Este trabalho visa investigar a resposta sorológica para glicolipoproteína (GLP) de leptospiras com a finalidade de padronizar o uso deste antígeno em testes sorológicos para o diagnóstico da leptospirose humana. Dentre as proteínas envolvidas na patogenicidade das leptospiras, a GLP ainda não foi estudada quanto a imunogenicidade e quanto ao seu emprego como antígeno na detecção de anticorpos específicos. Assim, dot-ELISA para detecção de anticorpos IgG e IgM, com o emprego de GLP de leptospiras patogênica e não patogênica, foi padronizado. Foram testadas amostras pareadas de soros de 90 pacientes com leptospirose confirmada sorologicamente por MAT, sendo as primeiras amostras colhidas na fase aguda da doença e as segundas amostras após 10 a 15 dias. Foram testadas também amostras únicas de 30 pacientes de diferentes patologias, que apresentaram resultados negativos no MAT, pertencentes ao grupo controle. A detecção de anticorpos IgG não mostrou resultados satisfatórios, tendo sido, o seu estudo, descontinuado. Os resultados do dot-ELISA IgM mostraram sensibilidade de 100% nas amostras colhidas após soroconversão no MAT e a precocidade de detecção foi demonstrada pela alta positividade nas amostras colhidas na fase aguda da doença (76,6% para dot-ELISA com antígeno de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni e 90% com antígeno de Leptospira biflexa sorovar Patoc). A especificidade foi alta (96,6%), porém o dot-ELISA utilizando ambos os antígenos apresentou 3,3% de resultados falso-positivos. Este estudo demonstrou a importância da resposta imune humoral ao antígeno GLP de leptospiras. A utilização da GLP, no teste dot-ELISA para detecção de anticorpos IgM permitiu realizar o diagnóstico sorológico de forma simples, rápida e com alta eficiência diagnóstica. / The aim of this work was the study of serologic response against leptospira glycolipoprotein (GLP) for the purpose of standardizing its use as an antigen on serological tests to diagnose human leptospirosis. Among the proteins involved in the pathogenicity, GLP is yet to be studied regarding its immunogenicity and its use as an antigen in the detection of specific antibodies. That led to our standardization of dot-ELISA for detecting IgG and IgM antibodies, using GLP extracted from either pathogenic Leptospira interrogans serovar Copenhageni or nonpathogenic Leptospira biflexa serovar Patoc. Paired serum samples were taken from 90 patients with serologically confirmed leptospirosis, by MAT, with the first samples collected on the disease\'s acute phase and the second samples after a period of 10 to 15 days. We also tested single samples taken from 30 patients with other diseases, MAT negative, belonging to the control group. Detection rates for IgG antibodies were unsatisfactory, so the study for that use was discontinued. The dot-ELISA IgM results yielded 100% sensitivity on the samples taken after MAT seroconversion. The early detection pattern was evidenced by the high positivity rate on the samples taken during the disease\'s acute phase (76,6% dot-ELISA using Leptospira interrogans serovar Copenhageni antigen and 90% using Leptospira biflexa sorovar Patoc antigen). Specificity rates were high (96.6%), although a 3.3% rate of false-positive results was observed for dot-ELISA using both antigens. The present study revealed the importance of the humoral immune response against the GLP antigen. The use of GLP, on the dot-ELISA test for IgM antibodies afforded a simple, quick and effective diagnosis.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:46:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 729175 bytes, checksum: d8be6fdfabfabf889bd81cc7f09142f9 (MD5) Previous issue date: 2008-05-16 / The Rhipicephalus (Boophilus) microplus is one of the most important arthropods in veterinary medicine due economic losses and health problems caused in cattle production, mainly in Central and South America, as well as in Australia. As an alternative to chemical control, immunization of bovines with Bm86 antigen to induce a protective immune response. A synthetic peptide, SBm 7462, derived from Bm86, has been shown great results in control of ticks. The construction and synthesis of one nucleotide sequence based on this peptide might be useful for design a DNA vaccine that has many advances than peptide vaccine. A gene, called seq1, was constructed with a three repetition