Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les cellules chromaffines des glandes surrénales sont des cellules neuroendocrines excitables impliquées dans la sécrétion de catécholamines. En réponse à un stress, ces hormones, parmi les premières à être libérées exercent de multiples actions sur leurs organes-cibles, contribuant à la réponse adaptive de l'organisme. Ainsi, élucider la physiopathologie du stress est un enjeu de santé publique et mieux connaître les mécanismes permettant au tissu médullosurrénalien d'optimiser la sécrétion de catécholamines aux besoins de l'organisme est un défi à relever.La sécrétion des catécholamines est liée à l'activité électrique des cellules chromaffines et élucider les mécanismes cellulaires qui en contrôlent l'excitabilité est d'intérêt. L'activité électrique de ces cellules est régulée par le nerf splanchnique ainsi que par des conductances ioniques intrinsèques. Dans ce contexte, les conductances opérant autour du potentiel de repos jouent un rôle majeur dans le déclenchement des potentiels d'action. C'est en particulier le cas du canal NALCN (sodium leak channel), récemment décrit comme régulant le potentiel de repos des neurones. C'est pourquoi nous avons orienté nos travaux vers la caractérisation du rôle de NALCN dans l'excitabilité des cellules chromaffines, dans des tranches de glandes surrénales de souris. L'enregistrement du potentiel de membrane révèle qu'environ 62% des cellules chromaffines présentent des potentiels d'action spontanés et que le profil de décharge suit un mode régulier ou un mode en bouffées. Des enregistrements plus longs révèlent qu'une même cellule présente alternativement ces 2 modes de décharge. Un changement de potentiel de quelques mV autour du potentiel de repos favorise un mode, indiquant que les courants ioniques actifs autour du potentiel de repos sont des composantes cruciales de l'excitabilité cellulaire. NALCN est-il un de ces courants?Pour commencer, nous avons observé, par hybridation in situ, la présence du transcrit codant NALCN dans les cellules chromaffines chez la souris (coll Dr. Ventéo, INM, Montpellier). Nous avons alors cherché à déterminer si NALCN est impliqué dans l'activité électrique des cellules chromaffines. Nous avons utilisé un protocole de diminution de la concentration extracellulaire de Na+, classiquement utilisé pour l'étude électrophysiologique de NALCN. La diminution du Na+ extracellulaire induit une hyperpolarisation et un arrêt des potentiels d'action. Cet effet n'est pas bloqué par la TTX. En potentiel imposé, la diminution du Na+ réduit le courant de maintien, elle n'est ni bloquée par la TTX ni par le Cs+. La courbe courant/potentiel du courant sensible à la réduction du Na+ révèle un courant linéaire entre -130 et -50 mV et un potentiel d'inversion en accord avec la contribution de plusieurs espèces ioniques. Ce courant présente une perméabilité majeure au Na+ vs K+. Ainsi, ces résultats décrivent une conductance ionique partageant des propriétés biophysiques et pharmacologiques similaires à celles de NALCN.Afin de poursuivre dans cette direction, nous avons initié des travaux ambitieux visant à éteindre l'expression du gène codant NALCN dans les cellules chromaffines, au travers d'une stratégie d'injection de virus in vivo. Une construction codant pour un shRNA dirigé contre NALCN, a été injectée dans la glande surrénale gauche. Les résultats sont très encourageants, montrant i) la présence, dans les glandes injectées, de cellules chromaffines transduites et ii) une diminution significative de l'expression de NALCN dans les glandes injectées avec le ShRNA-anti NALCN. Cette approche de transduction virale mérite d'être poursuivie.En conclusion, et même si les résultats actuels ne permettent pas d'affirmer avec certitude que NALCN contribue à l'excitabilité des cellules chromaffines, ce travail de thèse apporte néanmoins une contribution majeure à l'étude de l'excitabilité de ces cellules et ouvre des