Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-05-20T21:12:50Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_EstudoEfeitosExpressão.pdf: 2296221 bytes, checksum: 490a666744d910e3f861fdde0f815d5d (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-05-22T14:40:12Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_EstudoEfeitosExpressão.pdf: 2296221 bytes, checksum: 490a666744d910e3f861fdde0f815d5d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-22T14:40:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_EstudoEfeitosExpressão.pdf: 2296221 bytes, checksum: 490a666744d910e3f861fdde0f815d5d (MD5) Previous issue date: 2015 / Os Dengue virus (DENV) possuem um genoma constituído de RNA senso positivo que expressa proteínas estruturais e não estruturais dentre as quais destaca-se a NS1. Esta desempenha uma atividade na replicação do genoma viral e pode exercer um papel na modulação de vias sinalizadoras celulares. Esta função foi demonstrada por nosso grupo através de em um modelo de células HepG2 expressando NS1 de forma constitutiva em que NS1 altera o perfil de ativação de proteínas da via NF-kB. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo avaliar através de ensaios de atividade de luciferase, a atividade transcricional no promotor de IL-6 em células transfectadas de forma estável para a expressão de NS1. Uma vez que altos níveis de IL-6 são detectados no soro de pacientes infectados e que esta citocina pode ser modulada pela via de NF-kB. Os resultados mostraram que a expressão da NS1 aumenta a atividade transcricional no promotor de IL-6 nas células HepG2. Além disso, uma mutação pontual no sítio de ligação de um fator transcricional denominado AP-1 (heterodimero de cFOS e cJUN) no promotor de IL-6, resultou na diminuição desta atividade. Adicionalmente, foi verificado que células expressando NS1 tanto de forma transiente como constitutiva apresentam também uma maior atividade transcricional de AP-1 ativado pela via JNK das MAP cinases. Tais dados sugerem que esta via pode também ser regulada em função da presença de NS1. Outros ensaios de luciferases foram conduzidos para avaliar possíveis alterações nas vias de STAT3 e das MAP cinases MEK/ERK, quando as células foram estimuladas com soro fetal bovino, e avaliar o papel de NS1 na manipulação destas vias. Os resultados obtidos por este trabalho poderão ajudar na compreensão dos mecanismos utilizados pelos DENV na modulação da expressão de genes celulares e auxiliar a condução de pesquisas com foco no desenvolvimento de estratégias terapêuticas para combate ao vírus. _______________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The Dengue virus (DENV) have a genome of RNA positive sense expressing structural and non-structural proteins among which stands out the NS1 which exerts an activity in the viral genome replication and may play a role in the modulation of cell signaling pathways. This function has been demonstrated by our group using HepG2 cells in a model constitutively expressing NS1 in which NS1 alters the protein activation profile of the NF-kB pathway. However, the aim of this work was to evaluate through luciferase activity assays, the expression of pro-inflammatory proteins in HepG2 cells expressing the NS1 protein and also the transcriptional activity in the IL-6 promoter in cells stably transfected for the expression of NS1, since high levels of IL-6 are found in serum of infected patients and that this cytokine may be modulated by the NF-kB pathway. The results showed that the expression of NS1 increases the transcriptional activity of the IL-6 promoter in HepG2 cells. Furthermore, a punctual mutation at the binding site of a transcriptional factor called AP-1 (heterodimer cFos and cJun) in the IL-6 promoter, resulted in decrease of this activity. Additionally, it was verified that cells expressing NS1 both transient and constitutive also exhibit greater transcriptional activity of AP-1 of the JNK pathway activated by MAP kinases. These data suggest that this pathway may also be regulated as a function of the presence of NS1. Further tests were conducted to evaluate possible changes in the STAT3 and MEK/ERK MAP kinase pathway, when the cells were stimulated with fetal bovine serum and also to avaluate the role of NS1 in handling these routes. The results of this study will help to understand the mechanisms used by DENV in modulating the expression of cellular genes and support carrying out researches focused on the development of therapeutic strategies to combat the virus.

Submitted by Luiz Felipe Barbosa (luiz.fbabreu2@ufpe.br) on 2015-03-13T14:27:14Z No. of bitstreams: 2 TESE TAMARA DE CARLI - versao final biblioteca.pdf: 15216831 bytes, checksum: 267a961053b23cb6f6a0158a30d06f96 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T14:27:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE TAMARA DE CARLI - versao final biblioteca.pdf: 15216831 bytes, checksum: 267a961053b23cb6f6a0158a30d06f96 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-09-21 / FACEPE, CNPq e CPqAM/FIOCRUZ / Em eucariotos, a proteína de ligação à cauda poli-A (PABP) se liga especificamente a seqüência de poli-adenosinas na extremidade 3’ dos mRNAs, atuando em múltiplas funções associadas ao metabolismo destes, incluindo biogênese, processamento, transporte núcleo-citoplasmático e degradação. A PABP também participa na síntese proteíca, via interações diretas com fatores de tradução, como o fator de iniciação eIF4G, parceiro da proteína de ligação ao cap eIF4E. O objetivo desta Tese foi dar continuidade a caracterização de três homólogos da PABP identificados em Leishmania sp. (PABPs1, 2 e 3), protozoários patogênicos de características biológicas diferenciadas. Em estudos prévios estas proteínas se mostraram abundantes e de expressão simultânea e a PABP1 se mostrou representada por isoformas associadas a sua fosforilação. Neste trabalho, foi observado que as três proteínas possuem localização citoplasmática, porém sob condições de inibição da transcrição, mas não de tradução ou processamento de mRNAs, as PABPs 2 e 3 migram para o núcleo. Esse comportamento está de acordo com ensaios de interação proteína-proteina, onde foi observada uma associação direta entre as PABPs 2 e 3, independente de RNA. A expressão de isoformas fosforiladas da PABP1 foi então analisada e observou-se que esta era afetada pela inibição dos processos de síntese de mRNAs. Investigando sua participação no processo de tradução, foram confirmadas interações específicas entre a PABP1 e um homólogo de eIF4G in vivo e interações inéditas entre esta e homólogos de eIF4E. As três proteínas se mostraram capazes de se associar com os polissomas de células em fase de crescimento exponencial, mas não de fase estacionária. Ao longo do trabalho foram mapeados motivos envolvidos com as interações observadas identificando características novas não descritas. Por fim, ensaios de co-imunoprecipitação seguido de análise protéica por espectrometria de massa e de RNAs por RT-PCR confirmaram a presença de parceiros protéicos diferenciados para cada homólogo e mRNAs alvo para as PABPs 2 e 3 cuja tradução está associada a fase S do ciclo celular. Nossos resultados mostram que estas proteínas apresentam funções divergentes e reforça um papel mais geral da PABP1 na tradução.

