Este trabalho visa investigar a resposta sorológica para glicolipoproteína (GLP) de leptospiras com a finalidade de padronizar o uso deste antígeno em testes sorológicos para o diagnóstico da leptospirose humana. Dentre as proteínas envolvidas na patogenicidade das leptospiras, a GLP ainda não foi estudada quanto a imunogenicidade e quanto ao seu emprego como antígeno na detecção de anticorpos específicos. Assim, dot-ELISA para detecção de anticorpos IgG e IgM, com o emprego de GLP de leptospiras patogênica e não patogênica, foi padronizado. Foram testadas amostras pareadas de soros de 90 pacientes com leptospirose confirmada sorologicamente por MAT, sendo as primeiras amostras colhidas na fase aguda da doença e as segundas amostras após 10 a 15 dias. Foram testadas também amostras únicas de 30 pacientes de diferentes patologias, que apresentaram resultados negativos no MAT, pertencentes ao grupo controle. A detecção de anticorpos IgG não mostrou resultados satisfatórios, tendo sido, o seu estudo, descontinuado. Os resultados do dot-ELISA IgM mostraram sensibilidade de 100% nas amostras colhidas após soroconversão no MAT e a precocidade de detecção foi demonstrada pela alta positividade nas amostras colhidas na fase aguda da doença (76,6% para dot-ELISA com antígeno de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni e 90% com antígeno de Leptospira biflexa sorovar Patoc). A especificidade foi alta (96,6%), porém o dot-ELISA utilizando ambos os antígenos apresentou 3,3% de resultados falso-positivos. Este estudo demonstrou a importância da resposta imune humoral ao antígeno GLP de leptospiras. A utilização da GLP, no teste dot-ELISA para detecção de anticorpos IgM permitiu realizar o diagnóstico sorológico de forma simples, rápida e com alta eficiência diagnóstica. / The aim of this work was the study of serologic response against leptospira glycolipoprotein (GLP) for the purpose of standardizing its use as an antigen on serological tests to diagnose human leptospirosis. Among the proteins involved in the pathogenicity, GLP is yet to be studied regarding its immunogenicity and its use as an antigen in the detection of specific antibodies. That led to our standardization of dot-ELISA for detecting IgG and IgM antibodies, using GLP extracted from either pathogenic Leptospira interrogans serovar Copenhageni or nonpathogenic Leptospira biflexa serovar Patoc. Paired serum samples were taken from 90 patients with serologically confirmed leptospirosis, by MAT, with the first samples collected on the disease\'s acute phase and the second samples after a period of 10 to 15 days. We also tested single samples taken from 30 patients with other diseases, MAT negative, belonging to the control group. Detection rates for IgG antibodies were unsatisfactory, so the study for that use was discontinued. The dot-ELISA IgM results yielded 100% sensitivity on the samples taken after MAT seroconversion. The early detection pattern was evidenced by the high positivity rate on the samples taken during the disease\'s acute phase (76,6% dot-ELISA using Leptospira interrogans serovar Copenhageni antigen and 90% using Leptospira biflexa sorovar Patoc antigen). Specificity rates were high (96.6%), although a 3.3% rate of false-positive results was observed for dot-ELISA using both antigens. The present study revealed the importance of the humoral immune response against the GLP antigen. The use of GLP, on the dot-ELISA test for IgM antibodies afforded a simple, quick and effective diagnosis.