of nucleotide sequence of SBm 7462. It was cloned into a pCIneo vector expression in mammals, transfected in VERO cells and injected in BALB/c mouse. Two methods were used to analysis of peptide expression in vitro: DOT ELISA and PAP. In both, the results showed that the nucleotide sequence (seq1) had not been express in VERO cells. In vivo, when mice were inoculated with the expression cassette they did not response in ELISA. They elevated antibody titles only when vaccinated with the syntetic peptide SBm 7462. And, the best titles of immunoglobulins were seen when the SBm 7462 was administered subcutaneously. After that, we insert a mutation at the begging of seq1, but, the sequenciament demonstrated that any initiation codon (ATG) had been inserted. / O Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um dos mais importantes artrópodes em medicina veterinária devido perdas econômicas e problemas de saúde causados na produção de gado na América Central e do Sul, bem como na Austrália. Como alternativa ao controle químico, a imunização de bovinos com antígeno proteíco Bm86 induz uma resposta imune protetora. Um peptídeo sintético, SBm 7462, derivado da Bm86, tem obtido excelentes resultados no controle de carrapatos. A construção e síntese de uma sequência nucleotidíca baseada neste peptídeo podem ser útil para o desenho de uma vacina de DNA que tem muitas vantagens sob uma vacina sintética. Um gene, denominado seq1, foi construído repetindo três vezes a sequência nucleotidídica do SBm 7462. Ele foi clonado no vetor de expressão em mamíferos, pCIneo, transfectado em células VERO e injetado em camundongos BALB/c. Dois métodos foram usados para análise da expressão do peptídeo in vitro: DOT ELISA e PAP. Em ambos, os resultados demonstraram que a seqüência nucleotídica (seq1) não havia sido expressa em células VERO. In vivo, quando camundongos foram inoculados com o cassete de expressão eles não responderam ao ELISA. Eles elevaram os títulos de anticorpos, apenas, quando inoculados com o peptídeo sintético SBm 7462. Os melhores títulos de imunoglobulinas foram vistos quando o SBm 7462 foi administrado subcutâneamente. Após isso, inserimos uma mutação no início do seq 1, porém, o sequenciamento demonstrou que nenhum códon de iniciação (ATG) tinha sido inserido.

Este trabalho visa investigar a resposta sorológica para glicolipoproteína (GLP) de leptospiras com a finalidade de padronizar o uso deste antígeno em testes sorológicos para o diagnóstico da leptospirose humana. Dentre as proteínas envolvidas na patogenicidade das leptospiras, a GLP ainda não foi estudada quanto a imunogenicidade e quanto ao seu emprego como antígeno na detecção de anticorpos específicos. Assim, dot-ELISA para detecção de anticorpos IgG e IgM, com o emprego de GLP de leptospiras patogênica e não patogênica, foi padronizado. Foram testadas amostras pareadas de soros de 90 pacientes com leptospirose confirmada sorologicamente por MAT, sendo as primeiras amostras colhidas na fase aguda da doença e as segundas amostras após 10 a 15 dias. Foram testadas também amostras únicas de 30 pacientes de diferentes patologias, que apresentaram resultados negativos no MAT, pertencentes ao grupo controle. A detecção de anticorpos IgG não mostrou resultados satisfatórios, tendo sido, o seu estudo, descontinuado. Os resultados do dot-ELISA IgM mostraram sensibilidade de 100% nas amostras colhidas após soroconversão no MAT e a precocidade de detecção foi demonstrada pela alta positividade nas amostras colhidas na fase aguda da doença (76,6% para dot-ELISA com antígeno de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni e 90% com antígeno de Leptospira biflexa sorovar Patoc). A especificidade foi alta (96,6%), porém o dot-ELISA utilizando ambos os antígenos apresentou 3,3% de resultados falso-positivos. Este estudo demonstrou a importância da resposta imune humoral ao antígeno GLP de leptospiras. A utilização da GLP, no teste dot-ELISA para detecção de anticorpos IgM permitiu realizar o diagnóstico sorológico de forma simples, rápida e com alta eficiência diagnóstica. / The aim of this work was the study of serologic response against leptospira glycolipoprotein (GLP) for the purpose of standardizing its use as an antigen on serological tests to diagnose human leptospirosis. Among the proteins involved in the pathogenicity, GLP is yet to be studied regarding its immunogenicity and