas vezes menor quando comparada a sua expressão no mesmo ponto temporal em DD. O pulso de temperatura não promoveu efeito em nenhum dos genes do relógio estudados (bmal1a, bmal1, bmal2, cry1a, cry1b, per1, per2) quando as células foram mantidas em DD. Porém, o transcrito de per2 aumentou em resposta ao pulso de temperatura quando as células foram sincronizadas pelos ciclos claro-escuro. A inibição do canal TRPV1 não alterou o efeito induzido pelo pulso de temperatura na expressão do gene hsp90 aa1 em células ZEM-2S mantidas em DD. Por outro lado, nossos dados permitem afirmar que o mesmo participa parcialmente na indução do aumento da expressão do gene per2 pelo estímulo térmico em células mantidas em LD, tendo em vista um decaimento significativo na resposta deste gene. Os dados obtidos neste trabalho abrem uma nova perspectiva sobre a investigação da relação temperatura e genes de relógio, colocando um novo “ator” na regulação deste fenômeno: o canal TRPV1 / Temporal adaptation is essential for the survival of species which need to coordinately adjust their physiology and behavior to external signals. Biological rhythms are not just a response to the 24 hour changes in the physical environment imposed by the rotation of the Earth around its own axis, but they arise from an endogenous timing system. In the teleost Danio rerio, there has not been identified so far a region in the nervous system that could act as a central clock; some studies have reported the existence of cells and tissues which contain photosensitive, autonomous circadian clocks, demonstrating the existence of another type of circadian rhythm regulation in which environment perception and entrainment of the circadian period are directly effected at cell level. The deleterious consequences of temperature increase are prevented by an adaptive response which assures cell survival in the presence of heat. This survival pathway activated by heat, known as response to temperature shock, is signaled by a cascade of events leading to the induction of thermal shock proteins (HSPs) which attenuate the acute cell lesion. It is believed that the systems perceiving temperature and light daily cycles were subject to the same selective pressures during their co-evolution, resulting in their association. The base of thermal sensation is a family of highly conserved channels, present in all metazoans studied to date, and involved in a variety of sensorial modalities, the transient receptor potential channels (TRP); those responding to thermal stimuli were grouped in a sub-family named thermo-TRPs. The aim of this work was to investigate the influence of a temperature pulse (33 ºC) on the expression of clock and heat shock protein genes, as well as the role of TRPV1 channel, in blastula embryonic cells of Danio rerio, named ZEM-2S, subject to constant dark (DD) or light-dark cycles (LD). Using quantitative PCR, we demonstrated that ZEM-2S cells express genes for the following TRP channels: trpA1a, trpA1b, trpV1/2, trpV4, trpC6, trpM2, trpM4a, trpM4b/c and trpM5. After the pulse of temperature, we observed an increase of hsp90 aa1 transcripts in DD as well as in LD; hsp90 aa1 expression 1 hour after the stimulus was two-fold lower in LD than in DD. Temperature pulse did not affect the expression of any of the studied clock genes (bmal1a, bmal1, bmal2, cry1a, cry1b, per1, per2), when the cells were kept in DD. However, per2 transcript increased in response to the temperature pulse when the cells were synchronized by light-dark cycles. Inhibition of TRPV1 channel did not change the effect induced by the temperature pulse on hsp90 aa1 in ZEM-2S cells kept in DD. On the other hand, our data suggest that this channel participates, at least partially, in the temperature-induced increase of per2 in cells maintained in LD, as indicated by the significant decay observed in the gene response in the presence of the inhibitor. Our results open new investigative perspective about the relationship between temperature and clock genes, placing a new “actor” in the regulation of the phenomenon: the TRPV1 channel

Os ciclos claro-escuro (CE) são considerados importantes pistas para o ajuste de relógios biológicos. Alças de retroalimentação positiva e negativa de transcrição e tradução de genes de relógio são a base molecular subjacente tanto a relógios centrais como periféricos. A opsina não visual, melanopsina (Opn4), expressa na retina de mamíferos, é considerada o fotopigmento circadiano pois é responsável pelo ajuste do relógio biológico endógeno. Este fotopigmento também está presente nos melanóforos de Xenopus laevis, onde ele foi descrito pela primeira vez, mas seu papel nestas células ainda não está completamente esclarecido. Espécies de vertebrados não mamíferos expressam duas ou mais melanopsinas e, no caso de X. laevis, há dois genes, Opn4m and Opn4x. Melanóforos de X. laevis respondem à luz com dispersão dos grânulos de melanina, a resposta máxima sendo atingida no comprimento de onda correspondente àquele de excitação máxima da melanopsina. Entre vários hormônios, endotelinas também dispersam os melanossomos em melanóforos de Xenopus através de via similar àquela evocada pela luz. Tendo esses fatos em mente, decidimos investigar se a luz e a endotelina modulam a expressão de genes de relógio em melanóforos de Xenopus, usando PCR quantitativo para avaliar os níveis relativos de RNAm de Per1, Per2, Clock e Bmal1. Ciclos CE promoveram alterações