Este trabalho visa investigar a resposta sorológica para glicolipoproteína (GLP) de leptospiras com a finalidade de padronizar o uso deste antígeno em testes sorológicos para o diagnóstico da leptospirose humana. Dentre as proteínas envolvidas na patogenicidade das leptospiras, a GLP ainda não foi estudada quanto a imunogenicidade e quanto ao seu emprego como antígeno na detecção de anticorpos específicos. Assim, dot-ELISA para detecção de anticorpos IgG e IgM, com o emprego de GLP de leptospiras patogênica e não patogênica, foi padronizado. Foram testadas amostras pareadas de soros de 90 pacientes com leptospirose confirmada sorologicamente por MAT, sendo as primeiras amostras colhidas na fase aguda da doença e as segundas amostras após 10 a 15 dias. Foram testadas também amostras únicas de 30 pacientes de diferentes patologias, que apresentaram resultados negativos no MAT, pertencentes ao grupo controle. A detecção de anticorpos IgG não mostrou resultados satisfatórios, tendo sido, o seu estudo, descontinuado. Os resultados do dot-ELISA IgM mostraram sensibilidade de 100% nas amostras colhidas após soroconversão no MAT e a precocidade de detecção foi demonstrada pela alta positividade nas amostras colhidas na fase aguda da doença (76,6% para dot-ELISA com antígeno de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni e 90% com antígeno de Leptospira biflexa sorovar Patoc). A especificidade foi alta (96,6%), porém o dot-ELISA utilizando ambos os antígenos apresentou 3,3% de resultados falso-positivos. Este estudo demonstrou a importância da resposta imune humoral ao antígeno GLP de leptospiras. A utilização da GLP, no teste dot-ELISA para detecção de anticorpos IgM permitiu realizar o diagnóstico sorológico de forma simples, rápida e com alta eficiência diagnóstica. / The aim of this work was the study of serologic response against leptospira glycolipoprotein (GLP) for the purpose of standardizing its use as an antigen on serological tests to diagnose human leptospirosis. Among the proteins involved in the pathogenicity, GLP is yet to be studied regarding its immunogenicity and its use as an antigen in the detection of specific antibodies. That led to our standardization of dot-ELISA for detecting IgG and IgM antibodies, using GLP extracted from either pathogenic Leptospira interrogans serovar Copenhageni or nonpathogenic Leptospira biflexa serovar Patoc. Paired serum samples were taken from 90 patients with serologically confirmed leptospirosis, by MAT, with the first samples collected on the disease\'s acute phase and the second samples after a period of 10 to 15 days. We also tested single samples taken from 30 patients with other diseases, MAT negative, belonging to the control group. Detection rates for IgG antibodies were unsatisfactory, so the study for that use was discontinued. The dot-ELISA IgM results yielded 100% sensitivity on the samples taken after MAT seroconversion. The early detection pattern was evidenced by the high positivity rate on the samples taken during the disease\'s acute phase (76,6% dot-ELISA using Leptospira interrogans serovar Copenhageni antigen and 90% using Leptospira biflexa sorovar Patoc antigen). Specificity rates were high (96.6%), although a 3.3% rate of false-positive results was observed for dot-ELISA using both antigens. The present study revealed the importance of the humoral immune response against the GLP antigen. The use of GLP, on the dot-ELISA test for IgM antibodies afforded a simple, quick and effective diagnosis.

O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o principal ectoparasita bovino e causa importantes perdas econômicas nas criações de bovino. O controle imunológico é estudado como um método alternativo para seu controle, no entanto, uma vacina eficaz ainda necessita ser desenvolvida. A proteína BYC (Boophilus Yolk Pro-Cathepsin) é uma aspártico proteinase presente no ovo do carrapato e envolvida na embriogênese, já tendo sido testada como imunógeno vacinal. O propósito deste estudo foi avaliar se a inoculação de plasmídeos para expressão em células eucarióticas (BYCr-PC e BYCr-PME) contendo a região codificante para a proteína BYC poderiam gerar uma resposta imune específica. A região codificante da proteína BYC foi amplificada por PCR e clonada em dois vetores de expressão eucariotos (pcDNA3 e pME18Neo). Os clones, BYCr-PC e BYCr-PME foram utilizados para testes de inoculação de camundongos BALB/C por via intramuscular. Os camundongos receberam duas inoculações de 100 μg das construções (BYCr-PC ou BYCr-PME) e os controles negativos receberam somente PBS, pcDNA3 ou pME18Neo. A produção de anticorpos, após a inoculação, foi avaliada por Western Blotting e ELISA, sendo detectados anticorpos contra a proteína BYC nos camundongos inoculados com a construção BYCr-PC. A imunolocalização da proteína BYC nas amostras de músculo no local da inoculação foram realizadas com o monoclonal BrBm5 (anti-BYC). Estes resultados mostraram que a inoculação com o plasmídeo BYCr-PC