its use as an antigen in the detection of specific antibodies. That led to our standardization of dot-ELISA for detecting IgG and IgM antibodies, using GLP extracted from either pathogenic Leptospira interrogans serovar Copenhageni or nonpathogenic Leptospira biflexa serovar Patoc. Paired serum samples were taken from 90 patients with serologically confirmed leptospirosis, by MAT, with the first samples collected on the disease\'s acute phase and the second samples after a period of 10 to 15 days. We also tested single samples taken from 30 patients with other diseases, MAT negative, belonging to the control group. Detection rates for IgG antibodies were unsatisfactory, so the study for that use was discontinued. The dot-ELISA IgM results yielded 100% sensitivity on the samples taken after MAT seroconversion. The early detection pattern was evidenced by the high positivity rate on the samples taken during the disease\'s acute phase (76,6% dot-ELISA using Leptospira interrogans serovar Copenhageni antigen and 90% using Leptospira biflexa sorovar Patoc antigen). Specificity rates were high (96.6%), although a 3.3% rate of false-positive results was observed for dot-ELISA using both antigens. The present study revealed the importance of the humoral immune response against the GLP antigen. The use of GLP, on the dot-ELISA test for IgM antibodies afforded a simple, quick and effective diagnosis.

A toxoplasmose afeta cerca de um bilhão de pessoa em todo mundo, é geralmente assintomática, apesar de doença ocular ou doenças grave e letal em fetos, pacientes com HIV e transplantados. A sorologia é a principal ferramenta para o diagnóstico e determinação de incidência, que é uma tarefa difícil, devido à alta prevalência na maioria dos países. Estudos de incidência são ideais em crianças, mas este grupo é protegido pela sociedade e de difícil abordagem por métodos invasivos como a punção venosa. A saliva pode ser uma ótima alternativa por sua coleta não ser invasiva, aceitável para crianças, e conter pequenas quantidades de IgG, eliminada através da mucosa gengival e fluido crevicular. Métodos de detcção de anticorpos disponíveis no mercado estão focados em amostras de soro, com baixa sensibilidade e são raros os relatos de pesquisas com material biológico alternativo, como a saliva. Sendo assim, padronizamos imunoensaios com alta sensibilidade para detecção de anticorpos anti- T. gondii na saliva frente a amostras de soro de 20 voluntários adultos. A sensibilidade e especificidade dos nossos dot-ELISA e ELISA de captura com proteína A foram semelhantes entre soro e saliva. Também testamos 100 amostras de saliva de universitários em nossos ensaios, onde mostramos uma frequência da toxoplasmose de 19% (IC 95% 12-28%). Imunoensaios para detecção de IgG anti-T. gondii em saliva são uma ferramenta muito promissora para estudos epidemiológicos da toxoplasmose em crianças ou outros grupos protegidos. / Toxoplasmosis that affects about one billion people worldwide is usually asymptomatic, despite ocular disease and severe and lethal disease in fetuses, AIDS patients and transplant recipients. Serology is the main approach for diagnosis and incidence determination is a difficult task due to high prevalence in most countries. Incidence studies are feasible in children but this age group is protected and difficult to approach by invasive methods as venipuncture. Saliva could be obtained by non-invasive procedure, acceptable for children, and it contains small amounts of IgG from mucosal and gingival crevicular fluid. Available antibody detection methods are focused in serum samples, with low sensitivity and few reports of alternative biological material, like saliva. Here, we standardized immunoassays with high sensitivity for detection of anti-T. gondii IgG in paired saliva and serum sample from 20 adult volunteers, which allows DOT-ELISA and a Protein A IgG capture assay. The sensitivity and specificity of the saliva DOT-ELISA were similar to sera ELISA. We also tested 100 saliva samples from university graduates in all assays, showing 19% (95%CI 12-28%) frequency of toxoplasmosis in this group, lower than reported for our area. Protein A IgG capture saliva assay was also efficient with similar results. Immunoassay with saliva IgG for toxoplasmosis is a very promising tool for use for the epidemiology of toxoplasmosis in children or other protected groups.