Introdução: Nos últimos anos têm-se demonstrado que a vitamina D desempenha um papel crucial em muitas doenças agudas e crônicas, não só afetando as condições ósseas, mas também aumentando o risco de fraturas, doenças auto-imunes e câncer. A influência da vitamina D nas doenças do fígado tem sido amplamente discutida já que esta sofre metabolismo hepático. Indivíduos com doenças hepáticas, e em especial com hepatite C crônica, apresentam maior prevalência de deficiência de vitamina D. Objetivos: Avaliar, em duas amostras distintas, a influência dos níveis séricos de vitamina D e/ou dos polimorfismos envolvidos na sua rota metabólica na progressão da doença hepática crônica causada pelo vírus C. Métodos: A primeira amostra consistiu de um estudo transversal com 132 pacientes com hepatite C crônica genótipo 1 do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). Foi avaliada a influência de níveis séricos de vitamina D e dos polimorfismos rs7041 e rs4588 do gene GC no grau de fibrose hepática (escore METAVIR). As genotipagens foram feitas com ensaio TaqMan e as análises estatísticas foram realizadas no programa SPSS v.20.0. A segunda amostra consistiu da análise de dados extraídos da plataforma dbGaP. Foram investigados 681 pacientes com hepatite C crônica da coorte americana HALT-C, acompanhados pelo período quatro anos. Avaliou-se a relação de 40 polimorfismos dos genes DHCR7, GC, CYP2R1, CYP24A1, CYP27B1, VDR, SMAD3 e TGFB1 nos seguintes desfechos: piora da fibrose hepática; descompensação hepática (escore Child Pugh-Turcotte>7, ascite, encefalopatia hepática, peritonite bacteriana espontânea e/ou sangramento de varizes gastroesofágicas); desenvolvimento de carcinoma hepatocelular e morte do fígado. Os polimorfismos que não se encontravam disponíveis no banco de dados foram imputados com o programa Mach-Admix 2.0.203 e as análises foram no programa Plink 1.07 e foi realizada correção de Bonferroni. Nesta amostra, resultados com P<0,05 foram considerados 2 como tendência à associação. Resultados: Na amostra do HCPA, níveis diminuídos de vitamina D, bem como a deficiência grave de vitamina D, foram mais frequentes entre pacientes com fibrose intermediária/avançada (METAVIR 3 e 4). Embora os polimorfismos rs7041 e rs4588 e seus haplótipos tenham apresentado relação com os níveis séricos de vitamina D, estes não apresentaram associação com a gravidade da fibrose hepática. Na segunda amostra estudada, onze polimorfismos tiveram tendência à associação (P<0,05) com os desfechos analisados: quatro SNPs no gene DHCR7 com descompensação hepática (rs4944957, rs12800438, rs3829251 e rs4945008); dois no gene GC com piora da fibrose e morte do fígado (rs7041 e rs222020); dois no gene CYP2R1 com ascite ou carcinoma hepatocelular (rs7116978 e rs1562902); dois no gene VDR com sangramento de varizes gastresofágicas e carcinoma hepatocelular (rs4516035 e rs2239186); e um no gene SMAD3 com piora da fibrose e encefalopatia (rs2118610). Apenas um polimorfismo, rs1800469no gene TGFB1, apresentou associação com descompensação hepática após correção de Bonferroni (P<0,05/40). Conclusões: Nossos resultados demonstraram que níveis séricos menores de vitamina D estão associados à progressão da fibrose hepática na hepatite C crônica genótipo 1. Além disso, os onze polimorfismos da rota da vitamina D que apresentaram tendência à associação estatística, indicam que variantes genéticas da rota metabólica da vitamina D possuem fraca ou nenhuma relação com a progressão da hepatite C crônica, merecendo análises futuras. Já o polimorfismo rs1800469, do gene TGFB1, demonstrou potencial utilidade para auxiliar na identificação de pacientes com maior chance de descompensação hepática. / Introduction: In the past years it has been demonstrated that vitamin D plays a crucial role in many acute and chronic diseases, not only affecting bone conditions but increasing the chance of fractures, autoimmune diseases and cancer. Vitamin D influence in liver disease is also widely discussed since it undergoes trough hepatic metabolism. Subjects with liver diseases, especially chronic hepatitis C, present higher rates of vitamin D deficiency. Objectives: Evaluate, in two different samples, the influence of vitamin D serum levels and/or polymorphisms of vitamin D metabolic pathway in liver disease progression in patients with chronic hepatitis C. Methods: The first sample consisted of a transversal study with 132 patients from Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) with chronic hepatitis C genotype 