Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-31 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / As leishmanioses constituem um importante problema de saúde pública no Brasil, em razão da incidência da doença associada à alta taxa de morbidade. Devido ao fato da Leishmania ser um parasita intracelular no hospedeiro vertebrado, estudos de moléculas do parasita, que atuam na interação do parasita com a célula do hospedeiro vertebrado, são de alta importância para uma melhor compreensão dos mecanismos de invasão e sobrevivência do parasita. Seguindo este racional, nesta tese foram identificados, purificados e caracterizados os proteofosfoglicanos secretados por formas promastigotas (pPPG) e amastigotas (aPPG) de L. (L.) amazonensis, respectivamente de meios de cultura e de macrófagos infectados com esses parasitas. A purificação dos PPGs foi realizada por combinações de cromatografias em DEAE-Sephadex, Octyl-Sepharose e Bio-Gel A- 0.5 e ultracentrifugações. Por "Western blotting" e radioimunoensaio em fase sólida utilizando diferentes anticorpos monoclonais (mAbs), observou-se que o pPPG apresenta alto peso molecular, contem cadeias fosfoglicanas e é reconhecido por mAbs anti-glicoesfingolipídeos (GSLs) ST-3 e ST-5, e mAb anti-lipofosfoglicano (LPG) VST-1. Em estudos imunohistoquímicos de cortes de lesão de hamsters infectados com L. (L.) amazonensis, observou-se a presença de material reativo com os mAbs ST-3, ST-4 e ST-5 na superfície do parasita e em torno do vacúolo parasitóforo. Após delipidação de cortes da lesão (processo em que são extraídos os glicolipídeos), a reatividade com os mAbs limitou-se a algumas regiões do vacúolo, sugerindo a possível localização dos aPPGs na célula infectada. O aPPG apresentou padrão de migração eletroforética similar ao pPPG, e foi reconhecido pelos mAbs ST-3, ST-4 e ST-5, mas não pelo mAb VST-1. A análise da composição monossacarídica dos PPGs de L. (L.) amazonensis por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa mostrou que o pPPG é composto por manose:galactose:glucose, na proporção molar de 1:1,2:1,7. Por outro lado, o aPPG apresenta em sua estrutura manose:galactose:glucose na proporção de 1:2:9. Em experimentos paralelos foram avaliados os níveis de produção de óxido nítrico e do fator de necrose tumoral por macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c expostos a diferentes estímulos com antígenos parasitários de L. (L.) amazonensis. Observamos que LPG, pPPG e GSLs per se não estimularam os macrófagos na produção de NO. Por outro lado o aPPG per se mostrou-se capaz de estimular a produção de NO. LPGs e pPPGs foram capazes de estimular a produção de óxido nítrico quando incubados na presença de interferon gama. Por outro lado, GSLs e interferon gama não foram capazes de estimular a produção de NO em macrófagos. Nenhum dos antígenos de Leishmania utilizados estimulou a produção de fator de necrose tumoral. O perfil glicolipídico de amastigotas axênicos de L. (L.) amazonensis em comparação com o de amastigota isolado de lesão foi analisado por HPTLC, tendo sido verificadas diferenças significativas no padrão cromatográfico dos glicolipídeos. Os glicolipídeos de formas axênicas não são reconhecidos por mAbs anti-GSLs. A organização dos glico(esfingo)lipídeos e glicoinositolfosfolipídeos (GIPLs) de formas amastigotas e promastigotas de L. (L.) amazonensis foi analisada. Para isso, membranas resistentes ao detergente não-iônico Triton X-100 foram isoladas a 4ºC. Em formas amastigotas foi verificado que os GSLs, esfingomielina e esteróis estão predominantemente localizados em frações de membranas resistentes ao tratamento com Triton X-100. Em formas promastigotas foi verificado que inositol fosforilceramida, GIPLs e esteróis estão localizados preferencialmente nas membranas de baixa densidade insolúveis em detergente nãoiônico a 4ºC. Em um outro conjunto de experimentos foi analisado o efeito de inibidor de síntese de esfingolipídeo, Aureobadisina A (AbA), em formas promastigotas e amastigotas de L. (L.) amazonensis. Em formas promastigotas foi observado que a