Neste trabalho foi desenvolvido um Dot-ELISA capaz de detectar anticorpos anti-Plasmodium vivax, anti-Plasmodium falciparum, anti-Trypanosoma cruzi e anti-Treponema pallidum, simultaneamente. O teste foi padronizado e aplicado em amostras de pacientes com malária, doença de Chagas e sífilis e comparado com testes de referência. Foi utilizado no estudo 52 amostras de pacientes com doença de Chagas, 43 pacientes com sífilis, 103 indivíduos com infecção presente (primo-infectado e não primo-infectados) ou passada de malária, indivíduos com anticorpos heterólogos, 30 indivíduos com leishmaniose 100 indivíduos saudáveis. O Dot-ELISA-Multi apresentou 100% de especificidade para todos os antígenos nas amostras de indivíduos saudáveis e com anticorpos heterólogos, com exceção do antígeno TESA que obteve 99%. A sensibilidade obtida foi de 100% em indivíduos chagásicos e 88% em pacientes com sífilis. Em indivíduos com malária a sensibilidade obtida foi de 90% para PvMSP119 (antígeno de P. vivax) e 47% para Pf-Zw (antígeno de P. falciparum). A positividade do teste em indivíduos não parasitados com histórico de malária foi de 92%. Nas amostras de malária observou-se que em indivíduos que tinham tido ultimo episódio de P. vivax, associação negativa foi observada entre o tempo passado desde o último episódio e reatividade de Dot-ELISAMulti PvMSP119, e associação positiva entre o número de episódios de malária e reatividade de Dot-ELISA-Multi Pf-Zw. Indivíduos cujo o último episódio foi por P. falciparum, o Dot-ELISA-Multi Pf-Zw apresentou associação positiva com o número de episódios ocorridos. O comparado com os testes de referência utilizados apresentou um nível muito bom de concordância para TESA, EAE, PvMSP119 e um nível bom de concordância para Pf-Zw / In the present study, a Dot-ELISA was assembled to test antibodies against Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Trypanosoma cruzi and Treponema pallidum and was standardized and evaluated in serum samples from patients with malaria, Chagas disease and syphilis, in comparison with reference tests. The study was carried out on serum samples from 52 patients with chronic Chagas disease, 103 individuals with current (parasitemic) or past malaria (aparasitemic), 43 patients with syphilis, 30 with leishmaniosis, 21 individuals with heterologous antibodies and 100 blood donors. The diagnostic performance of Dot-ELISA-Multi for serum samples from patients with heterologous antibodies and from healthy blood donors, an overall 100% specificity was obtained for all antigens but TESA. A 100% sensitivity was observed in serum specimens from chronic-chagasic patients and 88% in serum specimens from syphilis patients. For malaria samples, the positivity was 90% for PvMSP119 and 47% for Pf-Zw antigen. In past malaria individuals, positivity was 92%. Sera from subjects who had had a P. vivax-malaria last episode presented negative association between time elapsed since their last malaria episode and results from Dot-ELISA-Multi PvMSP119; while positive association was observed between number of malaria episodes and results from Dot-ELISA-Multi Pf-Zw. For individuals who had had a P. falciparum-malaria last episode, Dot-ELISAMulti Pf-Zw results showed positive association with number of malaria episodes only. Altogether, concerning the reactivity of the five antigens of the Dot-ELISAMulti, as compared with their respective reference tests, we have observed a very good level of concordance for TESA, EAE, PvMSP119 and for Tp-Zw and a good level for Pf-Zw

Neste trabalho foi desenvolvido um Dot-ELISA capaz de detectar anticorpos anti-Plasmodium vivax, anti-Plasmodium falciparum, anti-Trypanosoma cruzi e anti-Treponema pallidum, simultaneamente. O teste foi padronizado e aplicado em amostras de pacientes com malária, doença de Chagas e sífilis e comparado com testes de referência. Foi utilizado no estudo 52 amostras de pacientes com doença de Chagas, 43 pacientes com sífilis, 103 indivíduos com infecção presente (primo-infectado e não primo-infectados) ou passada de malária, indivíduos com anticorpos heterólogos, 30 indivíduos com leishmaniose 100 indivíduos saudáveis. O Dot-ELISA-Multi apresentou 100% de especificidade para todos os antígenos nas amostras de indivíduos saudáveis e com anticorpos heterólogos, com exceção do antígeno TESA que obteve 99%. A sensibilidade obtida foi de 100% em indivíduos chagásicos e 88% em pacientes com sífilis. Em indivíduos com malária a sensibilidade obtida foi de 90% para PvMSP119 (antígeno de P. vivax) e 47% para Pf-Zw (antígeno de P. falciparum). A positividade do teste em indivíduos não parasitados com histórico de malária foi de 92%. Nas amostras de malária observou-se que em indivíduos que tinham tido ultimo episódio de P. vivax, associação negativa foi observada entre o tempo passado desde o último episódio e reatividade de Dot-ELISAMulti PvMSP119, e associação positiva entre o número de episódios de malária e reatividade de Dot-ELISA-Multi Pf-Zw. Indivíduos cujo o último episódio foi por P. falciparum, o Dot-ELISA-Multi Pf-Zw apresentou associação positiva com o número de episódios ocorridos. O comparado com os testes de referência utilizados apresentou um nível muito bom de concordância para TESA, EAE, PvMSP119 e um nível bom de concordância para Pf-Zw / In the present study, a Dot-ELISA was assembled to test antibodies against Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Trypanosoma cruzi and Treponema pallidum and was standardized and evaluated in serum samples from patients with malaria, Chagas disease and syphilis, in comparison with reference tests. The study was carried out on serum samples from 52 patients with chronic Chagas disease, 103 individuals with current (parasitemic) or past malaria (aparasitemic), 43 patients with syphilis, 30 with leishmaniosis, 21 individuals with heterologous antibodies and 100 blood donors. The diagnostic performance of Dot-ELISA-Multi for serum samples from patients with heterologous antibodies and from healthy blood donors, an overall 100% specificity was obtained for all antigens but TESA. A 100% sensitivity was observed in serum specimens from chronic-chagasic patients and 88% in serum specimens from syphilis patients. For malaria samples, the positivity was 90% for PvMSP119 and 47% for Pf-Zw antigen. In past malaria individuals, positivity was 92%. Sera from subjects who had had a P. vivax-malaria last episode presented negative association between time elapsed since their last malaria episode and results from Dot-ELISA-Multi PvMSP119; while positive association was observed between number of malaria episodes and results from Dot-ELISA-Multi Pf-Zw. For individuals who had had a P. falciparum-malaria last episode, Dot-ELISAMulti Pf-Zw results showed positive association with number of malaria episodes only. Altogether, concerning the reactivity of the five antigens of the Dot-ELISAMulti, as compared with their respective reference tests, we have observed a very good level of concordance for TESA, EAE, PvMSP119 and for Tp-Zw and a good level for Pf-Zw

A toxoplasmose afeta cerca de um bilhão de pessoa em todo mundo, é geralmente assintomática, apesar de doença ocular ou doenças grave e letal em fetos, pacientes com HIV e transplantados. A sorologia é a principal ferramenta para o diagnóstico e determinação de incidência, que é uma tarefa difícil, devido à alta prevalência na maioria dos países. Estudos de incidência são ideais em crianças, mas este grupo é protegido pela sociedade e de difícil abordagem por métodos invasivos como a punção venosa. A saliva pode ser uma ótima alternativa por sua coleta não ser invasiva, aceitável para crianças, e conter pequenas quantidades de IgG, eliminada através da mucosa gengival e fluido crevicular. Métodos de detcção de anticorpos disponíveis no mercado estão focados em amostras de soro, com baixa sensibilidade e são raros os relatos de pesquisas com material biológico alternativo, como a saliva. Sendo assim, padronizamos imunoensaios com alta sensibilidade para detecção de anticorpos anti- T. gondii na saliva frente a amostras de soro de 20 voluntários adultos. A sensibilidade e especificidade dos nossos dot-ELISA e ELISA de captura com proteína A foram semelhantes entre soro e saliva. Também testamos 100 amostras de saliva de universitários em nossos ensaios, onde mostramos uma frequência da toxoplasmose de 19% (IC 95% 12-28%). Imunoensaios para detecção de IgG anti-T. gondii em saliva são uma ferramenta muito promissora para estudos epidemiológicos da toxoplasmose em crianças ou outros grupos protegidos. / Toxoplasmosis that affects about one billion people worldwide is usually asymptomatic, despite ocular disease and severe and lethal disease in fetuses, AIDS patients and transplant recipients. Serology is the main approach for diagnosis and incidence determination is a difficult task due to high prevalence in most countries. Incidence studies are feasible in children but this age group is protected and difficult to approach by invasive methods as venipuncture. Saliva could be obtained by non-invasive procedure, acceptable for children, and it contains small amounts of IgG from mucosal and gingival crevicular fluid. Available antibody detection methods are focused in serum samples, with low sensitivity and few reports of alternative biological material, like saliva. Here, we standardized immunoassays with high sensitivity for detection of anti-T. gondii IgG in paired saliva and serum sample from 20 adult volunteers, which allows DOT-ELISA and a Protein A IgG capture assay. The sensitivity and specificity of the saliva DOT-ELISA were similar to sera ELISA. We also tested 100 saliva samples from university graduates in all assays, showing 19% (95%CI 12-28%) frequency of toxoplasmosis in this group, lower than reported for our area. Protein A IgG capture saliva assay was also efficient with similar results. Immunoassay with saliva IgG for toxoplasmosis is a very promising tool for use for the epidemiology of toxoplasmosis in children or other protected groups.

Submitted by Chaylane Marques (chaylane.marques@ufpe.br) on 2015-03-13T18:21:58Z No. of bitstreams: 2 Dissertação_AnaKatarina.pdf: 740763 bytes, checksum: a6ee01d8d797eb74e4589e4cde8d19ed (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T18:21:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação_AnaKatarina.pdf: 740763 bytes, checksum: a6ee01d8d797eb74e4589e4cde8d19ed (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-08 / CNPQ; CAPES / O aumento na concentração de IgA Secretora em secreções externas é uma importante ferramenta de diagnóstico para infecções que acometem as mucosas. O uso de metodologia de imunoquimiluminescência para realizar tal diagnóstico permite uma maior sensibilidade que os métodos espectrofotométricos tradicionalmente utilizados. Neste trabalho, um ensaio Dotimunoquimiluminescente (Dot-CLIA) foi proposto para a determinação de IgA Secretora. Os anticorpos anti-IgAS e anti-IgG-peroxidase foram previamente conjugados com éster de acridina (AE). Dot-ELISA e Dot-CLIA foram então realizadas aplicando amostras de IgAS em discos de membranas de nitrocelulose (0,45 μm de diâmetro de poro) e foi medida a atividade da peroxidase e a quimiluminescência (expressa em unidade relativa de luz; URL), respectivamente. O complexo ternário formado por IgAS/anti- IgAS-AE/anti-IgG-peroxidase- AE e o controle (PBS em substituição a IgAS) forneceram valores de 302.255 ± 28.736 RLU e 8.247 ± 3.479 RLU, respectivamente. Dot-ELISA simultaneamente realizada forneceu cor marrom pelo complexo ternário e ausência de cor foi observada para o controle. A relação entre RLU versus quantidade de IgAS utilizando o método proposto mostrou uma curva hiperbólica. O leite materno sem lipídios e caseína purificado por HPLC apresentou três picos de proteína e os que correspondiam a IgAS e ao componente secretor livre apresentaram valores de cerca de 50.000 RLU e 30.000 RLU, respectivamente. Portanto, pode-se concluir que o ensaio Dot-CLIA é capaz de avaliar quantitativamente e especificamente IgAS em fluidos biológicos.