1. We evaluated the influence of serum levels of vitamin D and rs7041 and rs4588 GC polymorphisms over liver fibrosis (METAVIR scoring). Genotyping was performed with TaqMan probes and statistical analyses were conducted using SPSS v.20.0. The second sample was extracted from HALT-C cohort available in dbGap plataform. It included 681 patients with chronic hepatitis C, followed for 4 years. Forty polymorphisms in DHCR7, GC, CYP2R1, CYP24A1, CYP27B1, VDR, SMAD3 and TGFB1 genes were analyzed with the following outcomes: worsening of fibrosis; hepatic decompensation (gastric/esophageal bleeding, CTP > 7, ascites, spontaneous bacterial peritonitis, and/or encephalopathy); development of hepatocellular carcinoma; and liver death. Polymorphisms not available in dbGaP data were imputed using Mach-Admix 2.0.203 software and analyses were performed in Plink v.1.07 and a Bonferroni’s correction was performed. Results with P<0.05 were considered as having tendency towards association. Results: In HCPA sample low serum vitamin D, as well as severe vitamin D deficiency, were more frequent among patients with intermediate/severe fibrosis (METAVIR 3 and 4). Although rs7041 and rs4588 4 polymorphisms and its haplotypes presented association with serum levels of vitamin D, they were not associated with severity of liver fibrosis. In sample two, eleven polymorphisms presented tendency towards association (P<0.05) with the studied outcomes: four SNPs in DHCR7 with hepatic decompensation (rs4944957, rs12800438, rs3829251 and rs4945008); two in GC with worsening of fibrosis and liver death (rs7041 and rs222020); two in CYP2R1 with ascites or hepatocellular carcinoma (rs7116978 and rs1562902); two in VDR with gastric/esophageal bleeding and hepatocellular carcinoma (rs4516035 and rs2239186); and one in SMAD3 with worsening of fibrosis and encephalopathy (rs2118610). Only one polymorphism, rs1800469 in TGFB1, showed statistical significance with hepatic decompensation after Bonferroni’s correction (P<0.05/40). Conclusions: Our results demonstrated that low serum vitamin D has association with fibrosis progression in chronic hepatitis C genotype 1. Also, the eleven polymorphisms with tendency towards association indicate that genetic variants in vitamin D pathway possess weak or none relation with progression of chronic hepatitis C, deserving future analyses. Finally, polymorphism rs1800469 in TGFB1 demonstrated potential utility to help identify patients with higher odds of hepatic decompesantion.

Submitted by Mendes Eduardo (dasilva@ufba.br) on 2013-08-21T15:10:18Z No. of bitstreams: 1 Dissertação final Igor Leonardo.pdf: 1062966 bytes, checksum: a0b1f2e686019a267d4eefce030fe7c0 (MD5) / Approved for entry into archive by Vilma Conceição(vilmagc@ufba.br) on 2013-08-21T18:08:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação final Igor Leonardo.pdf: 1062966 bytes, checksum: a0b1f2e686019a267d4eefce030fe7c0 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-21T18:08:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação final Igor Leonardo.pdf: 1062966 bytes, checksum: a0b1f2e686019a267d4eefce030fe7c0 (MD5) / Fapesb / A atividade industrial tem potencial para gerar resíduos tóxicos que podem atingir o ambiente. Nos complexos industriais, as correntes “não orgânicas” que compõem o sistema supostamente “não contaminado” são direcionadas a bacias de contenção, cujo reuso das águas pode ser feito, fundamentando-se na comprovação de sua qualidade. O uso de biomarcadores de exposição no embasamento de ações de controle e risco permite a detecção de impactos deletérios antes que sejam manifestados em níveis de populações ou comunidades. As metalotionéinas são proteínas que indicam a presença de metais traços no ambiente. Este trabalho visou avaliar a biodisponibilidade de metais traços na água e no sedimento de diferentes pontos de Bacias de Contenção de efluentes petroquímicos, utilizando como organismos-testes juvenis de Tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus), através da indução de metalotioneínas. As tilápias foram expostas à água, proveniente de diversos pontos amostrais da bacia de contenção, bem como ao sedimento, por um período de 24 horas. Foram utilizadas 5 réplicas para cada ponto de amostragem, além de um ponto controle. Os resultados indicaram a presença de metais traços em concentrações acima das encontradas na amostra-controle, salientando a eficiência destes biomarcadores na avaliação da qualidade hídrica para o reuso industrial. / Salvador, Bahia.