AbA inibe o crescimento dos parasitas, entretanto esse efeito é reversível. Em ensaios de infectividade in vivo observou-se que camundongos BALB/c infectados com parasitas tratados com AbA apresentavam um desenvolvimento tardio das lesões em relação aos infectados com parasitas sem tratamento. Por outro lado, em culturas axênicas de amastigotas isoladas de lesão foi observado que a AbA é tóxica aos parasitas. Após a adição da AbA em cultura de macrófagos infectados com formas amastigotas, verificou-se uma diminuição significativa da infecção de macrófagos. Todos estes resultados sugerem que os glicoconjugados de L. (L.) amazonensis analisados nesta tese podem atuar na interação entre o parasita e o hospedeiro, exercendo papéis importantes na sobrevivência e progressão da leishmaniose. / Leishmaniasis is an important public health problem in Brazil. Since Leishmania is an obligatory intracellular parasite in the host, studies of parasite antigens responsible for interaction with the host cell during the infection are important to understand the mechanism of parasite invasion and survival. Following this rationale, in this work it was purified and characterized proteophosphoglycans secreted by promastigote (pPPG) and amastigote (aPPG) forms in culture supernatant and into parasitophorus vacuole of infected macrophages, respectively. The PPGs were purified by combination of chromatography (DEAE-Sephadex, Octyl-Sepharose and Bio-Gel A-0.5) and ultracentrifugation. By Western blotting and solid phase radioimmunoassay using different monoclonal antibodies (mAbs), it was observed that pPPG presents high molecular weight, contains phosphoglycan chains and it is recognized by anti-glycosphingolipids (GSLs) mAbs ST-3, ST-5 and by anti-lipophosphoglycan (LPG) mAb VST-1. Immunohistological analysis of hamster footpad lesions infected with L. (L.) amazonensis using different mAbs showed a strong labeling on amastigote forms and inside/around macrophage parasitophorus vacuole. After delipidation of lesion sections with a mixture of isopropanol/hexane/water (condition in which GSLs are removed) it was observed that the mAbs reactivity localized inside the vacuole remained in infected tissue, thus indicating the possible localization of aPPGs secreted by L. (L.) amazonensis recognized by the mAbs. The aPPG showed similar electrophoretic migration of pPPG, and it was recognized by mAbs anti-GSLs ST-3, ST-4 and ST-5, but not by mAb VST-1. The analysis of monosaccharide compositon of PPGs, determined by gas chromatography - mass spectrometry, showed that pPPG is constituted of mannose:galactose:glucose at molar proportion of 1:1.2:1.7. On the other hand, aPPGs showed in their strucuture mannose:galactose:glucose at proportion of 1:2:9. In parallel assays, nitric oxide (NO) and tumor necrose factor (TNF-α) production by BALB/c macrophages exposed to different L. (L.) amazonensis antigen stimuli were also analyzed. The pPPG, LPG and GSLs by themselves were not able to induce nitric oxide production by macrophages. On the hand, aPPG per se was able to induce nitric oxide production. The LPG and pPPGs were able to synergize with INF-γ the production of NO. Furthermore, GSLs were not able to stimulate NO production in presence of INF-γ. None of the antigens did induce the pro-inflammatory cytokines TNF-α secretion. The glycolipid profile of axenic and lesion amastigotes of L. (L.) amazonensis was analyzed by HPTLC. The results showed a significative difference in glycolipid chromatographic profile among the parasites, and axenic amastigote glycolipids were not recognized by anti-GSL mAbs. The membrane organization of glyco(sphingo)lipids and glycoinositolphospholipids (GIPLs) of L. (L.) amazonensis amastigote and promastigote forms were studied after Triton X-100 extraction at 4ºC. In amastigote forms it was observed that GSLs, sterol and sphingomyelin are present in the Triton X-100 resistant membrane domains. In promastigote parasites it was observed that inositol phosphorylceramide, GIPLs, sterol and a small amount of phosphatidylethanolamine are localized