temporais na expressão de Per1, Per2 e Bmal1. Pulsos de 10 min de luz azul aumentaram a expressão de Per1 e Per2, diminuíram a expressão de Opn4x, mas não tiveram efeito sobre Opn4m. Ainda mais, diferentes localizações foram mostradas para cada melanopsina: imunorreatividade para OPN4x foi vista principalmente na membrana celular, enquanto OPN4m foi imuno-localizada no núcleo. Estes resultados em conjunto apontam para funções diferenciais das duas melanopsinas neste modelo. A translocação de grânulos de melanina foi maior quando um pulso de luz azul foi aplicado na presença de endotelina ET-3. E os níveis de RNAm de Clock exibiram variação temporal em melanóforos submetidos a CE após tratamento com ET-3 10-9M, enquanto a expressão de Per1 não foi afetada pelo tratamento hormonal. Em adição, ensaios farmacológicos indicaram que as respostas de Per1 e Per2 à luz azul são evocadas através da ativação da via de fosfoinositídeos, com crosstalks com GMPc/proteina quinase G (PKG) para ativar os genes de relógio. Estes dados sugerem a participação de melanopsina na foto-ativação de genes de relógio, e apontam para uma participação menor de endotelina como sincronizador desta linhagem celular. Nossos resultados constituem uma importante contribuição ao campo emergente dos relógios periféricos os quais, em espécies de não mamíferos têm sido mais extensivamente estudados em Drosophila melanogaster e Danio rerio. Dentro deste contexto, nós mostramos que os melanóforos de Xenopus laevis representam um modelo ideal para a compreensão da modulação de ritmos circadianos por luz e hormônios / Light-dark cycles (LD) are considered important cues to entrain biological clocks. Positive and negative feedback loops of clock gene transcription and translation are the molecular basis underlying the mechanism of both central and peripheral clocks. The non-visual opsin, melanopsin (Opn4), expressed in the mammalian retina, is considered a circadian photopigment because it is responsible of entraining the endogenous biological clock. This photopigment is also present in the melanophores of Xenopus laevis, where it was first described, but its role in these cells is not fully understood. Non-mammalian vertebrate species express two or more melanopsins, and in X. laevis there are two melanopsin genes, Opn4m and Opn4x. X. laevis melanophores respond to light with melanin granule dispersion, the maximal response being achieved at the wavelength of melanopsin maximal excitation. Among various hormones, endothelins also disperse melanosomes in Xenopus melanophores through a similar pathway as light does. Therefore, we decided to investigate whether light and endothelin modulate clock gene expression in Xenopus melanophores, using quantitative PCR to evaluate the relative mRNA levels of Per1, Per2, Clock and Bmal1. LD cycles elicited temporal changes in the expression of Per1, Per2 and Bmal1. A 10 min pulse of blue light increased the expression of Per1 and Per2, decreased Opn4x expression, but had no effect on Opn4m. In addition, a different localization was shown for each melanopsin: immunoreactivity for OPN4x was mainly seen in the cell membrane, whereas OPN4m was immunolocalized in the nucleus. These results taken together point to a differential role for each melanopsin in this model. Melanosome translocation was greater when a blue light pulse was applied in the presence of endothelin ET-3. And mRNA levels of Clock exhibited temporal variation in melanophores under LD cycles after 10-9 M ET-3 treatment, whereas Per1 expression was not affected by the hormone treatment. In addition, pharmacological assays indicated that Per1 and Per2 responses to blue light are evoked through the activation of the phosphoinositide pathway, which crosstalks with cGMP/protein kinase G (PKG) to activate the clock genes. These data suggest the participation of melanopsin in the photo-activation of clock genes and point to a minor role of endothelin as synchronizer for this cell line. Our results add an important contribution to the emerging field of peripheral clocks, which in non-mammalian species have been mostly studied in Drosophila melanogaster and Danio rerio. Within this context, we show that Xenopus laevis melanophores represent an ideal model to understanding circadian rhythms modulation by light and hormone

O surgimento e a evolução da vida na terra foram possíveis graças ao desenvolvimento de mecanismos temporais precisos capazes de ajustar os processos fisiológicos que ocorriam no interior do organismo com os ciclos ambientais, promovendo assim, ganhos na capacidade adaptativa e reprodutiva dos indivíduos. Neste contexto, luz e temperatura são as duas pistas temporais mais relevantes para resetar o relógio endógeno e, aparentemente, esses dois zeitgebers trabalham juntos para manter os ritmos circadianos. Uma ampla gama de fotorreceptores e fotopigmentos evoluiu no sentido de perceber com alta sensibilidade a informação fótica fornecida pelo ambiente e, recentemente, foi demonstrado que a detecção de temperatura também pode ser exercida pelos fotopigmentos rodopsina e melanopsina, sendo mediada por canais TRP (Shen et al., 2011). Consideramos as células B16-F10 Per1::Luc como um modelo promissor para o estudo de luz e temperatura em relógios periféricos, uma vez que essa linhagem expressa os dois fotopigmentos apontados com função de termorreceptores em Drosophila. Nossos estudos nos permitiram verificar que a luz não