Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-05-20T21:12:50Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_EstudoEfeitosExpressão.pdf: 2296221 bytes, checksum: 490a666744d910e3f861fdde0f815d5d (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-05-22T14:40:12Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_EstudoEfeitosExpressão.pdf: 2296221 bytes, checksum: 490a666744d910e3f861fdde0f815d5d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-22T14:40:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_EstudoEfeitosExpressão.pdf: 2296221 bytes, checksum: 490a666744d910e3f861fdde0f815d5d (MD5) Previous issue date: 2015 / Os Dengue virus (DENV) possuem um genoma constituído de RNA senso positivo que expressa proteínas estruturais e não estruturais dentre as quais destaca-se a NS1. Esta desempenha uma atividade na replicação do genoma viral e pode exercer um papel na modulação de vias sinalizadoras celulares. Esta função foi demonstrada por nosso grupo através de em um modelo de células HepG2 expressando NS1 de forma constitutiva em que NS1 altera o perfil de ativação de proteínas da via NF-kB. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo avaliar através de ensaios de atividade de luciferase, a atividade transcricional no promotor de IL-6 em células transfectadas de forma estável para a expressão de NS1. Uma vez que altos níveis de IL-6 são detectados no soro de pacientes infectados e que esta citocina pode ser modulada pela via de NF-kB. Os resultados mostraram que a expressão da NS1 aumenta a atividade transcricional no promotor de IL-6 nas células HepG2. Além disso, uma mutação pontual no sítio de ligação de um fator transcricional denominado AP-1 (heterodimero de cFOS e cJUN) no promotor de IL-6, resultou na diminuição desta atividade. Adicionalmente, foi verificado que células expressando NS1 tanto de forma transiente como constitutiva apresentam também uma maior atividade transcricional de AP-1 ativado pela via JNK das MAP cinases. Tais dados sugerem que esta via pode também ser regulada em função da presença de NS1. Outros ensaios de luciferases foram conduzidos para avaliar possíveis alterações nas vias de STAT3 e das MAP cinases MEK/ERK, quando as células foram estimuladas com soro fetal bovino, e avaliar o papel de NS1 na manipulação destas vias. Os resultados obtidos por este trabalho poderão ajudar na compreensão dos mecanismos utilizados pelos DENV na modulação da expressão de genes celulares e auxiliar a condução de pesquisas com foco no desenvolvimento de estratégias terapêuticas para combate ao vírus. _______________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The Dengue virus (DENV) have a genome of RNA positive sense expressing structural and non-structural proteins among which stands out the NS1 which exerts an activity in the viral genome replication and may play a role in the modulation of cell signaling pathways. This function has been demonstrated by our group using HepG2 cells in a model constitutively expressing NS1 in which NS1 alters the protein activation profile of the NF-kB pathway. However, the aim of this work was to evaluate through luciferase activity assays, the expression of pro-inflammatory proteins in HepG2 cells expressing the NS1 protein and also the transcriptional activity in the IL-6 promoter in cells stably transfected for the expression of NS1, since high levels of IL-6 are found in serum of infected patients and that this cytokine may be modulated by the NF-kB pathway. The results showed that the expression of NS1 increases the transcriptional activity of the IL-6 promoter in HepG2 cells. Furthermore, a punctual mutation at the binding site of a transcriptional factor called AP-1 (heterodimer cFos and cJun) in the IL-6 promoter, resulted in decrease of this activity. Additionally, it was verified that cells expressing NS1 both transient and constitutive also exhibit greater transcriptional activity of AP-1 of the JNK pathway activated by MAP kinases. These data suggest that this pathway may also be regulated as a function of the presence of NS1. Further tests were conducted to evaluate possible changes in the STAT3 and MEK/ERK MAP kinase pathway, when the cells were stimulated with fetal bovine serum and also to avaluate the role of NS1 in handling these routes. The results of this study will help to understand the mechanisms used by DENV in modulating the expression of cellular genes and support carrying out researches focused on the development of therapeutic strategies to combat the virus.