Introdução: Nos últimos anos têm-se demonstrado que a vitamina D desempenha um papel crucial em muitas doenças agudas e crônicas, não só afetando as condições ósseas, mas também aumentando o risco de fraturas, doenças auto-imunes e câncer. A influência da vitamina D nas doenças do fígado tem sido amplamente discutida já que esta sofre metabolismo hepático. Indivíduos com doenças hepáticas, e em especial com hepatite C crônica, apresentam maior prevalência de deficiência de vitamina D. Objetivos: Avaliar, em duas amostras distintas, a influência dos níveis séricos de vitamina D e/ou dos polimorfismos envolvidos na sua rota metabólica na progressão da doença hepática crônica causada pelo vírus C. Métodos: A primeira amostra consistiu de um estudo transversal com 132 pacientes com hepatite C crônica genótipo 1 do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). Foi avaliada a influência de níveis séricos de vitamina D e dos polimorfismos rs7041 e rs4588 do gene GC no grau de fibrose hepática (escore METAVIR). As genotipagens foram feitas com ensaio TaqMan e as análises estatísticas foram realizadas no programa SPSS v.20.0. A segunda amostra consistiu da análise de dados extraídos da plataforma dbGaP. Foram investigados 681 pacientes com hepatite C crônica da coorte americana HALT-C, acompanhados pelo período quatro anos. Avaliou-se a relação de 40 polimorfismos dos genes DHCR7, GC, CYP2R1, CYP24A1, CYP27B1, VDR, SMAD3 e TGFB1 nos seguintes desfechos: piora da fibrose hepática; descompensação hepática (escore Child Pugh-Turcotte>7, ascite, encefalopatia hepática, peritonite bacteriana espontânea e/ou sangramento de varizes gastroesofágicas); desenvolvimento de carcinoma hepatocelular e morte do fígado. Os polimorfismos que não se encontravam disponíveis no banco de dados foram imputados com o programa Mach-Admix 2.0.203 e as análises foram no programa Plink 1.07 e foi realizada correção de Bonferroni. Nesta amostra, resultados com P<0,05 foram considerados 2 como tendência à associação. Resultados: Na amostra do HCPA, níveis diminuídos de vitamina D, bem como a deficiência grave de vitamina D, foram mais frequentes entre pacientes com fibrose intermediária/avançada (METAVIR 3 e 4). Embora os polimorfismos rs7041 e rs4588 e seus haplótipos tenham apresentado relação com os níveis séricos de vitamina D, estes não apresentaram associação com a gravidade da fibrose hepática. Na segunda amostra estudada, onze polimorfismos tiveram tendência à associação (P<0,05) com os desfechos analisados: quatro SNPs no gene DHCR7 com descompensação hepática (rs4944957, rs12800438, rs3829251 e rs4945008); dois no gene GC com piora da fibrose e morte do fígado (rs7041 e rs222020); dois no gene CYP2R1 com ascite ou carcinoma hepatocelular (rs7116978 e rs1562902); dois no gene VDR com sangramento de varizes gastresofágicas e carcinoma hepatocelular (rs4516035 e rs2239186); e um no gene SMAD3 com piora da fibrose e encefalopatia (rs2118610). Apenas um polimorfismo, rs1800469no gene TGFB1, apresentou associação com descompensação hepática após correção de Bonferroni (P<0,05/40). Conclusões: Nossos resultados demonstraram que níveis séricos menores de vitamina D estão associados à progressão da fibrose hepática na hepatite C crônica genótipo 1. Além disso, os onze polimorfismos da rota da vitamina D que apresentaram tendência à associação estatística, indicam que variantes genéticas da rota metabólica da vitamina D possuem fraca ou nenhuma relação com a progressão da hepatite C crônica, merecendo análises futuras. Já o polimorfismo rs1800469, do gene TGFB1, demonstrou potencial utilidade para auxiliar na identificação de pacientes com maior chance de descompensação hepática. / Introduction: In the past years it has been demonstrated that vitamin D plays a crucial role in many acute and chronic diseases, not only affecting bone conditions but increasing the chance of fractures, autoimmune diseases and cancer. Vitamin D influence in liver disease is also widely discussed since it undergoes trough hepatic metabolism. Subjects with liver diseases, especially chronic hepatitis C, present higher rates of vitamin D deficiency. Objectives: Evaluate, in two different samples, the influence of vitamin D serum levels and/or polymorphisms of vitamin D metabolic pathway in liver disease progression in patients with chronic hepatitis C. Methods: The first sample consisted of a transversal study with 132 patients from Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) with chronic hepatitis C genotype 1. We evaluated the influence of serum levels of vitamin D and rs7041 and rs4588 GC polymorphisms over liver fibrosis (METAVIR scoring). Genotyping was performed with TaqMan probes and statistical analyses were conducted using SPSS v.20.0. The second sample was extracted from HALT-C cohort available in dbGap plataform. It included 681 patients with chronic hepatitis C, followed for 4 years. Forty polymorphisms in DHCR7, GC, CYP2R1, CYP24A1, CYP27B1, VDR, SMAD3 and TGFB1 genes were analyzed with the following outcomes: worsening of fibrosis; hepatic decompensation (gastric/esophageal bleeding, CTP > 7, ascites, spontaneous bacterial peritonitis, and/or encephalopathy); development of hepatocellular carcinoma; and liver death. Polymorphisms not available in dbGaP data were imputed using Mach-Admix 2.0.203 software and analyses were performed in Plink v.1.07 and a Bonferroni’s correction was performed. Results with P<0.05 were considered as having tendency towards association. Results: In HCPA sample low serum vitamin D, as well as severe vitamin D deficiency, were more frequent among patients with intermediate/severe fibrosis (METAVIR 3 and 4). Although rs7041 and rs4588 4 polymorphisms and its haplotypes presented association with serum levels of vitamin D, they were not associated with severity of liver fibrosis. In sample two, eleven polymorphisms presented tendency towards association (P<0.05) with the studied outcomes: four SNPs in DHCR7 with hepatic decompensation (rs4944957, rs12800438, rs3829251 and rs4945008); two in GC with worsening of fibrosis and liver death (rs7041 and rs222020); two in CYP2R1 with ascites or hepatocellular carcinoma (rs7116978 and rs1562902); two in VDR with gastric/esophageal bleeding and hepatocellular carcinoma (rs4516035 and rs2239186); and one in SMAD3 with worsening of fibrosis and encephalopathy (rs2118610). Only one polymorphism, rs1800469 in TGFB1, showed statistical significance with hepatic decompensation after Bonferroni’s correction (P<0.05/40). Conclusions: Our results demonstrated that low serum vitamin D has association with fibrosis progression in chronic hepatitis C genotype 1. Also, the eleven polymorphisms with tendency towards association indicate that genetic variants in vitamin D pathway possess weak or none relation with progression of chronic hepatitis C, deserving future analyses. Finally, polymorphism rs1800469 in TGFB1 demonstrated potential utility to help identify patients with higher odds of hepatic decompesantion.