perspectives attractives quant au rôle de NALCN. / Adrenal chromaffin cells are excitable neuroendocrine cells involved in the secretion of catecholamines. Once delivered into the blood circulation, these hormones exert multiple actions, leading to physiological adjustments enabling the organism to cope with stress. Deciphering the physiology/pathology of stress is a major public health issue, especially in the field of the mechanisms that lead to optimal catecholamine secretion.The electrical activity of chromaffin cells critically shapes the catecholamine secretory pattern. Elucidating the mechanisms regulating the firing discharge is therefore of interest. In situ, chromaffin cell excitability is regulated by both the splanchnic nerve inputs and the intrinsic ion conductances expressed in cells. Regarding this, the conductances operating near the resting membrane potential are crucial in the cell competence to spontaneously fire. In particular, the background current flowing through the sodium leak channel NALCN has been recently reported to tune the resting potential of neuronal cells. This finding prompted us to investigate the possible contribution of NALCN to chromaffin cell excitability in mouse acute adrenal slices. The first part of my thesis was aimed at investigating chromaffin cell electrical firing pattern. Whole-cell recordings indicate that about 62% of mouse chromaffin cell spontaneously fire and exhibit two discharge patterns, a regular firing mode and a bursting mode. Long-lasting recordings of spontaneous electrical activity reveal that the two firing modes can occur in the same cells. When the membrane potential is challenged around the resting value, the firing pattern alternate between the two modes, indicating that currents operating around the resting membrane potential are key components in regulating cell excitability. Is NALN one of these currents?To answer this question, we first unveiled, by in situ hybridization, the presence of the transcript encoding NALCN in mouse chromaffin cells (coll with Dr. Ventéo, INM, Montpellier). Second, we performed electrophysiological experiments using protocols and pharmacological agents commonly used to study NALCN currents. Decreasing external NaCl leads to a robust membrane hyperpolarization, abrogating action potentials. This effect is not blocked by TTX. In voltage-clamp conditions, external Na+ reduction leads to a decrease in the holding current. This effect is not blocked by Cs+. Depolarizing voltage ramps unveil that the current blocked by lowering external Na+ blocks is linear between -130 and -50 mV, and displays a reversal potential arguing for a non-selective conductance. The ionic permeability is dominant for Na+ over K+. Collectively, our results describe a voltage-independent and non-selective cationic conductance operating near the resting potential of mouse chromaffin cells. Its electrophysiological and pharmacological properties recapitulate two NALCN attributes.In the third part, we developed an ambitious approach aiming at silencing NALCN expression specifically in chromaffin cells in vivo. Viral vectors encoding anti-NALCN shRNA under the control of the tyrosine hydroxylase promoter, as well as appropriate positive and negative viral constructs, were injected in the left gland. As promising results, transduced cells were detected in the injected glands only and a significant decrease in NALCN expression was observed in glands injected with the anti-NALCN shRNA. As such, the data collected from in vivo manipulation of NALCN expression are encouraging and this approach deserves to be pursued.This thesis describes a Na+-sensitive current operating near the resting membrane potential of mouse chromaffin cells, sharing biophysical and pharmacological properties with NALCN. Even though further experiments are needed to ascertain that NALCN supports this conductance, our work contributes to a better knowledge of chromaffin cell excitability.