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:55:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marielle de Oliveira Castro.pdf: 948812 bytes, checksum: 71c8c7096fa4cd9fbc718b2983fb0b7d (MD5) Previous issue date: 2007-03-23 / Hepatitis C is considered one of the largest problems of public health in the world, inclusively in Brazil, whereas a preventive vaccine none is available; the number of asymptomatic infections is elevated and for control of the disease, there exist only imported kits. Considering, principally, the increase of preoccupation with the detection of precocious hepatitis C and that the diagnostic methods of this infection are of the highest clinical importance, the presence study proposes the expression and the purification of one codified protein through a synthetic gene (MEHCV Multiepitope HCV). To achieve this objective, the new recombinant protein multiepitope was designed on the basis of epitopes linear, immunodominant and phylogenetically conserved from the virus of hepatitis C (HCV), including the immune dominating sequences of the genotypes that are more prevalent in Brazil (1a e 3a) and a His-tag in C-terminal to facilitate the purification of the recombinant protein express in bacteria. These epitopes (core, NS3, NS4A, NS4B e NS5) are considered among the most important for the diagnosis of the illness utilized for many HCV detection tests. The MEHCV gene (~720pb) possesses restrictive of sites (NdeI e XhoI) in yours extremities that permits the clonage in phase in the expression of vector bacterial pET-21a. To the synthesize of this gene was made the optimization to the codon usage of E. coli. The protein of interest (~29kDa) was detected by SDS-PAGE and Western blot. The purification of the protein express was realized by centrifugal in resin Ni-NTA by affinitive chromatography. Inasmuch as the purification was not total, a new purification was made of this protein by means of chromatography of affinity in column with resin Ni-NTA. However, did not having this purification owe a presence of cellular proteins. In such case, in the trial of obtain a total purification of this protein multiepitope, would be interesting the utilization of the one new protocol, with the extraction of the inclusion body, wherein all the dissolvable proteins cellular would be remove of the solution. / A hepatite C é considerada um dos maiores problemas de saúde pública no mundo inteiro, inclusive no Brasil, pois uma vacina preventiva não está disponível, o número de infectados com a forma assintomática é elevado e para o controle da doença, há somente kits importados. Considerando, principalmente, o aumento da preocupação com a detecção precoce da hepatite C e que os métodos de diagnóstico desta infecção são de grande relevância clínica, o presente trabalho propõe a expressão e purificação de uma proteína codificada por um gene sintético (MEHCV Multiepítopo HCV). Para atingir este objetivo, uma proteína multiepítopo recombinante foi desenhada a partir de epítopos lineares, imunodominantes e filogeneticamente conservados do vírus da hepatite C (HCV), com a inclusão de seqüências imunodominantes dos genótipos mais prevalentes no Brasil (1a e 3a) e uma His-tag no C-terminal para facilitar a purificação da proteína recombinante expressa em bactéria. Estes epítopos (core, NS3, NS4A, NS4B e NS5) são considerados entre os mais importantes para o diagnóstico da doença e utilizados em muitos testes para detecção do HCV. O gene MEHCV (~720pb) possui sítios de restrição (NdeI e XhoI) nas suas extremidades que permitem a clonagem em fase no vetor de expressão bacteriano pET-21a. Para a síntese deste gene, foi feita a otimização para o códon usage de E. coli. A proteína de interesse (~29kDa) foi detectada por SDS-PAGE e Western blot. A purificação da proteína expressa foi realizada por cromatografia de afinidade em resina Ni-NTA. Como a purificação não foi total, foi feita uma nova purificação desta proteína por cromatografia de afinidade em coluna com resina Ni-NTA. No entanto, não houve esta purificação devido à presença de proteínas celulares. Sendo assim, na tentativa de alcançar a purificação total desta proteína multiepítopo, seria interessante a utilização de um novo protocolo, com a extração dos corpos de inclusão, onde todas as proteínas celulares solúveis seriam retiradas da solução.

Orientador: Erick José Ramo Silva / Resumo: A EPPIN (do inglês, Epididymal peptidase inhibitor), proteína antimicrobiana rica em resíduos de cisteína contendo duas sequências consenso de domínios de inibidores de protease do tipo WFDC e Kunitz, é um alvo farmacológico para o desenvolvimento de novos contraceptivos masculinos devido ao seu papel crítico na motilidade do espermatozoide. O desenvolvimento de fármacos contraceptivos baseados nas funções da EPPIN requer um entendimento mais profundo a respeito dos seus mecanismos fisiológicos e posterior avaliação da eficácia e segurança da potencial droga em modelos pré-clínicos. No presente estudo, investigamos o perfil de expressão da EPPIN em tecidos e em espermatozoides testiculares e epididimários de camundongos e identificamos potenciais proteínas que interagem com a EPPIN no espermatozoide maduro. Para caracterizar o perfil de expressão da EPPIN, processamos órgãos reprodutivos e não-reprodutivos, além de espermatozoides para ensaios de RT-PCR, qPCR, Western blot e imuno-histoquímica/imunofluorescência. Para a identificação dos parceiros de ligação da EPPIN, coletamos espermatozoides do corpo/cauda do epidídimo e incubamos as células com a fração solúvel em tampão fosfato do fluído da glândula seminal dos mesmos animais. Realizamos ensaios de co-imunoprecipitação utilizando anticorpo anti-EPPIN Q20E ou IgG de coelho (controle negativo) para imunoprecipitar a EPPIN e co-imunoprecipitar suas proteínas parceiras, processamos as amostras para digestão de proteínas com t... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: EPPIN (Epididymal peptidase inhibitor), a cysteine-rich antimicrobial protein containing both Kunitz and whey acidic protein (WAP)-type four disulfide core protease inhibitor consensus sequences, is a target for the development of new male contraceptive drugs due to its critical role in sperm motility. The development of contraceptive drugs based on EPPIN functions requires a deeper understanding on its physiological roles and further evaluation of efficacy and safety of the potential drug with preclinical models. Herein, we investigated the expression profile of EPPIN in tissues and in spermatozoa from testis and epididymis and identified potential proteins that interact with EPPIN in mature sperm. To characterize the expression profile of EPPIN, we processed reproductive and non-reproductive organs, as well as spermatozoa for RT-PCR, qPCR, Western blot and immunohistochemistry/immunofluorescence assays. For the identification of potential EPPIN’s partners, we collected spermatozoa from the corpus/cauda epididymis and incubated them with the phosphate-soluble fraction of seminal vesicle fluid from the same animals. Then, we performed co-immunoprecipitation assays using anti-EPPIN Q20E antibody or rabbit IgG (negative control) to immunoprecipitate EPPIN and co-immunoprecipitate its partner proteins, processed samples for trypsin protein digestion and identified tryptic peptides by mass spectrometry (LC-MS/MS). Our results showed that the Eppin is an androgendependent gene, ab... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-01-19T17:40:54Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 954292 bytes, checksum: 4c469f118ecec64e0bf397931c09c1cc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-19T17:40:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 954292 bytes, checksum: 4c469f118ecec64e0bf397931c09c1cc (MD5) Previous issue date: 2016-07-22 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Em vias de defesa envolvidas na interação planta/patógeno e planta/ambiente, a modulação da transcrição é etapa fundamental na ativação de respostas intracelulares. Esses mecanismos são regulados principalmente pelos fatores de transcrição (FT), que entre os mais estudados em plantas estão a família basic leucine zipper motif (bZIP). Interações dos bZIP com outras proteínas modulam a atividade destes transfatores por diversos mecanismos, e essa modulação afeta vias de transdução de sinais nas plantas. O GmbZIPE2 (Glyma05g168100.1) de soja tem sua expressão alterada em resposta à infecção por patógenos e ao tratamento com fitormônios de defesa, sugerindo que esse transfator possa estar envolvido em vias de sinalização de interação planta-patógeno. O objetivo deste trabalho foi identificar interações proteicas do GmbZIPE2 utilizando o ensaio de duplo-híbrido de leveduras. Identificamos que a proteína GmbZIPE2 foi capaz de interagir com G. max uncharacterized LOC100786585 (RbcX), identificada no Phytozome como Chaperonin-like Rbcx Protein, que atua como chaperona no dobramento da Rubisco, e a proteína G. max uncharacterized LOC100777895, cuja função biológica descrita no Uniprot é relacionada à montagem do fotossistema II (PSII). Uma vez que interage com proteínas envolvidas com a fotossíntese e que podem atuar como moléculas sinalizadoras do estado fotossintético da célula, o GmbZIPE2 pode estar relacionado à transmissão de sinais do cloroplasto para o núcleo, atuando na via de sinalização retrógada. / In defence pathways triggered after the plant /pathogen interaction and upon environment stress, the transcriptional modulation is a critical step for the activation of intracellular responses. This modulation is mainly regulated by transcriptional factors (TF). The basic leucine zipper family (bZIP) is the most studied TF in plants. The interaction between bZIP and other proteins modulates the activity of these transcriptional factors by several mechanisms, and that modulation affects the signal transduction pathways. The GmbZIPE2 (Glyma05g168100.1) is responsive to pathogen infection and treatment with phytohormones related to defense, suggesting that GmbZIPE2 is part of pathogen response signaling pathways in soybean. The aim of this study was to identify protein that can interact with GmbZIPE2 using yeast two-hybrid. We found that the GmbZIPE2 was able to interact with G. max uncharacterized LOC100786585 (RbcX), identified in Phytozome as Chaperonin-like Rbcx Protein, that acts as chaperone in folding of Rubisco, and the G. protein max uncharacterized LOC100777895, that was described to the assembly of photosystem II (PSII). These interactions suggest that GmbZIPE2 can be related to signal transmission from chloroplast to the nucleus.

La holoenzima proteína quinasa A (PKA) es un tetrámero que consiste en dos subunidades catalíticas y dos subunidades reguladoras, se encuentra en forma ubicua fosforilando un gran número de proteínas celulares y participa en la regulación de vías metabólicas y otros procesos (transporte de membrana, motilidad celular, expresión génica, apoptosis, aprendizaje y memoria). Las proteínas quinasas no solamente se encuentran en el interior de las células, sino además se observa la "exportación" hacia la superficie de la cara externa de la membrana plasmática de las células (Redegeld, F.A et al., 1999). Este fenómeno de exportación de las proteína quinasas hacia la superficie de la cara externa de las células en cultivo se denomina "ectoquinasas." El objetivo del presente trabajo es estudiar la exportación de la proteína quinasa dependiente del AMPc sobrexpresada en células humanas en cultivo a nivel intracelular o endógeno, a nivel ectópico o en la membrana plasmática, y libre en el líquido extracelular o proteína exógeno. En la presente Tesis se utilizó dos líneas celulares llamadas HEK293T y HELA, realizándose la técnica de transfección por lipofectamina para introducir en estas células la proteína PKA, específicamente el vector (pcDNA3-HA) con el inserto que contiene el gen de la subunidad catalítica con el epítope anti-HA.

La holoenzima proteína quinasa A (PKA) es un tetrámero que consiste en dos subunidades catalíticas y dos subunidades reguladoras, se encuentra en forma ubicua fosforilando un gran número de proteínas celulares y participa en la regulación de vías metabólicas y otros procesos (transporte de membrana, motilidad celular, expresión génica, apoptosis, aprendizaje y memoria). Las proteínas quinasas no solamente se encuentran en el interior de las células, sino además se observa la "exportación" hacia la superficie de la cara externa de la membrana plasmática de las células (Redegeld, F.A et al., 1999). Este fenómeno de exportación de las proteína quinasas hacia la superficie de la cara externa de las células en cultivo se denomina "ectoquinasas." El objetivo del presente trabajo es estudiar la exportación de la proteína quinasa dependiente del AMPc sobrexpresada en células humanas en cultivo a nivel intracelular o endógeno, a nivel ectópico o en la membrana plasmática, y libre en el líquido extracelular o proteína exógeno. En la presente Tesis se utilizó dos líneas celulares llamadas HEK293T y HELA, realizándose la técnica de transfección por lipofectamina para introducir en estas células la proteína PKA, específicamente el vector (pcDNA3-HA) con el inserto que contiene el gen de la subunidad catalítica con el epítope anti-HA.

A tuberculose permanece sendo a principal causa de morte no mundo devido a um único agente infeccioso, Mycobacterium tuberculosis. O surgimento de cepas multi- e extensivamente-resistentes tem aumentado a perspectiva de uma futura epidemia de casos de tuberculose sem tratamento. Faz-se cada vez mais urgente a necessidade do desenvolvimento de novas drogas e vacinas, tanto para encurtar o prazo de tratamento, como para combater as cepas resistentes e o processo de latência que é estabelecido pelo bacilo. Os mecanismos moleculares pelos quais esta micobactéria estabelece infecção e latência ainda precisam ser esclarecidos. O estudo de proteínas associadas ao nucleóide tem sido um tema bastante promissor para o entendimento de mecanismos de invasão e persistência em vários microorganismos patogênicos, podendo auxiliar, também, no esclarecimento do metabolismo do bacilo para estas atividades. Neste estudo, descrevemos a caracterização inicial de uma fase de leitura identificada para uma proteína H-NS putativa de M. tuberculosis. A H-NS é uma das proteínas associadas ao nucleóide mais bem caracterizadas. O gene foi clonado, expresso, e seu produto foi, então, purificado até sua homogeneidade. Ensaios de ligação a DNA qualitativo, utilizando o EMSA, e quantitativo, por meio de ressonância plasmônica de superfície, foram realizados para a comprovação de sua atividade, tendo sido proposto um mecanismo de ligação ao DNA. Além disso, estudos de complementação realizados com a utilização de uma cepa de Escherichia coli mutante para hns sugerem que esta proteína pertence a uma nova classe de proteínas associadas ao nucleóide presentes em Mycobacterium. / Tuberculosis remains the major cause of mortality due to a bacterial pathogen, Mycobacterium tuberculosis. The emergence of multidrug- and extensively drug-resistant strains have raised the bleak prospect of a future epidemic of virtually untreatable TB. More effective antimycobacterial agents, besides new vaccines or vaccination strategies, are thus needed to improve the treatment of resistant strains, to shorten the treatment course, and to provide more effective treatment of latent infection. The molecular mechanisms by which the bacillus establishes infection and persistence have not been completely elucidated. Studies involving nucleoid-associated proteins, which have been related to the control and influence of virulence genes in pathogenic bacteria, can help unveil the virulence process of M. tuberculosis. In this study, we describe the initial characterization of an open reading frame for the M. tuberculosis putative H-NS. This protein is one of the most studied members of the nucleoid-associated proteins family. The gene was cloned, expressed and its product purified to homogeneity. A qualitative protein-DNA binding assay was carried out by gel-retardation and the protein affinity for specific DNA sequences was assessed quantitatively by surface plasmon resonance. A protein-DNA binding mechanism is proposed. In addition, functional complementation studies of an E. coli hns mutant reinforce the likelihood that Rv3852 protein represents a novel nucleoid-associated protein in M. tuberculosis.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-04T17:22:39Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 287490 bytes, checksum: 6275dbc10b29b964ca88a6fa7d78b9a9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-04T17:22:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 287490 bytes, checksum: 6275dbc10b29b964ca88a6fa7d78b9a9 (MD5) Previous issue date: 1999-03-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O cDNA da proteína S-64, homóloga à proteína de ligação à sacarose (SBP), foi previamente isolado de uma biblioteca de expressão de cotilédones de soja. A seqüência de aminoácidos deduzida da proteína S-64 apresenta 85% de identidade com a proteína de ligação à sacarose (SBP), um provável sinal, um sítio consenso de glicosilação e um sítio consenso de ligação à ATP/GTP. Nessa investigação, uma versão truncada da proteína S-64 foi expressa em E. coli e a proteína recombinante purificada, utilizada em ensaios de caracterização bioquímica. Além da alta conservação de seqüência com SBP, o fracionamento subcelular de cotilédones demonstrou que a proteína S-64 está associada a membranas. Consistente com sua localização subcelular, o terminal amino hidrofóbico da proteína parece ter função de Peptídeo sinal, uma vez que a proteína intacta não foi acumulada em E. coli, ao passo que a proteína S-64 isenta do Peptídeo sinal foi eficientemente sintetizada em bactéria. Provavelmente, o sistema de secreção da E. coli reconheceu o terminal hidrofóbico da proteína intacta, e a proteína recombinante foi secretada e degradada. No entanto, tradução in vitro do RNA sintético de S-64 usando reticulócitos de coelho, na presença de membranas microssomais pancreáticas caninas, demonstrou que o Peptídeo sinal de S-64 não é clivado. Tal resultado indicou que a proteína S-64 é uma proteína de membrana do tipo II, e o seu terminal amino apresenta as funções de Peptídeo sinal, endereçando a proteína para o retículo endoplasmático; e domínio transmembrana, fixando a proteína na membrana plasmática. A capacidade de S-64 oligomerizar foi avaliada em géis semidesnaturantes e o seu domínio de oligomerização mapeado, correspondente aos aminoácidos 36 a 343, usando-se versões truncadas da proteína. A possibilidade de a proteína ligar-se à GTP por meio do seu sítio consenso de ligação a nucleotídeos foi determinada por “GTP dot blot”. A proteína S-64 liga-se à GTP, preferencialmente à ATP, uma vez que uma versão de S-64 produzida em E. coli foi marcada radioativamente por [ 32 Pα]-GTP, na presença de ATP não marcado como competidor. O sítio de ligação à GTP foi delimitado pelo teste de perda de função a partir de mutação dirigida in situ. De fato, mutação no putativo sítio de ligação a ATP/GTP bloqueia a referida atividade da proteína. Tais resultados estabelecem que a proteína S-64 é, de fato, uma proteína de ligação à GTP associada à membrana. A atividade de ligação à GTP da proteína pode estar envolvida na regulação da função da proteína como transportadora de sacarose. / A sucrose binding protein (SBP) homologue, named S-64 protein, was previously identified by cloning its cDNA from a soybean cotyledon expression library. The deduced aminoacid sequence for S-64 shares 85% identity with the sucrose-binding protein (SBP), possesses a putative peptide signal, a potential site for N-linked glycosylation and a nucleotide (ATP/GTP)-binding consensus sequence. In this investigation, the S-64 gene and truncated versions of the cDNA were expressed in E. coli and the purified recombinant proteins were used in biochemical characterization assays. In addition to high sequence conservation with SBP, subcellular fractionation of cotyledon cells demonstrated that the S-64 protein is a membrane-associated protein. Consistent with its subcellular localization, the hydrophobic amino terminus of the protein seems to function as a signal peptide because an intact protein failed to accumulate in E. coli, whereas a peptide signal free-protein was efficiently produced in E. coli. Probably the secretion system of E. coli recognized the hydrophobic stretch of aminoacids and the heterologous protein was secreted and degraded. Nevertheless, in vitro translation of synthetic S-64 RNA using a cell-free system in the presence of microsomal membranes demonstrated that the S-64 signal peptide was not cleaved. These results suggest that the S-64 is a type II membrane protein and its peptide signal may serve as dual function. It may address the synthesis of the protein to the endoplasmic reticulum (ER) and may target the protein to membranes. The ability of the protein to undergo oligomerization was analyzed in native gels. The S-64 oligomerization domain was mapped to an internal region of the protein, aminoacids 36 a 343, by assaying the ability of truncated versions of the proteins to oligomerize in native gels. The ability of the protein to associate with nucleotides thought its conserved binding sequence was determined by a GTP-binding blot assay. The S-64 protein binds GTP, rather than ATP, because the E. coli produced S-64 was radiolabeled by [ 32 Pα]- GTP in the presence of large excess of unlabeled ATP competitor. The GTP binding site was delimited by loss of function assays in which the ability of site directed mutants to retain the GTP binding activity was evaluated. In fact, mutation in the putative GTP/ATP binding site blocked GTP binding. These results established that the S-64 protein is, in fact, a GTP-binding membrane-associated protein. The GTP binding activity of S-64 may be involved in the regulation of the protein function. / Dissertação importada do Alexandria

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-06T16:50:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 463869 bytes, checksum: 0aa796e02ec00cabc4aadbba1841b3f9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-06T16:50:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 463869 bytes, checksum: 0aa796e02ec00cabc4aadbba1841b3f9 (MD5) Previous issue date: 2003-04-10 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O teor de proteína no farelo de soja tem influenciado o preço final pago ao produtor. Por esta razão, um dos principais objetivos do melhoramento da soja é o desenvolvimento de variedades com alto teor de proteína e alta produtividade. Três variedades comerciais e seis linhagens de soja com teor normal de proteína foram cruzadas com dezoito linhagens de alto teor de proteína para promover uma combinação desejável de alto teor de proteína e alta produtividade. Os objetivos gerais deste trabalho foram a introgressão de alelos de alto teor de proteína em variedades elite de soja por retrocruzamentos e seleção assistida por microanálises bioquímicas e por marcadores microssatélites. Neste sentido, várias metas específicas foram atingidas neste trabalho tais como: (a) realização de uma análise de divergência genética baseado em marcadores microssatélites entre progenitores recorrentes e doadores de alto teor de proteína; (b) determinação do número ideal de primers de microssatélites para assistir um programa de retrocruzamentos; (c) realização de seleção por meio de microanálises bioquímicas após uma única geração de autofecundação; (d) seleção de indivíduos mais próximos geneticamente do progenitor recorrente e com maior teor de proteína; (e) determinação do ganho de seleção das plantas selecionadas e (f) caracterização de linhagens de soja com alto teor de proteína quanto à sua composição bioquímica. Como conclusões, foi evidenciado que a utilização de 57 pares de primers de microssatélites (SSR) foram eficientes para avaliar a diversidade genética entre os genótipos doadores e recorrentes, permitindo que genótipos mais próximos geneticamente entre si fossem utilizados no programa de retrocruzamento para introgressão de alelos de alto teor de proteína em soja. Foram definidos 44 dos 57 pares de primers de SSR previamente selecionados como o número ótimo para assistir o programa de retrocruzamentos visando a introgressão de alelos de alto teor de proteína, com 95% de correlação e 6,44% de estresse e, ainda, foram escolhidas três combinações destes 44 pares de primers que proporcionaram o mesmo agrupamento original obtido quando foram utilizados 57 pares de primers. A análise de variância evidenciou variabilidade genética para todos os cruzamentos avaliados e um alto valor de herdabilidade para teor de proteína em soja, sendo que os melhores cruzamentos foram aqueles que envolveram o progenitor recorrente OC 953312, que apresentou a maior herdabilidade (93,1%) e maior variabilidade genética (4,62). Os melhores progenitores doadores foram escolhidos com base em suas capacidade específica de combinação (CEC), por meio do teste de média, o que reduzirá o número de cruzamentos e análises e, conseqüentemente, os custos do programa de retrocruzamento. As plantas selecionadas para alto teor de proteína independente do cruzamento tiveram em média teores de proteína de 45,74 a 47,47% sendo que os ganhos reais para teor de proteína foram de 3,88 a 9,35%. As plantas que tiveram alto teor de proteína e menores distâncias genéticas em relação ao progenitor recorrente foram selecionadas para dar prosseguimento ao programa de retrocruzamentos. A caracterização bioquímica das isolinhas com alto teor de proteína indicou que o aumento no teor de proteína promoveu uma redução no teor de óleo e carboidratos totais. A análise da composição aminoacídica das isolinhas de alto teor de proteína comparada com a linhagem recorrente (normal) evidenciou que não houve alteração aparente na composição aminoacídica das isolinhas e, ainda, foi observado que o aumento do teor de proteína ocorreu principalmente devido ao aumento no teor da proteína de reserva 11S (de melhor qualidade), havendo inclusive uma pequena redução na proteína de reserva 7S. Esta observação é importante, pois indica que o melhoramento para teor de proteína não reduziu o valor nutricional da proteína da soja, podendo até mesmo melhorar a sua qualidade. / Soy flour protein content greatly influences the final price paid to the producer. For this reason one of the main objectives of soybean breeding is to select for high protein cultivars. The main goal of this work was the introgression of alleles for high protein content in soybean elite cultivars through backcross assisted by molecular markers. For that reason, several specific tasks were achieved, such as (a) analyses of genetic diversity among recurrent and donor parents with microsatellite markers; (b) determination of the ideal number of microsatellite primers to assist the backcross program; (c) selection of high protein genotypes by using non- destructive single seed analyses after one generation of self-pollination; (d) selection of genotypes genetically closer to the recurrent parent; (e) protein yield determination of F2 selected plants and (f) biochemical characterization of high protein soybean lines. The use of 57 selected pairs of microsatellite primers was efficient to evaluate the genetic diversity among the recurrent and donor parents, which allow the choice of genetically closer genotypes for the backcross breeding program. Forty-four of the 57 pairs of primers previously selected were defined as an optimum number of primers to assist the backcross breeding program, with 95% correlation and 6.44% stress. The three best 44 primers combinations that yields the same original clustering obtained with the 57 pairs of primers were chosen. Variance analysis evidenced genetic variability for all crosses analyzed and a high heritability value for protein content in soybean, being the best crosses the ones that used recurrent parent OC 953312, which showed the highest heritability (93.1%) and genetic variability values (4.62). The best donor parents were chosen based on capacity specific combination by using the mean test. This will reduce the number of crosses and biochemical analyses needed and, consequently, the cost of the backcross breeding program. Selected plants for high protein independently of the crossing had an average of protein content varying from 45.74 to 47.47%, and the real gains for protein varying from 3.88 (9.17%) to 9.35 (24.86%). Plants that had the highest protein content and the lowest genetic distances in relation to the recurrent parent were selected for the backcross breeding. A biochemical characterization was performed in the high protein near isogenic lines (NILs) derived from CAC 1 variety. The increase in protein content promotes reduction in oil as well as in total carbohydrates contents of the soybean seeds. A soy flour amino acid analysis showed that there was no significant alteration in the amino acid contents in the high protein lines. Scanner densitometry estimation of soybean protein components separated by SDS-PAGE showed that the increase of protein content of the NILs are due to an increase in the 11S storage protein component, which is of better quality. The scanner densitometry evaluation showed a slight reduction in 7S storage protein content in the high protein lines. This observation is of interest since it pointed out that the backcross breeding for high protein content does not reduce, being even possible to increase the nutritional and functional values of the soybean protein. / Tese importada do Alexandria

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-09-01T12:08:27Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 631605 bytes, checksum: 52432c66349cbd1015ae06e8db596889 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-01T12:08:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 631605 bytes, checksum: 52432c66349cbd1015ae06e8db596889 (MD5) Previous issue date: 1998-07-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Proteínas solúveis e de membrana da rota secretora são inicialmente endereçadas ao retículo endoplasmático (RE) e translocadas através da membrana deste. Em seguida, elas transitam através do Golgi para alcançar os compartimentos subcelulares e o meio extracelular. O RE mantém uma eficiente maquinaria de translocação, dobramento, associação, montagem de oligômeros e controle de qualidade de proteínas secretórias. A proteína BiP ("Binding Protein"), residente no RE, exibe atividade de chaperone molecular e participa ativamente neste processo por meio de interações proteína:proteína. Com o objetivo de identificar substratos potenciais de BiP, anticorpos contra frações microssomais isoladas da semente de soja foram usados para o escrutínio de uma biblioteca de expressão. Um clone de cDNA, denominado pUFVS64, que codifica uma proteína secretória, foi isolado e caracterizado. A proteína, codificada por pUFVS64 e denominada S-64, é sintetizada na semente de soja, em baixos níveis, e possui uma identidade de seqüência de 85% com uma proteína de membrana que se liga à sacarose, denominada SBP ("Sucrose Binding Protein"). Células intactas foram utilizadas para introdução de genes via eletroporação, ou biobalística, com o objetivo de aumentar a síntese da proteína S-64 em suspensões celulares de soja, de forma a aumentar a sensibilidade dos ensaios para determinação de associações entre as proteínas BiP e S-64.A associação entre BiP e S-64 foi avaliada, levando-se em consideração características bioquímicas diferenciadas, associadas com as referidas proteínas. Ensaios de sedimentação por afinidade, com o uso das resinas de ATP-agarose, GTP-agarose e ConA- sepharose, foram conduzidos, utilizando-se extratos de proteína total, de suspensões celulares de soja. Tanto S-64 quanto BiP são co-precipitadas por GTP-agarose, embora BiP não se associe com este nucleotídeo. A capacidade da resina GTP-agarose em sedimentar BiP reflete associação prévia entre BiP e uma proteína que liga GTP. Similarmente, ATP-agarose foi eficiente em co-sedimentar ambas as proteínas, embora apenas BiP se ligue diretamente à ATP. A sedimentação indireta de S-64 pela resina ATP-agarose demonstrou que S-64 estava a uma proteína que liga a ATP. A proteína S-64 é glicosilada e se liga diretamente a ConA-sepharose, enquanto BiP não se associa diretamente com concanavalina-A. Mesmo assim, BiP foi co-sedimentada indiretamente por ConA- sepharose. Coletivamente, estes resultados sugerem que S-64 interage com BiP, constituindo um substrato em potencial para caracterização de associações mediadas pela proteína BiP de plantas. / Newly synthesized secretory and membrane proteins are synthesized on membrane-bound polysomes and co-translationally sequestered in the lumen of the endoplasmic reticulum (ER). These proteins then move to and through the Golgi complex where they are either secreted or sorted to subcelullar compartments. The ER keeps an efficient machinery for translocation, association, assembly of secretory proteins which functions as a quality control system of protein exit from this organelle. The ER-resident protein BiP (Binding Protein) exhibits a molecular chaperone activity and has been described as an important component of the quality control mechanism in the ER which is mediated by protein:protein interaction. In order to identify potential substrates for BiP, antibodies raised against membrane-enriched protein fractions from soybean seeds where used as a probe to screen a expression library. A cDNA clone, named pUFVS64, that encodes a secretory protein was isolated and characterized. The cDNA-encoded protein, designated S-64, is synthesized at low levels in soybean seeds and shares 85% sequence identity with the sucrose binding protein (SBP) which is a membrane-associated protein. In order to increase the sensitivity in the assays for detection of BiP:S-64 associations, the S- 64 cDNA was introduzed in soybean cultured cells by electroporation or a biolistic particle delivery system. The S-64:BiP association was evaluated taking advantage of the differential biochemical properties associated with the proteins. Affinity-precipitation assays, using ATP-agarose, GTP-agarose and ConA- sepharose resins, were performed with total protein extracts from soybean cultured cells. Both S-64 and BiP are co-precipitated by GTP-agarose, although BiP does not bind to GTP. The capacity of GTP-agarose to precipitate BiP reflects previous association between BiP and a GTP-binding protein. Likewise, the ATP-agarose resin co-precipitates efficiently both proteins, although just BiP binds ATP. The indirect precipitation of S-64 by ATP-agarose demonstrated that S-64 interacts with an ATP-binding protein. The S-64 protein is glycosylated and binds directly to ConA-sepharose, while BiP does not. However, the efficiency of BiP precipitation by ConA-sepharose was as high as of S-64 precipitation. Taken together, these results suggest that S-64 interacts with BiP and may be a potential substrate for the characterization of protein interactions mediated by plant BiP. / Não foi localizado o cpf do autor.