in the low-density membranes insoluble in non-ionic detergent at 4ºC. In another set of experiments, it was analyzed the effect of Aureobasidin A (AbA) in L. (L.) amazonensis promastigote and amastigote forms. AbA inhibited completely promastigotes growth, however, it should be noted that this effect was reversible. Infectivity assays in BALB/c mice using promastigote forms treated with AbA showed a delay in lesion development. On the other hand, the effect of AbA in L. (L.) amazonensis amastigotes showed that this drug is toxic to amastigote forms. AbA effect was also analyzed during the infection of macrophages by amastigote forms of L. (L.) amazonensis. After adition of AbA in the culture, it was observed a significative reduction of phagocytic index. The present study shows that Leishmania glycoconjugates may be crucial in parasite-host cell interaction, playing important role in the parasite survival and in the disease progress. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-25 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Células iNKT restritas a CD1d são protetoras contra o desenvolvimento de melanoma murino, B16F10-Nex2, subcutaneamente em animais singênicos. Essa proteção pode ser deduzida pelo desenvolvimento acelerado do tumor em animais geneticamente deficientes na expressão de CD1d (CD1d-KO), com sobrevida significantemente menor do que a observada com animais WT submetidos ao mesmo desafio de células tumorais. CD1d é uma família de glicoproteínas relacionadas a MHC classe I, envolvidas na apresentação, principalmente em células dendríticas, de antígenos lipídicos para células iNKT. No presente trabalho focalizamos a identificação do lipídeo endógeno expresso em células de melanoma capaz de induzir uma resposta de vigilância imune baseada em células iNKT. Verificamos também a possibilidade de proteger animais contra o desenvolvimento tumoral utilizando células dendríticas primadas com o lipídeo endógeno. A extração dos componentes lipídicos de melanoma foi realizada a partir de tumores crescidos in vivo, evitando-se assim artefatos do cultivo celular in vitro. Foram testados três diferentes protocolos de extração (A, B e C), obtendo-se 14 frações diferentes que foram testadas na ativação do hibridoma DN32.D3, uma linhagem de células NKT murinas imortalizadas. A fração F3 do protocolo A (F3A) ativou o hibridoma DN32.D3 medido pela produção de IL-2. Para uma eficiente apresentação dos lipídeos dessa fração utilizamos com sucesso células dendríticas de medula óssea (BMDC) nos ensaios in vitro e in vivo, para apresentação de F3A e glicolipídeos ativadores de células NKT, agalactosilceramida (a-GalCer) e isoglobotrihexosilceramida (iGb3). Na tentativa de isolar o composto estimulatório presente em F3A de melanoma, essa fração foi analisada por HPTLC revelada com diversos reagentes específicos para resíduos de ácido siálico, açúcares neutros, fosfato e lipídeos totais. A fração também foi submetida a separações em colunas de sílica, ensaio de “immunostaining” quimioluminescente com lectina de Bandeiraea simplicifolia e análises em espectrometria de massa, onde foram identificados gangliosídeos como GM3 bem como glicoesfingolipídeos neutros como iGb3, Gb3, iGb4 e Gb4 por ESI-LIT-MS (electrosptray ionization-linear íon trap-mass spectrometry). Quando iGb3 foi incubado com BMDC e testado com células DN32D3 essas foram ativadas produzindo IL-2. GM3 consistentemente era um inibidor dessa ativação de células iNKT. Ensaios de citotoxicidade foram então realizados e verificamos que células de NKT estimuladas por BMDC incubadas com a-GalCer ou iGb3 circundavam as células tumorais B16F10-Nex2 visualizadas em microscopia de fluorescência e, em ensaio in vitro, as células NKT promoviam lise de até 40% das células tumorais B16F10-Nex2. Realizamos então ensaios in vivo, onde camundongos foram inoculados endovenosamente com células do melanoma murino e tratados ou não com células dendríticas primadas com a-GalCer ou iGb3. Ao excisarmos os pulmões dos animais, notamos que os grupos tratados com lipídeos ativadores de células