Les récepteurs Erythropoietin-producing hepatocyte (EPH) constituent la plus grande famille de récepteurs à activité tyrosine kinase transmembranaires. Leur activité kinase peut être induite par leurs ligands, les éphrines (EFN). Une fois activés, ces récepteurs sont impliqués dans la régulation de la fonction cellulaire par transduction antérograde ou rétrograde du signal EPH-EFN. Au cours de la dernière décennie, nos études ont démontré que les EPH / EFN jouent un rôle important dans la régulation de la pression artérielle par la modulation de la contractilité des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC). EPHB6, EFNB1 et EFNB3 ont un effet négatif sur la contractilité des VSMC et la pression artérielle, tandis que EPHB4 et EFNB2 montrent un effet positif. La famille EPH / EFN est donc un nouveau système yin et yang qui ajuste finement l'homéostasie de la pression artérielle. Nous avons également constaté que les catécholamines urinaires de 24 h sont réduites chez les souris mâles EPHB6 knockout (KO), suggérant que l’EPHB6 régule la pression artérielle non seulement via les VSMC mais aussi par la sécrétion de catécholamine (CAT). La régulation de CAT par l’EPHB6 dépend de la testostérone car (1) les niveaux réduits de CAT ne sont pas observés chez les souris femelles EPHB6 KO ; et (2) la castration chez les souris mâles EPHB6 KO ramène la CAT à des niveaux normaux. Durant ma thèse, nous avons étudié le mécanisme impliqué dans la régulation de la sécrétion et de la synthèse des catécholamines chez les cellules chromaffines des glandes surrénales (AGCC) par la voie de signalisation de l’EPHB6. En ex vivo, la teneur totale en épinéphrine et la sécrétion d'épinéphrine déclenchée par l'acétylcholine (ACh) sont toutes deux réduites dans les glandes surrénales venant des souris KO mâles mais pas dans celles venant des femelles ou de mâles castrés. Ensuite, nous avons observé une diminution de l’afflux de Ca2+ dépendant de l'ACh dans les AGCC venant des souris mâles EPHB6 KO, ce qui découle de l'effet non-génomique de la testostérone. En appliquant le patch clamping de cellules entières sur les AGCC, nous avons démontré que la diminution d’afflux de Ca2+ dans ces cellules est causée par l’augmentation des courants de potassium à grande conductance activé par le calcium (BK). En utilisant l'enregistrement ampérométrique, nous avons constaté que la sécrétion de CAT par les AGCC est compromise en l'absence d'EPHB6. Nous avons également observé une diminution du désassemblage de la F-actine corticale dans les AGCC venant de souris mâles KO associée à une diminution de l'exocytose des vésicules contenant es catécholamines. Ces deux phénomènes n’ont pas été observés chez les femelles KO ni chez les mâles castrés. Des études complémentaires ont montré que le désassemblage défectueux de la F-actine dans les AGCC est régulé par la signalisation inverse de l'EPHB6 à l'EFNB1 via deux voies de signalisations différentes : la voie du membre A de la famille des homologues Ras (RHOA) et la voie de la tyrosine kinase proto-oncogène de la famille Src (FYN) / proto-oncogène c-ABL / la calponine monooxygénase associée aux microtubules et le domaine LIM contenant 1 (MICAL-1). En outre, nous avons observé que la diminution de la teneur totale en épinéphrine dans la glande surrénale venant des souris mâles KO est causée par une expression altérée de la tyrosine hydroxylase (TH), qui est l’enzyme limitant la vitesse dans la biosynthèse des CAT. L'effet non génomique de la testostérone a également participé dans ce processus. Nous avons révélé que la signalisation inverse d'EPHB6 à EFNB1 contribue à la surexpression de TH dans les AGCC par l’augmentation de son niveau de transcription. La voie en aval de cette signalisation inverse implique la petite famille Rac GTPase 1 (RAC1) / MAP kinase kinase 7 (MKK7) / c-Jun N-terminal kinase (JNK) / proto-oncogène c-Jun / activator protein 1 (AP1) / réponse de croissance précoce 1 (EGR1). Ces travaux démontrent pour la première fois un rôle spécifique de la famille EPH / EFN dans la régulation de la biologie médullaire de la glande surrénale. La signalisation rétrograde d’EPHB6 via EFNB1 régule la synthèse et la sécrétion des catécholamines de concert avec la testostérone dans les AGCC. / Erythropoietin-producing hepatocyte (Eph) receptors are the largest family of cell surface transmembrane receptor tyrosine kinases. Their kinase activity can be activated by their ligands, ephrins (EFNs), and involved in cell function regulation through either EPH-EFN forward or reverse signaling transduction. In the last decade, we have revealed the previously unknown function of EPHs/EFNs in the regulation of blood pressure by modulating the contractility of vascular smooth muscle cells (VSMCs). EPHB6, EFNB1, and EFNB3 have a negative effect on the VSMCs contractility and blood pressure, while EPHB4 and EFNB2 show a positive effect instead. Thus, EPH/EFN family is a novel yin and yang system that finely tunes blood pressure homeostasis. EPHB6 also targets cells responsible for catecholamine (CAT) secretion in addition to the VSMCs, since we found that the 24-h urine catecholamines are reduced in male EPHB6 knockout (KO) mice. This phenotype in EPHB6 KO mice is testosterone-dependent because the reduced CAT levels are not observed in female KO mice; castration in KO male mice reverts the CAT levels to a normal range. In this research, we investigated the mechanism for the regulation of catecholamine secretion and synthesis in adrenal gland chromaffin cells (AGCCs) by EPHB6 signaling. In ex vivo, the total content of epinephrine and the acetylcholine (ACh)-triggered epinephrine secretion were both reduced in the adrenal gland from KO male but not female or castrated mice. Then, we found a reduced ACh-dependent Ca2+ influx in AGCCs from male EPHB6 KO mice, and this effect depended on the non-genomic effect of testosterone. The results of whole-cell patch clamping on AGCCs indicated that the enhanced large-conductance calcium-activated potassium (BK) currents were responsible for the reduced Ca2+ influx in these cells. Using amperometry recording, we found that CAT secretion by AGCCs was compromised in the absence of EPHB6. The cortical F-actin disassembly in AGCCs from KO male but not female or castrated mice was reduced, accompanied by decreased catecholamine vesicle exocytosis. Further study showed such defective F-actin disassembly in AGCCs was regulated by the reverse signaling from EPHB6 to EFNB1 via the Ras homolog family member A (RHOA) and proto-oncogene Src family tyrosine kinase (FYN)/proto-oncogene c-ABL/microtubule-associated monooxygenase calponin and LIM domain containing 1 (MICAL-1) pathways. Further, we observed that the reduced total content of epinephrine in the adrenal gland from male KO mice was caused by impaired expression of tyrosine hydroxylase (TH), the rate-limiting enzyme in CAT biosynthesis. The non-genomic effect of testosterone was also involved in this process. We revealed that the reverse signaling from EPHB6 to EFNB1 contributed to the up-regulation of TH expression in AGCCs by enhancing its transcription. The downstream pathway of this reverse signaling involved Rac family small GTPase 1 (RAC1)/MAP kinase kinase 7 (MKK7)/c-Jun N-terminal kinase (JNK)/ proto-oncogene c-Jun/activator protein 1 (AP1)/early growth response 1 (EGR1). The present research, for the first time, revealed the specific role of the EPH/EFN family on the regulation of the adrenal gland medullary biology. The EPHB6 reverse signaling through EFNB1 in concert with testosterone regulates the catecholamine synthesis and secretion in AGCCs.

La majorité des hyperplasies macronodulaires bilatérales des surrénales avec syndrome de Cushing ACTH-indépendant (AIMAH) est due à l’expression aberrante de divers récepteurs hormonaux au niveau du cortex surrénalien. Les gènes responsables des AIMAH familiales avec récepteurs aberrants n’ont pas été identifiés. Le but de ce projet est de les identifier. Une étude de liaison, visant à identifier la ou les régions du génome comprenant le ou les gènes pouvant être en cause dans les AIMAH familiales, a été réalisée en utilisant l’ADN des membres d’une famille (10 malades et 7 sains) originaire du Québec, atteinte d’AIMAH et syndrome de Cushing et caractérisée par l’expression des récepteurs β-adrénergique et V1-vasopressine. Diverses régions chromosomiques entre les personnes atteintes et non-atteintes de la famille ont été soulignées. Un total de 707453 SNPs a été obtenu, et après analyse statistique, 159 SNPs significatifs, pouvant être associés au phénotype, ont été mis en évidence entre les deux groupes. Il a été constaté que la majorité de ces SNPs se situaient sur les régions chromosomiques 1q32.1 et 16q12.2. Une étude du transcriptome a aussi été réalisée en utilisant l’ADN des tumeurs de deux patients de la famille, ainsi que l’ADN d'autres tumeurs surrénaliennes. Les analyses statistiques ont permis d’identifier 15 gènes susceptibles d’être reliés à la maladie (11 surexprimés et 4 sous-exprimés). En utilisant les données de ces deux études, nous avons ciblé six gènes du chromosome 1 (ATP2B4, PPP1R12B, SOX13, CACNA1S, ADORA1et PHLDA3), un du chromosome 16 (CHD9) et un du chromosome 13 (SPRY2), afin de rechercher la présence de mutations. Le séquençage n’a révélé aucun changement de nucléotide dans les gènes PPP1R12B et SOX13. Dans les gènes ATP2B4, CACNA1S, ADORA1et PHLDA3, le séquençage a révélé des changements de nucléotides n’entrainant soit pas de changement d’acide aminé soit un changement d’acide aminé jugé « non pertinent », du fait qu’il ne permettait pas de différencier les sujets sains des sujets atteints. Pour ce qui est de CHD9 et SPRY2, le séquençage a permis d’identifier des changements de nucléotides entrainant des changements d’acides aminés de façon plus fréquente chez les sujets atteints par rapport aux sujets sains. En conclusion, nos travaux nous ont donc permis d’identifier, par étude de liaison et par analyse du transcriptome, des gènes candidats qui pourraient être responsables de cette pathologie. Le séquençage de ces gènes candidats a révélé des mutations de CHD9 et SPRY2. Ces résultats s’avèrent prometteurs puisque ces deux gènes produisent des protéines impliquées dans le remodelage de la chromatine et dans la régulation de la signalisation des protéines kinases. Le phénotypage et le génotypage des patients atteints doivent être poursuivis pour vérification. / The majority of ACTH-independent macronodular adrenal hyperplasia with Cushing's syndrome (AIMAH) is due to the aberrant expression of various receptors in the adrenal cortex. The genes responsible for familial AIMAH with aberrant receptors have not been identified. The aim of this project is to characterize them. A linkage study to identify the region or regions of the genome comprising the gene or genes that may be involved in familial AIMAH was performed using DNA of family members (10 affected and 7 non affected) born in Quebec and harboring AIMAH and Cushing's syndrome, under the aberrant regulation of B-adrenergic and V1-vasopressin receptors. Various chromosomal regions between patients and non-affected family were highlighted. A total of 707,453 SNPs were obtained, and after statistical analysis, 159 significant SNPs, possibly associated with phenotype, were found between the two groups. It was found that the majority of these SNPs were located on chromosomal regions 1q32.1 and 16q12.2. A transcriptome analysis was conducted using DNA from tumours of two patients of the family, as well as DNA from other adrenal tumours; Statistical analysis identified 15 genes that may be linked to disease (11 up-regulated and 4 under-expressed). Using data from these two studies, we identified six genes on chromosome 1 (ATP2B4, PPP1R12B, SOX13, ADORA1, CACNA1S and PHLDA3), one on chromosome 16 (CHD9) and one on chromosome 13 (SPRY2), to investigate the presence of mutations. The sequencing revealed no nucleotide changes in gene PPP1R12B and SOX13. In ATP2B4, CACNA1S, ADORA1 and PHLDA3, the sequencing not revealed nucleotides changes leading to either amino acid changes or an amino acid changes considered “not-relevant”, because they do not differentiate healthy individuals from affected. The sequencing of CHD9 and SPRY2 identified nucleotide changes causing amino acid changes more frequently in patients compared to healthy subjects. In conclusion, our work has therefore identified by linkage analysis and DNA microarray candidate genes that can be responsible to this disease, and mutations in two of these genes, CHD9 and SPRY2. These results are promising because these genes produce proteins involved in chromatin remodeling and regulation of signaling protein kinases. Phenotyping and genotyping of patients should be pursued further.