induz a produção de anticorpos específicos e possibilita testar o uso de uma vacina de DNA como um método alternativo para o controle de carrapatos. / The Rhipicephalus (Boophilus) microplus tick is the major bovine ectoparasite and causes important economical losses on cattle breeding. The immunologic control has been studied as an alternative method for the tick control. However, an effective vaccine remains to be developed. BYC (Boophilus Yolk Pro-Cathepsin) is an aspartic proteinase found in eggs that is involved in the embryogenesis of Rhipicephalus (Boophilus) microplus, and it has been proposed as a probable antigen in vaccine development. The purpose of this study was to evaluate whether the immunization containing rBYC (rBYC-PC and rBYC-PME) could elicit a specific anti-BYC immune response in vivo. The cDNA of BYC was amplified by PCR and it was cloned into two eukaryotic expression vectors (pcDNA3 and pME18Neo). The clones, rBYC-PC and rBYC-PME, were produced in large scale for immunoassays. To evaluate the immunogenicity of BYC, BALB/c mice were immunized with DNA vaccine by intramuscular injection. The mice received two intramuscular inoculations of 100μg plasmids DNA (rBYCPC or rBYC-PME) and the negative controls received only PBS, pcDNA3 or pME18Neo. The production of antibody after the immunizations was evaluated by Western Blotting and ELISA. Antibodies against BYC in mice inoculated with rBYC-PC were detected. Immunolocalization of the rBYC protein in muscle samples from the injection site with rBYCPC was detected with monoclonal BrBm5 anti-BYC. These results show that DNA immunization produced specific anti-BYC antibodies and suggest that a DNA vaccine could prove useful to develop an alternative method for tick control.

O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o principal ectoparasita bovino e causa importantes perdas econômicas nas criações de bovino. O controle imunológico é estudado como um método alternativo para seu controle, no entanto, uma vacina eficaz ainda necessita ser desenvolvida. A proteína BYC (Boophilus Yolk Pro-Cathepsin) é uma aspártico proteinase presente no ovo do carrapato e envolvida na embriogênese, já tendo sido testada como imunógeno vacinal. O propósito deste estudo foi avaliar se a inoculação de plasmídeos para expressão em células eucarióticas (BYCr-PC e BYCr-PME) contendo a região codificante para a proteína BYC poderiam gerar uma resposta imune específica. A região codificante da proteína BYC foi amplificada por PCR e clonada em dois vetores de expressão eucariotos (pcDNA3 e pME18Neo). Os clones, BYCr-PC e BYCr-PME foram utilizados para testes de inoculação de camundongos BALB/C por via intramuscular. Os camundongos receberam duas inoculações de 100 μg das construções (BYCr-PC ou BYCr-PME) e os controles negativos receberam somente PBS, pcDNA3 ou pME18Neo. A produção de anticorpos, após a inoculação, foi avaliada por Western Blotting e ELISA, sendo detectados anticorpos contra a proteína BYC nos camundongos inoculados com a construção BYCr-PC. A imunolocalização da proteína BYC nas amostras de músculo no local da inoculação foram realizadas com o monoclonal BrBm5 (anti-BYC). Estes resultados mostraram que a inoculação com o plasmídeo BYCr-PC induz a produção de anticorpos específicos e possibilita testar o uso de uma vacina de DNA como um método alternativo para o controle de carrapatos. / The Rhipicephalus (Boophilus) microplus tick is the major bovine ectoparasite and causes important economical losses on cattle breeding. The immunologic control has been studied as an alternative method for the tick control. However, an effective vaccine remains to be developed. BYC (Boophilus Yolk Pro-Cathepsin) is an aspartic proteinase found in eggs that is involved in the embryogenesis of Rhipicephalus (Boophilus) microplus, and it has been proposed as a probable antigen in vaccine development. The purpose of this study was to evaluate whether the immunization containing rBYC (rBYC-PC and rBYC-PME) could elicit a specific anti-BYC immune response in vivo. The cDNA of BYC was amplified by PCR and it was cloned into two eukaryotic expression vectors (pcDNA3 and pME18Neo). The clones, rBYC-PC and rBYC-PME, were produced in large scale for immunoassays. To evaluate the immunogenicity of BYC, BALB/c mice were immunized with DNA vaccine by intramuscular injection. The mice received two intramuscular inoculations of 100μg plasmids DNA (rBYCPC or rBYC-PME) and the negative controls received only PBS, pcDNA3 or pME18Neo. The production of antibody after the immunizations was evaluated by Western Blotting and ELISA. Antibodies against BYC in mice inoculated with rBYC-PC were detected. Immunolocalization of the rBYC protein in muscle samples from the injection site with rBYCPC was detected with monoclonal BrBm5 anti-BYC. These results show that DNA immunization produced specific anti-BYC antibodies and suggest that a DNA vaccine could prove useful to develop an alternative method for tick control.