Introdução: Nos últimos anos têm-se demonstrado que a vitamina D desempenha um papel crucial em muitas doenças agudas e crônicas, não só afetando as condições ósseas, mas também aumentando o risco de fraturas, doenças auto-imunes e câncer. A influência da vitamina D nas doenças do fígado tem sido amplamente discutida já que esta sofre metabolismo hepático. Indivíduos com doenças hepáticas, e em especial com hepatite C crônica, apresentam maior prevalência de deficiência de vitamina D. Objetivos: Avaliar, em duas amostras distintas, a influência dos níveis séricos de vitamina D e/ou dos polimorfismos envolvidos na sua rota metabólica na progressão da doença hepática crônica causada pelo vírus C. Métodos: A primeira amostra consistiu de um estudo transversal com 132 pacientes com hepatite C crônica genótipo 1 do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). Foi avaliada a influência de níveis séricos de vitamina D e dos polimorfismos rs7041 e rs4588 do gene GC no grau de fibrose hepática (escore METAVIR). As genotipagens foram feitas com ensaio TaqMan e as análises estatísticas foram realizadas no programa SPSS v.20.0. A segunda amostra consistiu da análise de dados extraídos da plataforma dbGaP. Foram investigados 681 pacientes com hepatite C crônica da coorte americana HALT-C, acompanhados pelo período quatro anos. Avaliou-se a relação de 40 polimorfismos dos genes DHCR7, GC, CYP2R1, CYP24A1, CYP27B1, VDR, SMAD3 e TGFB1 nos seguintes desfechos: piora da fibrose hepática; descompensação hepática (escore Child Pugh-Turcotte>7, ascite, encefalopatia hepática, peritonite bacteriana espontânea e/ou sangramento de varizes gastroesofágicas); desenvolvimento de carcinoma hepatocelular e morte do fígado. Os polimorfismos que não se encontravam disponíveis no banco de dados foram imputados com o programa Mach-Admix 2.0.203 e as análises foram no programa Plink 1.07 e foi realizada correção de Bonferroni. Nesta amostra, resultados com P<0,05 foram considerados 2 como tendência à associação. Resultados: Na amostra do HCPA, níveis diminuídos de vitamina D, bem como a deficiência grave de vitamina D, foram mais frequentes entre pacientes com fibrose intermediária/avançada (METAVIR 3 e 4). Embora os polimorfismos rs7041 e rs4588 e seus haplótipos tenham apresentado relação com os níveis séricos de vitamina D, estes não apresentaram associação com a gravidade da fibrose hepática. Na segunda amostra estudada, onze polimorfismos tiveram tendência à associação (P<0,05) com os desfechos analisados: quatro SNPs no gene DHCR7 com descompensação hepática (rs4944957, rs12800438, rs3829251 e rs4945008); dois no gene GC com piora da fibrose e morte do fígado (rs7041 e rs222020); dois no gene CYP2R1 com ascite ou carcinoma hepatocelular (rs7116978 e rs1562902); dois no gene VDR com sangramento de varizes gastresofágicas e carcinoma hepatocelular (rs4516035 e rs2239186); e um no gene SMAD3 com piora da fibrose e encefalopatia (rs2118610). Apenas um polimorfismo, rs1800469no gene TGFB1, apresentou associação com descompensação hepática após correção de Bonferroni (P<0,05/40). Conclusões: Nossos resultados demonstraram que níveis séricos menores de vitamina D estão associados à progressão da fibrose hepática na hepatite C crônica genótipo 1. Além disso, os onze polimorfismos da rota da vitamina D que apresentaram tendência à associação estatística, indicam que variantes genéticas da rota metabólica da vitamina D possuem fraca ou nenhuma relação com a progressão da hepatite C crônica, merecendo análises futuras. Já o polimorfismo rs1800469, do gene TGFB1, demonstrou potencial utilidade para auxiliar na identificação de pacientes com maior chance de descompensação hepática. / Introduction: In the past years it has been demonstrated that vitamin D plays a crucial role in many acute and chronic diseases, not only affecting bone conditions but increasing the chance of fractures, autoimmune diseases and cancer. Vitamin D influence in liver disease is also widely discussed since it undergoes trough hepatic metabolism. Subjects with liver diseases, especially chronic hepatitis C, present higher rates of vitamin D deficiency. Objectives: Evaluate, in two different samples, the influence of vitamin D serum levels and/or polymorphisms of vitamin D metabolic pathway in liver disease progression in patients with chronic hepatitis C. Methods: The first sample consisted of a transversal study with 132 patients from Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) with chronic hepatitis C genotype 1. We evaluated the influence of serum levels of vitamin D and rs7041 and rs4588 GC polymorphisms over liver fibrosis (METAVIR scoring). Genotyping was performed with TaqMan probes and statistical analyses were conducted using SPSS v.20.0. The second sample was extracted from HALT-C cohort available in dbGap plataform. It included 681 patients with chronic hepatitis C, followed for 4 years. Forty polymorphisms in DHCR7, GC, CYP2R1, CYP24A1, CYP27B1, VDR, SMAD3 and TGFB1 genes were analyzed with the following outcomes: worsening of fibrosis; hepatic decompensation (gastric/esophageal bleeding, CTP > 7, ascites, spontaneous bacterial peritonitis, and/or encephalopathy); development of hepatocellular carcinoma; and liver death. Polymorphisms not available in dbGaP data were imputed using Mach-Admix 2.0.203 software and analyses were performed in Plink v.1.07 and a Bonferroni’s correction was performed. Results with P<0.05 were considered as having tendency towards association. Results: In HCPA sample low serum vitamin D, as well as severe vitamin D deficiency, were more frequent among patients with intermediate/severe fibrosis (METAVIR 3 and 4). Although rs7041 and rs4588 4 polymorphisms and its haplotypes presented association with serum levels of vitamin D, they were not associated with severity of liver fibrosis. In sample two, eleven polymorphisms presented tendency towards association (P<0.05) with the studied outcomes: four SNPs in DHCR7 with hepatic decompensation (rs4944957, rs12800438, rs3829251 and rs4945008); two in GC with worsening of fibrosis and liver death (rs7041 and rs222020); two in CYP2R1 with ascites or hepatocellular carcinoma (rs7116978 and rs1562902); two in VDR with gastric/esophageal bleeding and hepatocellular carcinoma (rs4516035 and rs2239186); and one in SMAD3 with worsening of fibrosis and encephalopathy (rs2118610). Only one polymorphism, rs1800469 in TGFB1, showed statistical significance with hepatic decompensation after Bonferroni’s correction (P<0.05/40). Conclusions: Our results demonstrated that low serum vitamin D has association with fibrosis progression in chronic hepatitis C genotype 1. Also, the eleven polymorphisms with tendency towards association indicate that genetic variants in vitamin D pathway possess weak or none relation with progression of chronic hepatitis C, deserving future analyses. Finally, polymorphism rs1800469 in TGFB1 demonstrated potential utility to help identify patients with higher odds of hepatic decompesantion.