atua como um agente sincronizador nessas células, que se mantiveram em livre curso mesmo após um pulso de 10 min de luz azul (650 lux). Por outro lado, um pulso de temperatura de 2,5º C acima da temperatura de manutenção por 1h atuou ajustando a expressão do gene Per1, imprimindo um ritmo circadiano, diferentemente do observado no controle. Com base nessas informações, hipotetizamos que a informação de luz, percebida via melanopsina na retina de mamíferos, levaria a regulação da temperatura circadiana pelo NSQ, e a temperatura corporal, por sua vez, poderia atuar como uma pista interna para a sincronização dos tecidos periféricos, tendo os canais TRP como mediadores. Para responder esta questão, utilizamos camundongos WT e TrpV1 KO submetidos a diferentes protocolos de luz e avaliamos a expressão de genes do relógio Per1, Per2, Clock e Bmal1 e dos canais TrpV1 e TrpA1 em tecidos periféricos. Identificamos que a glândula suprarrenal, fígado e tecido adiposo marrom possuem uma maquinaria do relógio tipicamente ativa e acreditamos que a oscilação dos genes de relógio observada nesses tecidos é expressiva. Interessantemente, vimos também que o TrpV1, além de ser expresso nos tecidos analisados em animais WT, apresenta uma transcrição rítmica no fígado e tecido adiposo marrom de animais em LD, corroborando nossa hipótese de que canais TRP atuam como mediadores da informação de luz aos tecidos periféricos. Dadas as diferenças encontradas entre os animais WT e TrpV1 KO, sugerimos que a presença do canal TRPV1 pode ser essencial, embora seu grau de envolvimento varie de acordo com o tecido. No que diz respeito ao canal TRPA1, encontramos dois resultados que merecem ser destacados. Primeiramente, identificamos no fígado de camundongos TrpV1 KO mantidos em LD uma provável compensação da expressão de TrpA1 na ausência de TrpV1 e, curiosamente, que o tecido adiposo marrom não expressa o canal TrpA1. Considerando os resultados deste trabalho sobre o envolvimento dos canais TRP em resposta à luz e temperatura, acreditamos ter fortalecido nossa hipótese inicial, principalmente após demonstrarmos o papel do canal TRPV1 e que tecidos periféricos são sincronizados por alterações de temperatura. / The life emergence and evolution on Earth were made possible by the development of precise temporal mechanisms able to adjust the physiological processes within an organism with environmental cycles, thus promoting gains in the adaptive and reproductive capacity of the individuals. In this context, light and temperature are the two most relevant time cues to reset the endogenous clock; apparently these two zeitgebers work together to keep the circadian rhythms. A wide variety of photoreceptors and photopigments evolved in order to precisely perceive the photic information provided by the environment, and recently it has been shown that the temperature detection can also be exerted by the photopigments rhodopsin and melanopsin, being mediated by TRP channels (Shen et al., 2011). We have identified B16-F10 Per1::Luc cells as a promising model for the study of light and temperature effects on peripheral clocks, since this cell line expresses both photopigments pointed as thermoreceptors in Drosophila. Our studies allowed us to demonstrate that light does not act as a synchronizing agent on those cells, which remained in free running after a 10 min pulse of blue light (650 lux). On the other hand, a temperature pulse of 2.5º C above the maintenance temperature, for 1h, adjusted Per1 gene expression, imprinting a circadian rhythm, which was not observed in the control. Based on this information, we hypothesized that the light perceived via melanopsin by the mammalian retina would lead to the regulation of the circadian temperature by the SCN, and the body temperature, in turn, could act as an inner cue for the synchronization of the peripheral tissues, having the TRP channels as mediators. To answer this question, we have used WT and TrpV1 KO mice under different light protocols and evaluated the expression of clock genes Per1, Per2, Clock and Bmal1 and TrpV1 and TrpA1 channels in peripheral tissues. We found that the adrenal gland, liver and brown adipose tissue have a typically active clock machinery, and the oscillation of clock genes observed in these tissues is significant. Interestingly, we observed that TrpV1 is expressed in those tissues, and presents a rhythmic transcription in the liver and brown adipose tissue of LD maintained animals, confirming our hypothesis that TRP channels act as mediators of light information to peripheral tissues. In face of the differences between WT and trpV1 KO animals, we suggest that the presence of the TRPV1 channel may be essential, although its degree of involvement may vary according to the tissue. In terms of TRPA1 channel, we found two results that deserve to be highlighted. Firstly, we identified in the liver of TrpV1 KO mice maintained in LD a presumable compensation of TrpA1 expression in the absence of TrpV1 and, interestingly, the brown adipose tissue does not express TrpA1 channel. Considering the findings of this study on the participation of TRP channels in responses to light and temperature, we believe we have strengthened our initial hypothesis, especially after we have demonstrated the role of TRPV1 channel, and that peripheral tissues may be synchronized by temperature changes.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A hiperatividade locomotora e as alterações nos ritmos circadianos têm sido descritas em roedores e humanos expostos ao etanol durante o desenvolvimento. Considerando que a atividade locomotora em camundongos é conhecida por variar ao longo das fases do ciclo claro escuro, é possível que o fenótipo hiperativo resultante da exposição precoce ao etanol também varie em função da hora do dia. Além disso, é possível que a hiperatividade apresentada pelos indivíduos expostos ao etanol durante o desenvolvimento esteja associada com distúrbios no sistema de controle do ritmo circadiano. Neste estudo, avaliamos estas duas possibilidades realizando uma análise circadiana da atividade locomotora e da expressão dos genes de relógio de camundongos adolescentes expostos ao etanol durante o período de surto de crescimento cerebral. Para tanto, camundongos suíços criados e mantidos em um ciclo claro/escuro de 12h (luzes acesas às 2:00h, apagadas as 14:00h) foram injetados com etanol (5g/kg ip, grupo ETOH) ou um volume equivalente de solução salina (grupo SAL) em dias alternados do segundo ao oitavo dias pós-natais. No 30 dia pós-natal, os animais foram testados em campo aberto por 15 minutos em diferentes momentos do ciclo claro/escuro: durante a fase clara entre 6:00 e 7:30h e entre12:00 e 13:30h; durante a fase escura entre 18:00 e 19:30h e entre 0:00 e 01:30h. Durante a fase escura os testes foram realizados sob iluminação com luz vermelha. Após os testes comportamentais, alguns animais foram randomicamente selecionados para as análises de imunofluorescência da expressão dos genes PER 1, 2 e 3 no núcleo supraquiasmático. Ao longo dos seis primeiros minutos, a atividade locomotora dos animais testados durante o período claro não mudou significativamente ou apresentou um leve aumento e a dos animais testados no período escuro apresentou uma marcante redução. Além disso, o grupo de animais testados entre 00:00 e 1:30h apresentou a maior atividade locomotora e o grupo dos animais testados entre 12:00 e 13:30h apresentou a menor atividade locomotora. De modo importante, a exposição neonatal ao etanol promoveu hiperatividade locomotora apenas no grupo de animais testados entre 00:00 e 1:30h. Em relação aos genes de controle do ritmo circadiano, a exposição precoce ao etanol afetou apenas a expressão do gene Per1 que foi menor entre 18:00 e 19:30h. O fato de que a expressão dos genes de controle do ritmo circadiano foi alterada no meio da fase escura e que a hiperatividade locomotora foi observada apenas no final da fase escura é compatível com a hipótese de que a hiperatividade induzida pelo etanol pode estar associada com as perturbações de controle do ritmo circadiano. / Locomotor hyperactivity and alterations of circadian rhythmicity have been described both in rodents and in humans exposed to ethanol during development. Considering that spontaneous locomotor activity in mice is known to vary as a function of the time of the day, it is conceivable that the expression of the locomotor hyperactivity phenotype resulting from developmental ethanol exposure also varies throughout the day. In addition, it is possible that the hyperactivity presented by individuals early exposed to ethanol is associated with a dysfunction in the control system of the circadian rhythm. In this study, we tested these two possibilities by performing a circadian analysis of the locomotor activity and the expression of clock genes in adolescent mice exposed to ethanol during the brain growth spurt period. Subjects were Swiss mice that were bred and maintained in our laboratory on a 12:12h light/dark cycle (lights on: 2:00, lights off: 14:00). From postnatal day 2 (PN2) to PN8, litters either received ethanol (5 l/g i.p., 25% in saline solution) or an equivalent volume of saline solution every other day. At PN30, locomotor activity was automatically assessed for 15 min in the open field test. During the light period, the animals were tested between 6:00 and 7:30 h or between 12:00 and 13:30 h whereas during the dark period the tests were performed between 18:00 and 19:30 h or between 0:00 and 1:30 h. During the dark period, the tests were conducted under red dim light illumination. After the behavioral tests, a sample of animals was randomly selected for the analysis by immunofluorescence of the expression of genes PER 1, 2 and 3 in the suprachiasmatic nucleus. Throughout the first 6 min, the locomotor activity of animals tested during the light period did not change or only increased slightly, while animals tested during the dark period presented a marked reduction. Furthermore, animals tested between 00:00 and 1:30 h presented the highest activity while animals tested between 12:00 and 13:30 h presented the lowest locomotor activity. Importantly, neonatal exposure to ethanol caused locomotor activity only in those animals tested between 00:00 and 1:30 h. As for the the clock genes, neonatal exposure to ethanol only affected the PER 1 expression, which was lowest between 18:00 and 19:30. Our data is in line with the idea that locomotor activity varies as a function of the time of the day. The fact that the expression of a clock gene was altered in then middle of the dark cycle and that locomotor hyperactivity was observed only at the end of this period is compatible with the hypothesis that the hyperactivity observed as result of ethanol exposure is associated with alterations in the control of the circadian rhythm.