O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o principal ectoparasita bovino e causa importantes perdas econômicas nas criações de bovino. O controle imunológico é estudado como um método alternativo para seu controle, no entanto, uma vacina eficaz ainda necessita ser desenvolvida. A proteína BYC (Boophilus Yolk Pro-Cathepsin) é uma aspártico proteinase presente no ovo do carrapato e envolvida na embriogênese, já tendo sido testada como imunógeno vacinal. O propósito deste estudo foi avaliar se a inoculação de plasmídeos para expressão em células eucarióticas (BYCr-PC e BYCr-PME) contendo a região codificante para a proteína BYC poderiam gerar uma resposta imune específica. A região codificante da proteína BYC foi amplificada por PCR e clonada em dois vetores de expressão eucariotos (pcDNA3 e pME18Neo). Os clones, BYCr-PC e BYCr-PME foram utilizados para testes de inoculação de camundongos BALB/C por via intramuscular. Os camundongos receberam duas inoculações de 100 μg das construções (BYCr-PC ou BYCr-PME) e os controles negativos receberam somente PBS, pcDNA3 ou pME18Neo. A produção de anticorpos, após a inoculação, foi avaliada por Western Blotting e ELISA, sendo detectados anticorpos contra a proteína BYC nos camundongos inoculados com a construção BYCr-PC. A imunolocalização da proteína BYC nas amostras de músculo no local da inoculação foram realizadas com o monoclonal BrBm5 (anti-BYC). Estes resultados mostraram que a inoculação com o plasmídeo BYCr-PC induz a produção de anticorpos específicos e possibilita testar o uso de uma vacina de DNA como um método alternativo para o controle de carrapatos. / The Rhipicephalus (Boophilus) microplus tick is the major bovine ectoparasite and causes important economical losses on cattle breeding. The immunologic control has been studied as an alternative method for the tick control. However, an effective vaccine remains to be developed. BYC (Boophilus Yolk Pro-Cathepsin) is an aspartic proteinase found in eggs that is involved in the embryogenesis of Rhipicephalus (Boophilus) microplus, and it has been proposed as a probable antigen in vaccine development. The purpose of this study was to evaluate whether the immunization containing rBYC (rBYC-PC and rBYC-PME) could elicit a specific anti-BYC immune response in vivo. The cDNA of BYC was amplified by PCR and it was cloned into two eukaryotic expression vectors (pcDNA3 and pME18Neo). The clones, rBYC-PC and rBYC-PME, were produced in large scale for immunoassays. To evaluate the immunogenicity of BYC, BALB/c mice were immunized with DNA vaccine by intramuscular injection. The mice received two intramuscular inoculations of 100μg plasmids DNA (rBYCPC or rBYC-PME) and the negative controls received only PBS, pcDNA3 or pME18Neo. The production of antibody after the immunizations was evaluated by Western Blotting and ELISA. Antibodies against BYC in mice inoculated with rBYC-PC were detected. Immunolocalization of the rBYC protein in muscle samples from the injection site with rBYCPC was detected with monoclonal BrBm5 anti-BYC. These results show that DNA immunization produced specific anti-BYC antibodies and suggest that a DNA vaccine could prove useful to develop an alternative method for tick control.