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-10T17:54:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-TamaraLima.pdf: 15100477 bytes, checksum: 79a87ae32652a2bd9c0dae960dc0a539 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-10T17:54:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-TamaraLima.pdf: 15100477 bytes, checksum: 79a87ae32652a2bd9c0dae960dc0a539 (MD5) Previous issue date: 2012-09-21 / Em eucariotos,a proteína de ligação à cauda poli-A (PABP) se liga especificamente a seqüência de poli-adenosinas na extremidade 3’ dos mRNAs, atuando em múltiplas funções associadas ao metabolismo destes, incluindo biogênese, processamento, transporte núcleo-citoplasmático e degradação. A PABP também participa na síntese proteíca, via interações diretas com fatores de tradução, como o fator de iniciação eIF4G, parceiro da proteína de ligação ao capeIF4E. O objetivo desta Tese foi dar continuidade a caracterização de três homólogos da PABP identificados em Leishmania sp.(PABPs1,2 e 3), protozoários patogênicos de características biológicas diferenciadas. Em estudos prévios estas proteínas se mostraram abundantes e de expressão simultânea e a PABP1 se mostrou representada por isoformas associadas a sua fosforilação. Neste trabalho, foi observado que as três proteínas possuem localização citoplasmática, porém sob condições de inibição da transcrição, mas não de tradução ou processamento de mRNAs, as PABPs 2 e 3 migram para o núcleo. Esse comportamento está de acordo com ensaios de interação proteína-proteina, onde foi observada uma associação direta entre as PABPs 2 e 3, independente de RNA. A expressão de isoformas fosforiladas da PABP1 foi então analisada e observou-se que esta era afetada pela inibição dos processos de síntese de mRNAs. Investigando sua participação no processo de tradução, foram confirmadas interações específicas entre a PABP1 e um homólogo de eIF4G in vivo e interações inéditas entre esta e homólogos de eIF4E. As três proteínas se mostraram capazes de se associar com os polissomas de células em fase de crescimento exponencial, mas não de fase estacionária. Ao longo do trabalho foram mapeadosmotivos envolvidos com as interações observadas identificando características novas não descritas. Por fim, ensaios de co-imuno precipitação seguido de análise protéica por espectrometria de massa e de RNAs por RT-PCR confirmaram a presença de parceiros protéicos diferenciados para cada homólogo e mRNAs alvo para as PABPs 2 e 3 cuja tradução está associada a fase S do ciclo celular. Nossos resultados mostram que estas proteínas apresentam funções divergentes e reforça um papel mais geral da PABP1 na tradução. / In eukaryotes, the poly-A binding protein (PABP) binds specifically to a poly-adenosines sequence present in the 3' end of the mRNAs where performes multiple functions associated with their metabolism, including biogenesis, processing, nucleocytoplasmic transport, and degradation. The PABP also participates in protein synthesis, via direct interactions with translation factors such as the initiation factor eIF4G, partner of the cap binding protein eIF4E. The aim of this Thesis was to continue the characterization of the three PABP homologues identified in Leishmaniasp. (PABPs 1, 2 and 3), a pathogenic protozoan with differentiated biological characteristics. Previous studies have shown that these proteins are abundant and simultaneously expressed and that PABP1 is characterized by multiples isoformes associated to phosphorylation. In this study, it was observed that all three proteins have cytoplasmic localization, but under transcription inhibition conditions but not translation or mRNAs processing, the PABPs 2 and 3 migrate to the nucleus. This behavior is in agreement with a protein-protein interaction observed between PABPs 2 and 3, and this interaction isindependent of RNA. The expression of the phosphorylated isoforms of PABP1 was also analyzed and it was found that some of those isoforms were affected by the inhibition of the processessing of mRNAs sinthesis. When investigated their participation in thetranslation process were observed specific interactions between PABP1 and a homolog of eIF4G in vivoand a novel interaction between PABP 1 and the homologues of eIF4E. Throughout this study the motifs involved in the interactios mentioned above were mapped and new motifs not yet described were observed. All three proteins have been shown to be associated with polysomes in cells in in exponential phase, but not in stationary phase. Finally, co-immunoprecipitation assays followed by protein analysis by mass spectrometry and of RNAs by RT-PCR confirmed the presence of different protein partners and mRNAs targets to the PABPs 2 and 3 whose translation is associated with the S phase of cell cycle. Our results show that these proteins have different functions and reinforces a more general role of PABP1 in translation.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Associação Fundo de Incentivo à Psicofarmacologia (AFIP) / O condicionamento de medo e um dos modelos animais de memoria emocional mais utilizados atualmente para se estudar mecanismos subjacentes aos processos mnemonicos. Neste modelo um pareamento de um estimulo neutro com um estimulo aversivo torna o primeiro preditor do segundo e, por sua vez, adquire caracteristicas aversivas tambem. Muitas evidencias tem mostrado uma participacao critica da amigdala nesse modelo, mais especificamente, seus nucleos lateral, basal e central. Na versao contextual do condicionamento de medo, no qual o ambiente e o estimulo neutro inicial, tem-se mostrado tambem um envolvimento do hipocampo, que geralmente esta envolvimento com memoria espacial. Recentes evidencias sugerem que, nesta tarefa, hipocampo e amigdala interagem, influenciando processos de plasticidade sinaptica um do outro, influenciando a expressao de genes de expressao imediata. Neste estudo, nos injetamos o antagonista do receptor NMDA, AP5, no hipocampo dorsal de ratos wistar logo antes do condicionamento de medo ao contexto. Apos o condicionamento, metade dos animais foi testada 48 horas depois e metade foi submetida a um processo de perfusao e processamento imunohistoquimico para CREB e pCREB. Nossos resultados mostraram que o condicionamento de medo o contexto aumenta a taxa de pCREB de maneira especifica ao aprendizado associativo, e que o bloqueio de receptores NMDA do hipocampo por AP5 nao so diminui o comportamento de medo dos animais como tambem diminui a taxa de pCREB nos nucleos lateral, basal e central da amigdala. Nossos resultados sugerem que a atividade dos receptores NMDA hipocampais influencia a inducao de plasticidade sinaptica na amigdala apos o condicionamento de medo ao contexto / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Rhipicephalus micropulus, conhecido como carrapato dos bovinos, é um dos parasitas mais importantes para a pecuária, pois causa enormes prejuízos ao produtor. Esses prejuízos se estendem desde a ação espoliativa que o carrapato exerce nos seus hospedeiros até a transmissão de uma diversidade de patógenos. Os carrapatos utilizam vários estímulos térmicos, sonoros, visuais, gustativos, táteis e olfativos na fase de busca pelo hospedeiro. Essas substâncias são conhecidas como semioquímicos e podem atuar em indivíduos de uma mesma espécie como os ferormônios ou entre indivíduos de espécies diferentes como os alomônios e cairomônios. Nos bovinos, já se sabe que uma de suas lipocalinas pode atrair insetos, porém não é sabido se essa atração ocorre para R. microplus. Já é sabido que o carrapato consegue distinguir odores liberados entre bovinos das raças Nelore e Holandês Preto e Branco (HPB), sendo mais atraído para bovinos da raça Holandês. A lipocalina por ser uma proteína globular e estar associada com o transporte de pequenas moléculas hidrofóbicas, tais como odorantes e esteroides, e pode favorecer a atração do R. microplus, uma vez que essa proteína bovina pode ligar a odorantes e desempenhar um papel fundamental na liberação de odores para o ambiente, que por sua vez pode atrair, ou não, o R. microplus. Existem diferentes níveis de infestação de carrapatos entre bovinos das raças Nelore e Holandês, bem como entre os sexos da mesma raça. Além disso, o período do ciclo de vida do bovino também pode influenciar na susceptibilidade a infestação, por exemplo, as vacas no período de lactação são consideradas mais susceptíveis ao parasito. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar o papel da lipocalina bovina na resistência e suscetibilidade ao carrapato, através da quantificação dessa proteína em líquidos corporais dos bovinos, tais como soro, saliva, urina, suor, secreção nasal e biopsia de pele obtidos de bovinos que apresentam fenótipos contrastantes de infestações, a saber: hospedeiros macho (touros) e fêmea (vacas em lactação) das raças resistentes (Bos indicus) e suscetíveis (Bos taurus). Os resultados deste trabalho tem demonstrado que a lipocalina bovina está presente em todos os fluídos investigados, exceto a urina, como observado por Western blot. Com os resultados deste trabalho podemos concluir que a bcOBP apresenta 9 diferença significativa nos fluidos de saliva e secreção nasal de touros e vacas em lactação da raça HPB quando comparados com touros e vacas em lactação da raça Nelore. Em amostras de biópsia de pele também ocorreu uma maior marcação da bcOBP na raça susceptível (HPB), demonstrando que a bcOBP possivelmente esta auxiliando na susceptibilidade destes bovinos ao carrapato, através do transporte de um maior número de odorantes que estariam atraindo um maior número de carrapatos. Ao analisar os fluidos entre bovinos da mesma raça, porém de sexo diferente, observou-se uma maior quantidade de bcOBP em vacas no período de lactação HPB nos fluidos de saliva e secreção nasal, visto que as vacas estão no período de lactação e são mais susceptíveis a infestações. Consequentemente, a bcOBP poderia estar colaborando para a sua maior susceptibilidade quando comparadas com touros HPB, e o mesmo ocorreu para biopsia de pele. Porém no fluído soro o aumento foi significativo para touro HPB quando comparado às vacas em lactação da raça HPB. Acredita-se que esse fenômeno ocorra devido ao período de lactação nas fêmeas uma vez que a produção da lipocalina bovina esta intimamente relacionada com a produção do leite. Os resultados deste trabalho demonstram que possivelmente a bcOBP na raça HPB está carreando odorantes para o ambiente os quais estariam atraindo mais carrapatos, e auxiliando na susceptibilidade destes bovinos. / Rhipicephalus micropulus, known as bovine tick, is one of the most important parasites for livestock, as they cause enormous damage to the producer. These demages extend from the spoliation action that the tick exerts on the skin of its hosts until the transmission of a diversity of pathogens. Ticks use various thermal, sound, visual, gustatory, tactile and olfactory stimuli in the search phase to the host. These substances are known as semiochemicals and can act within individuals of the same species as the pheromones or among individuals of different species such as alomones and cairomones. In the cattle, it is known that the lipocalin protein may attract insects, but this attraction is not known to influence the R. microplus. It is known that the tick can distinguish released odors between Nelore and Holstein cattle, being more attracted to cattle of the Holstein breed. Lipocalin, being a globular protein and associated with the transport of small hydrophobic molecules, such as odorants and steroids, can favor the attraction of R. microplus, since this bovine protein can bind to odorants and play a key role in the release of odors into the environment, which in turn may or may not attract R. microplus. There are different levels of tick infestation among cattle of the Nelore and Holstein breeds, as well as between the sexes of the same breed. In addition, the life cycle period of the bovine can also influence the susceptibility to infestation. For example, cows in the lactation period are considered more susceptible to the parasite. Thus, the objective of the present study was to evaluate the role of bovine lipocalin in the resistance and susceptibility to tick by quantifying that protein in bovine body fluids such as serum, saliva and urine, sweat, nasal secretions and skin biopsies obtained from resistant (Bos indicus) and susceptible (Bos taurus) cattle breeds. The results of this work have demonstrated that bovine lipocalin is present in all investigated fluids except urine, as observed by Western Blot. With the results of this work we can conclude that bcOBP presents a significant difference in fluids saliva and nasal secretion of bulls and cows in lactation breed HPB when compared to bulls and lactating cows of the Nelore breed. In skin biopsy specimens, there was also a greater labeling of bcOBP in the susceptible strain (HPB), which could then aid in the susceptibility of these cattle to the 11 tick, by transporting a larger number of odorants that would be attracting a greater number of ticks. When analyzing the fluids between bovines of the same breed, but of different sex, a greater amount of bcOBP was observed in cows during the period of HPB lactation in the fluids saliva and nasal secretion, since the cows are in the lactation period and are more susceptible to infestations. Consequently, bcOBP could be contributing to its greater susceptibility when compared to HPB bulls, and the same was done for skin biopsy. However, in the fluid serum, the increase was significant for the bull when compared to the lactating cows of the HPB race. It is believed that this phenomenon occurs due to the lactation period in females since the production of bovine lipocalin is closely related to milk production. The results of this work demonstrate that possibly Lipocalin in Holstein cattle is carrying odorants to the environment which would be attracting more ticks, and enhancing in the susceptibility of these cattle.

Ao nascerem os mamíferos não estão com o sistema nervoso plenamente desenvolvido e os primeiros dias de vida representam uma fase crítica para o desenvolvimento do sistema nervoso, de fato nesta fase o encéfalo esta passando por diversos processos fundamentais como organização funcional das redes neurais, proliferação neuronal, migração, diferenciação, além de gliogênese e mielinização. Em ratos, um procedimento simples, como “manipular” os filhotes por alguns minutos durante a primeira semana de vida, pode marcar decisivamente o desenvolvimento do indivíduo. Assim, a manipulação neonatal tem sido muito utilizada para se examinar os mecanismos pelos quais variações ambientais podem afetar o desenvolvimento do filhote. A manipulação neonatal promove uma série de alterações comportamentais e neuroendócrinas que se caracterizam basicamente por uma diminuição do medo no adulto. Além das mudanças neuroendócrinas já foram relatadas diversas alterações sobre a estrutura do sistema nervoso, como por exemplo, na densidade de células na área pré-óptica medial, na amígdala medial póstero-dorsal e no núcleo periventricular antero ventral, no córtex pré-frontal, núcleos amidalóides e no Locus coeruleus que apresenta papel decisivo durante o desenvolvimento. Sabe-se que o Locus coeruleus apresenta uma atuação muito importante no aprendizado olfatório, pois, apresenta uma via de conexão com o bulbo olfatório. O estímulo tátil realizado pela mãe (Lambida) atua sobre o locus coeruleus promovendo um aumento na liberação de noradrenalina no bulbo olfatório, que vai resultar na fosforilação do CREB (proteína de ligação ao elemento responsivo ao AMPc), que por sua vez promove a transcrição de vários genes como o de BDNF (Fator Neurotrófico Derivado do Encéfalo). Como foi demonstrado que a manipulação pode atuar na estrutura do Locus coeruleus e também pode alterar o comportamento maternal isso provoca profundas mudanças na via noradrenérgica e o bulbo como sendo uma de suas áreas de eferência também estaria sujeito a essa modificações. A manipulação neonatal poderia alterar o comportamento maternal, modificando o padrão de lambida da mãe nos filhotes, comprometendo o aporte de noradrenalina no bulbo e por sua vez alterando os níveis de pCREB (proteína de ligação ao elemento responsivo ao AMPc fosforilada) e BDNF no bulbo olfatório O BDNF atua em diversos processos durante o desenvolvimento do sistema nervoso, sendo que alterações na sinalização desse fator poderia ser a causa de modificações estruturais e comportamentais encontradas para a manipulação neonatal. Portanto, nesta dissertação avaliamos o efeito da manipulação neonatal sobre a fosforilação da CREB usando uma abordagem diferente daquela utilizada por Raineki et al (2009) e também analisar o efeito da manipulação do sinal de BDNF no bulbo olfatório de ratos no dia 7 pós-natal com o intuito de verificar se as alterações na fosforilação do CREB se traduzem em alterações nos níveis de proteínas (BDNF e seu pré-cursor o pro-BDNF). Os resultados dessa dissertação mostram que manipulação neonatal tanto única como repetida foi capaz de promover alterações bioquímicas no bulbo olfatório de filhotes no dia 7 pós-natal. Além disso, as modificações encontradas nos níveis de pCREB e BDNF em resposta a manipulação sugerem que este protocolo promova alterações duradouras nos níveis de BDNF. Essas mudanças poderiam ser responsáveis por alterações estruturais estáveis no bulbo olfatório desses animais, como já relatados para muitas outras áreas do encéfalo. Sendo que essas alterações na estrutura cerebral poderiam ser a causa de diversos distúrbios psiquiátricos encontrados na vida adulta.