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A hiperatividade locomotora e as alterações nos ritmos circadianos têm sido descritas em roedores e humanos expostos ao etanol durante o desenvolvimento. Considerando que a atividade locomotora em camundongos é conhecida por variar ao longo das fases do ciclo claro escuro, é possível que o fenótipo hiperativo resultante da exposição precoce ao etanol também varie em função da hora do dia. Além disso, é possível que a hiperatividade apresentada pelos indivíduos expostos ao etanol durante o desenvolvimento esteja associada com distúrbios no sistema de controle do ritmo circadiano. Neste estudo, avaliamos estas duas possibilidades realizando uma análise circadiana da atividade locomotora e da expressão dos genes de relógio de camundongos adolescentes expostos ao etanol durante o período de surto de crescimento cerebral. Para tanto, camundongos suíços criados e mantidos em um ciclo claro/escuro de 12h (luzes acesas às 2:00h, apagadas as 14:00h) foram injetados com etanol (5g/kg ip, grupo ETOH) ou um volume equivalente de solução salina (grupo SAL) em dias alternados do segundo ao oitavo dias pós-natais. No 30 dia pós-natal, os animais foram testados em campo aberto por 15 minutos em diferentes momentos do ciclo claro/escuro: durante a fase clara entre 6:00 e 7:30h e entre12:00 e 13:30h; durante a fase escura entre 18:00 e 19:30h e entre 0:00 e 01:30h. Durante a fase escura os testes foram realizados sob iluminação com luz vermelha. Após os testes comportamentais, alguns animais foram randomicamente selecionados para as análises de imunofluorescência da expressão dos genes PER 1, 2 e 3 no núcleo supraquiasmático. Ao longo dos seis primeiros minutos, a atividade locomotora dos animais testados durante o período claro não mudou significativamente ou apresentou um leve aumento e a dos animais testados no período escuro apresentou uma marcante redução. Além disso, o grupo de animais testados entre 00:00 e 1:30h apresentou a maior atividade locomotora e o grupo dos animais testados entre 12:00 e 13:30h apresentou a menor atividade locomotora. De modo importante, a exposição neonatal ao etanol promoveu hiperatividade locomotora apenas no grupo de animais testados entre 00:00 e 1:30h. Em relação aos genes de controle do ritmo circadiano, a exposição precoce ao etanol afetou apenas a expressão do gene Per1 que foi menor entre 18:00 e 19:30h. O fato de que a expressão dos genes de controle do ritmo circadiano foi alterada no meio da fase escura e que a hiperatividade locomotora foi observada apenas no final da fase escura é compatível com a hipótese de que a hiperatividade induzida pelo etanol pode estar associada com as perturbações de controle do ritmo circadiano. / Locomotor hyperactivity and alterations of circadian rhythmicity have been described both in rodents and in humans exposed to ethanol during development. Considering that spontaneous locomotor activity in mice is known to vary as a function of the time of the day, it is conceivable that the expression of the locomotor hyperactivity phenotype resulting from developmental ethanol exposure also varies throughout the day. In addition, it is possible that the hyperactivity presented by individuals early exposed to ethanol is associated with a dysfunction in the control system of the circadian rhythm. In this study, we tested these two possibilities by performing a circadian analysis of the locomotor activity and the expression of clock genes in adolescent mice exposed to ethanol during the brain growth spurt period. Subjects were Swiss mice that were bred and maintained in our laboratory on a 12:12h light/dark cycle (lights on: 2:00, lights off: 14:00). From postnatal day 2 (PN2) to PN8, litters either received ethanol (5 l/g i.p., 25% in saline solution) or an equivalent volume of saline solution every other day. At PN30, locomotor activity was automatically assessed for 15 min in the open field test. During the light period, the animals were tested between 6:00 and 7:30 h or between 12:00 and 13:30 h whereas during the dark period the tests were performed between 18:00 and 19:30 h or between 0:00 and 1:30 h. During the dark period, the tests were conducted under red dim light illumination. After the behavioral tests, a sample of animals was randomly selected for the analysis by immunofluorescence of the expression of genes PER 1, 2 and 3 in the suprachiasmatic nucleus. Throughout the first 6 min, the locomotor activity of animals tested during the light period did not change or only increased slightly, while animals tested during the dark period presented a marked reduction. Furthermore, animals tested between 00:00 and 1:30 h presented the highest activity while animals tested between 12:00 and 13:30 h presented the lowest locomotor activity. Importantly, neonatal exposure to ethanol caused locomotor activity only in those animals tested between 00:00 and 1:30 h. As for the the clock genes, neonatal exposure to ethanol only affected the PER 1 expression, which was lowest between 18:00 and 19:30. Our data is in line with the idea that locomotor activity varies as a function of the time of the day. The fact that the expression of a clock gene was altered in then middle of the dark cycle and that locomotor hyperactivity was observed only at the end of this period is compatible with the hypothesis that the hyperactivity observed as result of ethanol exposure is associated with alterations in the control of the circadian rhythm.

A adaptação temporal é fundamental para a sobrevivência de espécies que precisam coordenar sua fisiologia e comportamentos ajustando-se a sinais externos. Ritmos biológicos não são simplesmente uma resposta às mudanças de 24 horas no ambiente físico impostas pela rotação da Terra sobre o seu próprio eixo, ao contrário, surgem a partir de um sistema de cronometragem endógeno. No teleósteo Danio rerio, ainda não foi identificada a presença de uma região que atue como relógio central; alguns estudos têm evidenciado a existência de células e tecidos que contêm relógios circadianos autônomos, fotossensíveis, comprovando um outro tipo de regulação dos ritmos circadianos onde a percepção do ambiente e o ajuste do período circadiano são efetivados diretamente em nível celular. As consequências deletérias do aumento da temperatura são impedidas, em certa medida, por uma resposta adaptativa que assegura a sobrevivência celular na presença de calor. Esta via de sobrevivência ativada por calor, conhecida como resposta ao choque térmico, é composta por uma cascata de eventos que conduzem à indução de proteínas de choque térmico (HSPs) que minimizam a lesão celular aguda. Acredita-se que os sistemas de percepção dos ciclos diários de temperatura e luminosidade sofreram as mesmas pressões seletivas em sua co-evolução, resultando em sua associação. As bases da sensação térmica estão em um grupo de canais altamente conservados, presente em todos os metazoários estudados até o momento e envolvidos em uma série de modalidades sensoriais, os canais de potencial receptor transiente (TRP); os que respondem a estímulos térmicos foram agrupados em uma subfamília e denominados termoTRPs. O objetivo deste trabalho foi investigar a influência do pulso de temperatura (33 ºC) na expressão de genes de relógio e de proteínas de choque térmico, bem como o papel do canal TRPV1, em células embrionárias de blástula de Danio rerio, denominadas ZEM-2S, submetidas a escuro constante (DD) ou ciclos claro-escuro (LD 12:12). Através de PCR em tempo real (quantitativo) demonstrou-se que as células ZEM-2S expressam os genes dos seguintes canais TRP: trpA1a, trpA1b, trpV1/2, trpV4, trpC6, trpM2, trpM4a, trpM4b/c e trpM5. Após um pulso de temperatura, observou-se um aumento no transcrito de hsp90 aa1 em células mantidas tanto em DD como em LD, sendo a expressão de hsp90 aa1 em LD, no ponto uma hora, duas vezes menor quando comparada a sua expressão no mesmo ponto temporal em DD. O pulso de temperatura não promoveu efeito em nenhum dos genes do relógio estudados (bmal1a, bmal1, bmal2, cry1a, cry1b, per1, per2) quando as células foram mantidas em DD. Porém, o transcrito de per2 aumentou em resposta ao pulso de temperatura quando as células foram sincronizadas pelos ciclos claro-escuro. A inibição do canal TRPV1 não alterou o efeito induzido pelo pulso de temperatura na expressão do gene hsp90 aa1 em células ZEM-2S mantidas em DD. Por outro lado, nossos dados permitem afirmar que o mesmo participa parcialmente na indução do aumento da expressão do gene per2 pelo estímulo térmico em células mantidas em LD, tendo em vista um decaimento significativo na resposta deste gene. Os dados obtidos neste trabalho abrem uma nova perspectiva sobre a investigação da relação temperatura e genes de relógio, colocando um novo “ator” na regulação deste fenômeno: o canal TRPV1 / Temporal adaptation is essential for the survival of species which need to coordinately adjust their physiology and behavior to external signals. Biological rhythms are not just a response to the 24 hour changes in the physical environment imposed by the rotation of the Earth around its own axis, but they arise from an endogenous timing system. In the teleost Danio rerio, there has not been identified so far a region in the nervous system that could act as a central clock; some studies have reported the existence of cells and tissues which contain photosensitive, autonomous circadian clocks, demonstrating the existence of another type of circadian rhythm regulation in which environment perception and entrainment of the circadian period are directly effected at cell level. The deleterious consequences of temperature increase are prevented by an adaptive response which assures cell survival in the presence of heat. This survival pathway activated by heat, known as response to temperature shock, is signaled by a cascade of events leading to the induction of thermal shock proteins (HSPs) which attenuate the acute cell lesion. It is believed that the systems perceiving temperature and light daily cycles were subject to the same selective pressures during their co-evolution, resulting in their association. The base of thermal sensation is a family of highly conserved channels, present in all metazoans studied to date, and involved in a variety of sensorial modalities, the transient receptor potential channels (TRP); those responding to thermal stimuli were grouped in a sub-family named thermo-TRPs. The aim of this work was to investigate the influence of a temperature pulse (33 ºC) on the expression of clock and heat shock protein genes, as well as the role of TRPV1 channel, in blastula embryonic cells of Danio rerio, named ZEM-2S, subject to constant dark (DD) or light-dark cycles (LD). Using quantitative PCR, we demonstrated that ZEM-2S cells express genes for the following TRP channels: trpA1a, trpA1b, trpV1/2, trpV4, trpC6, trpM2, trpM4a, trpM4b/c and trpM5. After the pulse of temperature, we observed an increase of hsp90 aa1 transcripts in DD as well as in LD; hsp90 aa1 expression 1 hour after the stimulus was two-fold lower in LD than in DD. Temperature pulse did not affect the expression of any of the studied clock genes (bmal1a, bmal1, bmal2, cry1a, cry1b, per1, per2), when the cells were kept in DD. However, per2 transcript increased in response to the temperature pulse when the cells were synchronized by light-dark cycles. Inhibition of TRPV1 channel did not change the effect induced by the temperature pulse on hsp90 aa1 in ZEM-2S cells kept in DD. On the other hand, our data suggest that this channel participates, at least partially, in the temperature-induced increase of per2 in cells maintained in LD, as indicated by the significant decay observed in the gene response in the presence of the inhibitor. Our results open new investigative perspective about the relationship between temperature and clock genes, placing a new “actor” in the regulation of the phenomenon: the TRPV1 channel

O surgimento e a evolução da vida na terra foram possíveis graças ao desenvolvimento de mecanismos temporais precisos capazes de ajustar os processos fisiológicos que ocorriam no interior do organismo com os ciclos ambientais, promovendo assim, ganhos na capacidade adaptativa e reprodutiva dos indivíduos. Neste contexto, luz e temperatura são as duas pistas temporais mais relevantes para resetar o relógio endógeno e, aparentemente, esses dois zeitgebers trabalham juntos para manter os ritmos circadianos. Uma ampla gama de fotorreceptores e fotopigmentos evoluiu no sentido de perceber com alta sensibilidade a informação fótica fornecida pelo ambiente e, recentemente, foi demonstrado que a detecção de temperatura também pode ser exercida pelos fotopigmentos rodopsina e melanopsina, sendo mediada por canais TRP (Shen et al., 2011). Consideramos as células B16-F10 Per1::Luc como um modelo promissor para o estudo de luz e temperatura em relógios periféricos, uma vez que essa linhagem expressa os dois fotopigmentos apontados com função de termorreceptores em Drosophila. Nossos estudos nos permitiram verificar que a luz não atua como um agente sincronizador nessas células, que se mantiveram em livre curso mesmo após um pulso de 10 min de luz azul (650 lux). Por outro lado, um pulso de temperatura de 2,5º C acima da temperatura de manutenção por 1h atuou ajustando a expressão do gene Per1, imprimindo um ritmo circadiano, diferentemente do observado no controle. Com base nessas informações, hipotetizamos que a informação de luz, percebida via melanopsina na retina de mamíferos, levaria a regulação da temperatura circadiana pelo NSQ, e a temperatura corporal, por sua vez, poderia atuar como uma pista interna para a sincronização dos tecidos periféricos, tendo os canais TRP como mediadores. Para responder esta questão, utilizamos camundongos WT e TrpV1 KO submetidos a diferentes protocolos de luz e avaliamos a expressão de genes do relógio Per1, Per2, Clock e Bmal1 e dos canais TrpV1 e TrpA1 em tecidos periféricos. Identificamos que a glândula suprarrenal, fígado e tecido adiposo marrom possuem uma maquinaria do relógio tipicamente ativa e acreditamos que a oscilação dos genes de relógio observada nesses tecidos é expressiva. Interessantemente, vimos também que o TrpV1, além de ser expresso nos tecidos analisados em animais WT, apresenta uma transcrição rítmica no fígado e tecido adiposo marrom de animais em LD, corroborando nossa hipótese de que canais TRP atuam como mediadores da informação de luz aos tecidos periféricos. Dadas as diferenças encontradas entre os animais WT e TrpV1 KO, sugerimos que a presença do canal TRPV1 pode ser essencial, embora seu grau de envolvimento varie de acordo com o tecido. No que diz respeito ao canal TRPA1, encontramos dois resultados que merecem ser destacados. Primeiramente, identificamos no fígado de camundongos TrpV1 KO mantidos em LD uma provável compensação da expressão de TrpA1 na ausência de TrpV1 e, curiosamente, que o tecido adiposo marrom não expressa o canal TrpA1. Considerando os resultados deste trabalho sobre o envolvimento dos canais TRP em resposta à luz e temperatura, acreditamos ter fortalecido nossa hipótese inicial, principalmente após demonstrarmos o papel do canal TRPV1 e que tecidos periféricos são sincronizados por alterações de temperatura. / The life emergence and evolution on Earth were made possible by the development of precise temporal mechanisms able to adjust the physiological processes within an organism with environmental cycles, thus promoting gains in the adaptive and reproductive capacity of the individuals. In this context, light and temperature are the two most relevant time cues to reset the endogenous clock; apparently these two zeitgebers work together to keep the circadian rhythms. A wide variety of photoreceptors and photopigments evolved in order to precisely perceive the photic information provided by the environment, and recently it has been shown that the temperature detection can also be exerted by the photopigments rhodopsin and melanopsin, being mediated by TRP channels (Shen et al., 2011). We have identified B16-F10 Per1::Luc cells as a promising model for the study of light and temperature effects on peripheral clocks, since this cell line expresses both photopigments pointed as thermoreceptors in Drosophila. Our studies allowed us to demonstrate that light does not act as a synchronizing agent on those cells, which remained in free running after a 10 min pulse of blue light (650 lux). On the other hand, a temperature pulse of 2.5º C above the maintenance temperature, for 1h, adjusted Per1 gene expression, imprinting a circadian rhythm, which was not observed in the control. Based on this information, we hypothesized that the light perceived via melanopsin by the mammalian retina would lead to the regulation of the circadian temperature by the SCN, and the body temperature, in turn, could act as an inner cue for the synchronization of the peripheral tissues, having the TRP channels as mediators. To answer this question, we have used WT and TrpV1 KO mice under different light protocols and evaluated the expression of clock genes Per1, Per2, Clock and Bmal1 and TrpV1 and TrpA1 channels in peripheral tissues. We found that the adrenal gland, liver and brown adipose tissue have a typically active clock machinery, and the oscillation of clock genes observed in these tissues is significant. Interestingly, we observed that TrpV1 is expressed in those tissues, and presents a rhythmic transcription in the liver and brown adipose tissue of LD maintained animals, confirming our hypothesis that TRP channels act as mediators of light information to peripheral tissues. In face of the differences between WT and trpV1 KO animals, we suggest that the presence of the TRPV1 channel may be essential, although its degree of involvement may vary according to the tissue. In terms of TRPA1 channel, we found two results that deserve to be highlighted. Firstly, we identified in the liver of TrpV1 KO mice maintained in LD a presumable compensation of TrpA1 expression in the absence of TrpV1 and, interestingly, the brown adipose tissue does not express TrpA1 channel. Considering the findings of this study on the participation of TRP channels in responses to light and temperature, we believe we have strengthened our initial hypothesis, especially after we have demonstrated the role of TRPV1 channel, and that peripheral tissues may be synchronized by temperature changes.

The skin has a system that can detect light in a fashion similar to the retina. Although its presence was initially reported almost 20 years ago, only in 2011 functional studies started to be reported. The biological clock of the skin has also been reported in the beginning of the century, but its function and relevance still remain unexplored. Thus, this Ph.D. project was designed to explore the functionality of both systems in melanocytes, and whether the disruption of these systems is associated with the development of melanoma cancer. Using in vitro, in vivo, and bioinformatics approaches, we have shown that: 1) the biological clock of malignant melanocytes is more responsive to visible light, UVA radiation, estradiol, and temperature compared to normal cells; 2) UVA radiation is detected by melanopsin (OPN4) and rhodopsin (OPN2), which triggers a cGMP related cascade that leads to immediate pigment darkening (IPD) in normal and malignant melanocytes; 3) in addition to detecting UVA radiation, OPN4 also senses thermal energy, which activates the biological clock of both normal and malignant melanocytes; 4) regarding the biological clock, we have provided several layers of evidence that proves that in melanoma a chronodisruption scenario is established compared to healthy skin and/or normal pigment cells; 5) in vivo tumor samples display a low amplitude circadian rhythm of clock gene expression and an ultradian oscillatory profile in melanin content; 6) a non-metastatic melanoma leads to a systemic chronodisruption, which we suggest that could favor the metastatic process; 7) in human melanoma, we demonstrated the role of BMAL1 as a prognostic marker and a putative marker of immune therapy success. Taken altogether, these results significantly contributed to the literature as it brought to light new and interesting targets and processes, which will be explored in future projects / A pele possui um sistema que pode detectar luz de forma análoga à retina. Embora a presença deste sistema tenha sido inicialmente descrita quase há 20 anos, apenas no ano de 2011 estudos funcionais começaram a ser relatados. Sabe-se que o relógio biológico da pele também foi identificado no início do século, mas sua função e relevância ainda continuam pouco exploradas. Diante deste cenário, este projeto de doutorado foi desenhado para investigar a funcionalidade de ambos os sistemas em melanócitos e se perturbação dos mesmos estaria associada com o desenvolvimento de melanoma. Através do uso de abordagens in vitro, in vivo e de bioinformática, nós demonstramos que: 1) o relógio biológico de melanócitos malignos é mais responsivo à luz visível, radiação UVA, estradiol e temperatura comparado ao de células normais; 2) a radiação UVA é detectada por melanopsina (OPN4) e rodopsina (OPN2), que ativam uma via de sinalização dependente de GMPc, levando ao processo de pigmentação imediata (IPD) em melanócitos normais e malignos; 3) além de detecção de radiação UVA, a OPN4 também detecta energia térmica que, por sua vez, ativa o relógio biológico de melanócitos normais e malignos; 4) relativo ao relógio biológico, provamos por diferentes abordagens que, no melanoma, um cenário de cronoruputura está estabelecido em comparação a pele saudável e/ou melanócitos; 5) tumores in vivo apresentam um ritmo circadiano de baixa amplitude na expressão dos genes de relógio e um ritmo ultradiano oscilatório no conteúdo de melanina; 6) um melanoma não metastático leva a um quadro sistêmico de cronoruptura, o qual sugerimos favorecer o processo de metástase; 7) em melanoma humano, demonstramos o papel do gene BMAL11 como marcador de prognóstico e um possível indicador de sucesso de imunoterapias. Portanto, este projeto contribuiu de forma significante para a literatura científica uma vez que trouxe à luz novos e interessantes alvos terapêuticos e processos, os quais serão explorados em projetos futuros