La majorité des hyperplasies macronodulaires bilatérales des surrénales avec syndrome de Cushing ACTH-indépendant (AIMAH) est due à l’expression aberrante de divers récepteurs hormonaux au niveau du cortex surrénalien. Les gènes responsables des AIMAH familiales avec récepteurs aberrants n’ont pas été identifiés. Le but de ce projet est de les identifier. Une étude de liaison, visant à identifier la ou les régions du génome comprenant le ou les gènes pouvant être en cause dans les AIMAH familiales, a été réalisée en utilisant l’ADN des membres d’une famille (10 malades et 7 sains) originaire du Québec, atteinte d’AIMAH et syndrome de Cushing et caractérisée par l’expression des récepteurs β-adrénergique et V1-vasopressine. Diverses régions chromosomiques entre les personnes atteintes et non-atteintes de la famille ont été soulignées. Un total de 707453 SNPs a été obtenu, et après analyse statistique, 159 SNPs significatifs, pouvant être associés au phénotype, ont été mis en évidence entre les deux groupes. Il a été constaté que la majorité de ces SNPs se situaient sur les régions chromosomiques 1q32.1 et 16q12.2. Une étude du transcriptome a aussi été réalisée en utilisant l’ADN des tumeurs de deux patients de la famille, ainsi que l’ADN d'autres tumeurs surrénaliennes. Les analyses statistiques ont permis d’identifier 15 gènes susceptibles d’être reliés à la maladie (11 surexprimés et 4 sous-exprimés). En utilisant les données de ces deux études, nous avons ciblé six gènes du chromosome 1 (ATP2B4, PPP1R12B, SOX13, CACNA1S, ADORA1et PHLDA3), un du chromosome 16 (CHD9) et un du chromosome 13 (SPRY2), afin de rechercher la présence de mutations. Le séquençage n’a révélé aucun changement de nucléotide dans les gènes PPP1R12B et SOX13. Dans les gènes ATP2B4, CACNA1S, ADORA1et PHLDA3, le séquençage a révélé des changements de nucléotides n’entrainant soit pas de changement d’acide aminé soit un changement d’acide aminé jugé « non pertinent », du fait qu’il ne permettait pas de différencier les sujets sains des sujets atteints. Pour ce qui est de CHD9 et SPRY2, le séquençage a permis d’identifier des changements de nucléotides entrainant des changements d’acides aminés de façon plus fréquente chez les sujets atteints par rapport aux sujets sains. En conclusion, nos travaux nous ont donc permis d’identifier, par étude de liaison et par analyse du transcriptome, des gènes candidats qui pourraient être responsables de cette pathologie. Le séquençage de ces gènes candidats a révélé des mutations de CHD9 et SPRY2. Ces résultats s’avèrent prometteurs puisque ces deux gènes produisent des protéines impliquées dans le remodelage de la chromatine et dans la régulation de la signalisation des protéines kinases. Le phénotypage et le génotypage des patients atteints doivent être poursuivis pour vérification. / The majority of ACTH-independent macronodular adrenal hyperplasia with Cushing's syndrome (AIMAH) is due to the aberrant expression of various receptors in the adrenal cortex. The genes responsible for familial AIMAH with aberrant receptors have not been identified. The aim of this project is to characterize them. A linkage study to identify the region or regions of the genome comprising the gene or genes that may be involved in familial AIMAH was performed using DNA of family members (10 affected and 7 non affected) born in Quebec and harboring AIMAH and Cushing's syndrome, under the aberrant regulation of B-adrenergic and V1-vasopressin receptors. Various chromosomal regions between patients and non-affected family were highlighted. A total of 707,453 SNPs were obtained, and after statistical analysis, 159 significant SNPs, possibly associated with phenotype, were found between the two groups. It was found that the majority of these SNPs were located on chromosomal regions 1q32.1 and 16q12.2. A transcriptome analysis was conducted using DNA from tumours of two patients of the family, as well as DNA from other adrenal tumours; Statistical analysis identified 15 genes that may be linked to disease (11 up-regulated and 4 under-expressed). Using data from these two studies, we identified six genes on chromosome 1 (ATP2B4, PPP1R12B, SOX13, ADORA1, CACNA1S and PHLDA3), one on chromosome 16 (CHD9) and one on chromosome 13 (SPRY2), to investigate the presence of mutations. The sequencing revealed no nucleotide changes in gene PPP1R12B and SOX13. In ATP2B4, CACNA1S, ADORA1 and PHLDA3, the sequencing not revealed nucleotides changes leading to either amino acid changes or an amino acid changes considered “not-relevant”, because they do not differentiate healthy individuals from affected. The sequencing of CHD9 and SPRY2 identified nucleotide changes causing amino acid changes more frequently in patients compared to healthy subjects. In conclusion, our work has therefore identified by linkage analysis and DNA microarray candidate genes that can be responsible to this disease, and mutations in two of these genes, CHD9 and SPRY2. These results are promising because these genes produce proteins involved in chromatin remodeling and regulation of signaling protein kinases. Phenotyping and genotyping of patients should be pursued further.