NKT tinha cerca de 4 vezes menos nódulos pulmonares que o grupo não tratado. Nossos resultados mostram que o melanoma murino B16F10-Nex2 possui a molécula iGb3 e sua precursora iGb4, capaz de ativar células NKT conferindo a essas capacidade citotóxica in vitro contra o melanoma. Esse lipídeo (iGb3) também mostrou um efeito protetor contra metástases pulmonares oriundas do melanoma murino quando apresentado por células dendríticas utilizadas em protocolo de terapia celular. Esse é o primeiro trabalho mostrando que efetivamente um glicolipídeo endógeno ligante de CD1d é capaz de ativar células NKT com efeito protetor antitumoral, através de terapia celular com células dendríticas. Palavras chave: Melanoma B16F10-Nex2, células iNKT, glicoesfingolipídeos iGb3 e iGb4 GM3, células dendríticas, imuno vigilância. / CD1d-restricted iNKT cells are protective against the murine melanoma B16F10- Nex2 growing subcutaneously in syngeneic animals. This is inferred from the fast tumor growth in animals genetically deficient in CD1d (CD1d-KO), which showed a survival time significantly shorter than that of WT animals equally challenged with tumor cells. CD1d belongs to a family of glycoproteins resembling MHC class I, involved in the presentation, chiefly in dendritic cells, of lipidic antigens to iNKT cells. In the present work we focus on the identification of an endogenous lipid component expressed in melanoma cells able to induce an immunosurveillance response based on iNKT. We also investigated the possibility of animal protection against tumor development by using dendritic cells primed with the endogenous lipid. The extraction of membrane lipid components was carried out from in vivo grown tumors, thus avoiding artifacts from the in vitro grown cultures. Three different extraction protocols were tested (A, B, C), and 14 different fractions were obtained and tested for the activation of hybridoma DN32.D3, a cell line of immortalized murine NKT cells. Fraction F3 of protocol A (F3A) activated hybridoma DN32.D3 to produce IL-2. For an efficient presentation of lipids from this fraction we successfully used bone marrow dendritic cells (BMDC) on in vitro and in vivo assays. F3A and NKT-cell activating glycolipids, agalactosylceramide (a-GalCer) and isoglobohexosylceramide (iGb3), were tested. In the attempt to isolate the stimulatory component present in the melanoma F3A fraction, HPTLC was used and revealed with several specific reagents for sialic acid residues, neutral sugars, phosphate and total lipids. The fraction was also separated in silica columns, immunostained with Bandeiraea simplicifolia BS-1 lectin and analyzed by mass spectrometry. Ganglioside GM3 and neutral glycosphingolipids iGb3, Gb3, iGb4 and Gb4 were identified by ESI-LIT-MS (electrospray ionization- linear ion trap- mass spectrometry). By incubation of iGb3 with BMDC and these with DN32.D3 cells, the latter were activated to produce IL-2. GM3 consistently inhibited the activation of iNKT cells. Cytotoxicity assays were then carried out, in which we found that NKT cells stimulated by BMDC, primed with a-GalCer or iGb3, encircled the B16F10-Nex2 tumor cells as visualized by fluorescent microscopy. NKT cells promoted lysis of up to 40% of tumor cells. In vivo tests showed that mice injected endovenously with murine melanoma cells and treated with dendritic cells primed with a-GalCer or iGb3, had lungs with 4-fold fewer nodules than an equally challenged but untreated group. The present results show that the murine melanoma B16F10-Nex2 expresses iGb3 and its precursor iGb4, being able to activate NKT cells and conferring them a cytotoxic activity in vitro against melanoma. Such lipid (iGb3) was also protective in vivo reducing the melanoma pulmonary metastases when presented by dendritic cells used in cellular therapy protocol. This is the fist work showing effectively that an endogenous CD1d-restricted glycolipid able to activate iNKT cells display a protective antitumor effect, using cellular therapy with dendritic cells. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações