A ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) faz parte da família das α-amilases e se destaca por ser a única enzima capaz de produzir ciclodextrinas (CDs). Esses oligossacarídeos cíclicos possuem a capacidade de formar complexos de inclusão com uma variedade de moléculas, alterando suas características como, por exemplo, solubilidade, volatilidade e estabilidade. Desta forma, CDs tem encontrado aplicação nas mais diversas áreas. Na indústria de alimentos, se destacam por serem potenciais estabilizantes naturais. Buscando alternativas viáveis para produção destas ciclodextrinas, neste trabalho, a enzima CGTase foi imobilizada covalentemente em esferas de quitosana e posteriormente utilizada em um reator enzimático para uso contínuo. O rendimento da imobilização foi de aproximadamente 100 %, com uma carga de 20 mg de enzima por grama de suporte seco. O processo de imobilização foi capaz de manter o comportamento da enzima frente à variação de pH e temperatura de reação, apresentando pH ótimo em 5,0 e a faixa de temperatura ótima de 70 a 95 ºC, para ambos. A estabilidade conferida ao catalisador imobilizado possibilitou sua reutilização, 61 % da sua atividade inicial foi mantida após 100 ciclos de reação. Durante utilização contínua, realizada em um reator de leito fixo, analisou-se a influência da taxa de fluxo e da concentração do substrato na geração de β-CD. A máxima produção (1,32 g / L) foi alcançada utilizando-se 4 % de amido solúvel em uma taxa de fluxo de 3 mL / min. Além disso, o biocatalisador apresentou uma ótima estabilidade operacional a 60 °C, mantendo 100 % da atividade inicial após 100 h de uso contínuo. Estes resultados demonstram que o desempenho do reator é diretamente afetado pelos parâmetros analisados e que a produção pode ser otimizada por regulação simples na velocidade de fluxo, ou pela concentração do substrato; e sugerem a possibilidade de utilizar este biocatalisador imobilizado na produção contínua de CDs. / Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) is member of the family α-amylase and is known for being the only enzyme able to produce cyclodextrins (CDs). These cyclic oligosaccharides have the ability to form inclusion complexes with a variety of molecules, changing its characteristics, for example, solubility, volatility and stability. Therefore, CDs have found application in several fields. In the food industry stand out for being potential natural stabilizers. Seeking to alternatives for producing these cyclodextrins, in this work, the CGTase enzyme was immobilized covalently on chitosan beads and subsequently used in enzymatic reactor for continuous use. The immobilization yield was high, reaching about 100 %, representing a load of 20 mg enzyme per gram of dry support. The immobilization process was capable of maintaining the behavior of the enzyme to the variation of pH and temperature of reaction, with pH optimum at 5.0 and the optimal temperature range of 70 - 95 ° C, for both. The stability afforded to the immobilized catalyst made possible its reuse, maintaining 61 % of its initial activity after 100 cycles of reaction. During its continuous use, in a packed bed reactor, we analyzed the influence of flow rate and concentration of the substrate in the generation of β-CD. The maximum yield (1.32 g / L) was achieved using 4 % soluble starch at a flow rate of 3 mL / min. In addition, the biocatalyst showed a great operational stability at 60 ° C, maintaining 100 % of initial activity after 100 h of continuous use. These results demonstrate that the performance is directly affected by the parameters analyzed and that the production can be optimized by simple adjustment in flow rate through the reactor, or the substrate concentration used and suggests the possibility of using this biocatalyst immobilized to the continuous production of CDs.

A ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) faz parte da família das α-amilases e se destaca por ser a única enzima capaz de produzir ciclodextrinas (CDs). Esses oligossacarídeos cíclicos possuem a capacidade de formar complexos de inclusão com uma variedade de moléculas, alterando suas características como, por exemplo, solubilidade, volatilidade e estabilidade. Desta forma, CDs tem encontrado aplicação nas mais diversas áreas. Na indústria de alimentos, se destacam por serem potenciais estabilizantes naturais. Buscando alternativas viáveis para produção destas ciclodextrinas, neste trabalho, a enzima CGTase foi imobilizada covalentemente em esferas de quitosana e posteriormente utilizada em um reator enzimático para uso contínuo. O rendimento da imobilização foi de aproximadamente 100 %, com uma carga de 20 mg de enzima por grama de suporte seco. O processo de imobilização foi capaz de manter o comportamento da enzima frente à variação de pH e temperatura de reação, apresentando pH ótimo em 5,0 e a faixa de temperatura ótima de 70 a 95 ºC, para ambos. A estabilidade conferida ao catalisador imobilizado possibilitou sua reutilização, 61 % da sua atividade inicial foi mantida após 100 ciclos de reação. Durante utilização contínua, realizada em um reator de leito fixo, analisou-se a influência da taxa de fluxo e da concentração do substrato na geração de β-CD. A máxima produção (1,32 g / L) foi alcançada utilizando-se 4 % de amido solúvel em uma taxa de fluxo de 3 mL / min. Além disso, o biocatalisador apresentou uma ótima estabilidade operacional a 60 °C, mantendo 100 % da atividade inicial após 100 h de uso contínuo. Estes resultados demonstram que o desempenho do reator é diretamente afetado pelos parâmetros analisados e que a produção pode ser otimizada por regulação simples na velocidade de fluxo, ou pela concentração do substrato; e sugerem a possibilidade de utilizar este biocatalisador imobilizado na produção contínua de CDs. / Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) is member of the family α-amylase and is known for being the only enzyme able to produce cyclodextrins (CDs). These cyclic oligosaccharides have the ability to form inclusion complexes with a variety of molecules, changing its characteristics, for example, solubility, volatility and stability. Therefore, CDs have found application in several fields. In the food industry stand out for being potential natural stabilizers. Seeking to alternatives for producing these cyclodextrins, in this work, the CGTase enzyme was immobilized covalently on chitosan beads and subsequently used in enzymatic reactor for continuous use. The immobilization yield was high, reaching about 100 %, representing a load of 20 mg enzyme per gram of dry support. The immobilization process was capable of maintaining the behavior of the enzyme to the variation of pH and temperature of reaction, with pH optimum at 5.0 and the optimal temperature range of 70 - 95 ° C, for both. The stability afforded to the immobilized catalyst made possible its reuse, maintaining 61 % of its initial activity after 100 cycles of reaction. During its continuous use, in a packed bed reactor, we analyzed the influence of flow rate and concentration of the substrate in the generation of β-CD. The maximum yield (1.32 g / L) was achieved using 4 % soluble starch at a flow rate of 3 mL / min. In addition, the biocatalyst showed a great operational stability at 60 ° C, maintaining 100 % of initial activity after 100 h of continuous use. These results demonstrate that the performance is directly affected by the parameters analyzed and that the production can be optimized by simple adjustment in flow rate through the reactor, or the substrate concentration used and suggests the possibility of using this biocatalyst immobilized to the continuous production of CDs.

A ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) faz parte da família das α-amilases e se destaca por ser a única enzima capaz de produzir ciclodextrinas (CDs). Esses oligossacarídeos cíclicos possuem a capacidade de formar complexos de inclusão com uma variedade de moléculas, alterando suas características como, por exemplo, solubilidade, volatilidade e estabilidade. Desta forma, CDs tem encontrado aplicação nas mais diversas áreas. Na indústria de alimentos, se destacam por serem potenciais estabilizantes naturais. Buscando alternativas viáveis para produção destas ciclodextrinas, neste trabalho, a enzima CGTase foi imobilizada covalentemente em esferas de quitosana e posteriormente utilizada em um reator enzimático para uso contínuo. O rendimento da imobilização foi de aproximadamente 100 %, com uma carga de 20 mg de enzima por grama de suporte seco. O processo de imobilização foi capaz de manter o comportamento da enzima frente à variação de pH e temperatura de reação, apresentando pH ótimo em 5,0 e a faixa de temperatura ótima de 70 a 95 ºC, para ambos. A estabilidade conferida ao catalisador imobilizado possibilitou sua reutilização, 61 % da sua atividade inicial foi mantida após 100 ciclos de reação. Durante utilização contínua, realizada em um reator de leito fixo, analisou-se a influência da taxa de fluxo e da concentração do substrato na geração de β-CD. A máxima produção (1,32 g / L) foi alcançada utilizando-se 4 % de amido solúvel em uma taxa de fluxo de 3 mL / min. Além disso, o biocatalisador apresentou uma ótima estabilidade operacional a 60 °C, mantendo 100 % da atividade inicial após 100 h de uso contínuo. Estes resultados demonstram que o desempenho do reator é diretamente afetado pelos parâmetros analisados e que a produção pode ser otimizada por regulação simples na velocidade de fluxo, ou pela concentração do substrato; e sugerem a possibilidade de utilizar este biocatalisador imobilizado na produção contínua de CDs. / Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) is member of the family α-amylase and is known for being the only enzyme able to produce cyclodextrins (CDs). These cyclic oligosaccharides have the ability to form inclusion complexes with a variety of molecules, changing its characteristics, for example, solubility, volatility and stability. Therefore, CDs have found application in several fields. In the food industry stand out for being potential natural stabilizers. Seeking to alternatives for producing these cyclodextrins, in this work, the CGTase enzyme was immobilized covalently on chitosan beads and subsequently used in enzymatic reactor for continuous use. The immobilization yield was high, reaching about 100 %, representing a load of 20 mg enzyme per gram of dry support. The immobilization process was capable of maintaining the behavior of the enzyme to the variation of pH and temperature of reaction, with pH optimum at 5.0 and the optimal temperature range of 70 - 95 ° C, for both. The stability afforded to the immobilized catalyst made possible its reuse, maintaining 61 % of its initial activity after 100 cycles of reaction. During its continuous use, in a packed bed reactor, we analyzed the influence of flow rate and concentration of the substrate in the generation of β-CD. The maximum yield (1.32 g / L) was achieved using 4 % soluble starch at a flow rate of 3 mL / min. In addition, the biocatalyst showed a great operational stability at 60 ° C, maintaining 100 % of initial activity after 100 h of continuous use. These results demonstrate that the performance is directly affected by the parameters analyzed and that the production can be optimized by simple adjustment in flow rate through the reactor, or the substrate concentration used and suggests the possibility of using this biocatalyst immobilized to the continuous production of CDs.

Orientador: Helia Harumi Sato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-12T20:00:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Contesini_FabianoJares_M.pdf: 1094439 bytes, checksum: 9f9e34abfc4a94978b97e21b2b7168c1 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A isomaltulose é um dissacarídeo redutor, isômero da sacarose, com propriedades interessantes para a indústria de alimentos. Este açúcar apresenta propriedades similares às da sacarose, entretanto, apresenta baixo potencial cariogênico e baixo índice glicêmico. A isomaltulose é produzida industrialmente através da conversão enzimática da sacarose pela enzima glicosiltransferase produzida por certas linhagens de bactérias, como Protoaminobacter rubrum e Erwinia rhapontici. Este trabalho teve por objetivo purificar e caracterizar a glicosiltransferase produzida pela Erwinia sp. D12 e imobilizar a glicosiltransferase bruta em Celite e pectina de baixo teor de metoxilas (BTM). A glicosiltransferase foi purificada por cromatografia em coluna de troca catiônica SP-Sepharose Fast Flow, obtendo-se duas frações com atividade de glicosiltransferase. A enzima da fração n° 17 foi purificada cerca de 17,9 vezes, e a massa molecular foi estimada em 65 kDa, por SDS-PAGE. A glicosiltransferase bruta e as frações purificadas apresentaram atividade ótima em pH de 6,0 a 6,5 e em temperatura de 30 a 35°C e estabilidade na faixa de pH de 5,0 a 7,0 e em temperaturas inferiores a 30°C, sendo que as frações purificadas apresentaram menor estabilidade. As condições ótimas de imobilização da glicosiltransferase bruta em Celite foram pH 4,0 para adsorção da enzima no suporte, e quantidade de enzima de 1700 U. A glicosiltransferase bruta imobilizada em Celite, em processo de batelada e em coluna de leito empacotado, converteu cerca de 50% de sacarose em isomaltulose, porém a conversão diminuiu com o tempo. O tratamento da glicosiltransferase imobilizada em Celite com 0,1% de glutaraldeído não resultou em aumento da retenção e estabilidade da enzima. A glicosiltransferase imobilizada em gel de pectina BTM com adição de gordura manteve maior atividade de glicosiltransferase que as preparações de enzima imobilizada sem gordura e liofilizadas. Quando essa preparação foi aplicada em processo de batelada foi observada conversão inicial em torno de 30% com queda gradativa nas posteriores bateladas. Em colunas de leito empacotado foi observada conversão de sacarose em isomaltulose máxima de 10,5% em 2 horas, sendo que após 60 horas foi igual a 3% / Abstract: Isomaltulose is a reducing disaccharide and an isomer of sucrose. Because of its properties it is interesting for application in the food industry. This sugar shows similar properties to sucrose, but it has low cariogenic potential and low glycemic index. Industrially, isomaltulose is produced by conversion of sucrose using glucosyltransferase. This enzyme is produced by few bacterial strains such as Protoaminobacter rubrum and Erwinia rhapontici. The aims of this research were the purification and characterization of glucosyltransferase produced by Erwinia sp. D12 and the immobilization of the crude enzyme in Celite and low-metoxyl pectin. The glucosyltransferase was purified using cationic exchange column of SPSepharose Fast Flow and it was obtained two fractions with glucosyltransferase activity. The enzyme found in 17th fraction was purified 17.9-fold, and showed a molecular mass of 65 kDa, by SDS-PAGE. The crude glucosyltransferase and the purified fractions showed optimum activity in pH of 6.0 ¿ 6.5 and 30 ¿ 35°C and stability in pH 5.0 to 7.0 and under 30°C, and the purified preparation was less stable than the crude enzyme. The optimum condition of the immobilization of crude glucosyltransferase was using pH 4.0 for the adsorption of the enzyme into the support, and amount of enzyme of 1700 U. The glucosyltransferase immobilized on Celite was applied to the conversion of sucrose into isomaltulose in a batch system and packed-bed reactor. A conversion rate of 50% was observed, but this decreased over a period of hours. The treatment of the immobilized glucosyltransferase on Celite, with 0.1% glutharaldehyde did not increase the stability of the enzyme. The immobilization of crude glucosyltransferase in lowmetoxyl pectin with a fat addition, presented a higher activity when compared to microcapsules without fat or freeze dried. When this preparation was applied to the conversion of sucrose into isomaltulose, in a batch system, it was observed an initial conversion rate of 30%. However this value decreased in further batches. In the packed-bed reactors, the highest conversion value of sucrose to isomaltulose was 10.5% in 2 hours, but after 60 hours the conversion was 3% / Mestrado / Bioquimica de Alimentos / Mestre em Engenharia de Alimentos

Orientador : Helia Harumi Sato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-08T02:25:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kawaguti_HaroldoYukio_D.pdf: 24058276 bytes, checksum: a6cb1016d8d9d61e1418acf5a2867097 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A isomaltulose é um dissacarídeo redutor, isômero da sacarose, que possui um sabor adocicado suave e propriedades físicas e sensoriais muito similares, que tem sido considerado um substituto promissor da sacarose na indústria de alimentos, devido a algumas características como baixo potencial cariogênico e baixo índice glicêmico, promoção do crescimento de bifidobactérias benéficas da microbiota intestinal, e por apresentar maior estabilidade em relação à sacarose em alimentos e bebidas acidificados, além de poder ser convertido para isomalte, um açúcar álcool dietético e não cariogênico aplicado na indústria de alimentos e farmacêutica. Os objetivos deste trabalho foram otimizar um meio de cultivo, de menor custo, para a produção da enzima glicosiltransferase pela linhagem Erwinia sp. D12 e estudar a produção de isomaltulose a partir de sacarose utilizando-se células livres e células imobilizadas em alginato de cálcio. Na otimização do meio de cultivo, em frascos sob agitação, a máxima atividade obtida foi de 12,4 UA de glicosiltransferase/mL de meio de cultivo após 8 horas de fermentação a 30ºC, em meio composto de 150 g/L de melaço de cana-de-açúcar, 20 g/L de água de maceração de milho- Milhocina®, 15 g/L de extrato de levedura Prodex Lac SDÒ, e pH ajustado a 7,5. No estudo da produção de glicosiltransferase, em fermentador de 6,6 litros, utilizando-se o meio de cultivo otimizado foi obtida máxima atividade de 22,5 UA de glicosiltransferase/mL de meio de cultivo, após 8 horas de fermentação a 27oC. No estudo da produção de isomaltulose por células íntegras imobilizadas de Erwinia sp. D12 em alginato de cálcio foi verificado que o tratamento dos grânulos de células imobilizadas com 0,06% de glutaraldeído, promoveu uma maior taxa de conversão, sendo obtido cerca de 72,3% de isomaltulose, após 12 horas de incubação em frascos sob agitação a 30ºC. As células íntegras imobilizadas e tratadas com 0,06% de glutaraldeído, em colunas de leito empacotado, apresentaram maior estabilidade do que àquelas imobilizadas sem tratamento com o aditivo, e mantiveram a conversão de sacarose em isomaltulose entre 50-60% por 10 dias, a partir de solução de sacarose 35% e fluxo de 0,56 mL/min a 30ºC. Foram estudados diferentes tratamentos para a preparação de células íntegras, células lisadas e extrato enzimático bruto imobilizados em alginato de cálcio. Os métodos que mostraram melhores resultados, em processo em batelada, foi o extrato enzimático bruto imobilizado em alginato de cálcio (EEI), em que foram obtidas taxas de conversão entre 59,7% e 63,3%; e células lisadas por sonicação e imobilizadas (CSI), com taxas de conversão entre 47,6% e 62,3%. A coluna de leito empacotado contendo grânulos de células lisadas imobilizadas (CSI) apresentou maior estabilidade do que a coluna contendo os grânulos de extrato enzimático bruto imobilizado (EEI). A coluna de leito empacotado de CSI converteu 53-59% de sacarose em isomaltulose durante sete dias, posteriormente houve queda lenta e gradual da conversão não havendo mais transformação em isomaltulose após 21 dias. No estudo da produção de isomaltulose utilizando-se células livres de Erwinia sp. D12, em processo em batelada, foi verificado o efeito do pH, da temperatura, da concentração do substrato sacarose e da concentração de massa celular em frascos agitados a 150 rpm e 30ºC. A conversão de sacarose em isomaltulose foi favorecida utilizando-se temperaturas superiores a 30ºC, pH entre 6,0-6,5, massa celular entre 7,5- 12,5% e solução de sacarose de 20-35%, obtendo-se rendimentos de isomaltulose acima de 50%. No estudo da vida útil das células livres em escala de bancada, utilizando-se frascos Erlenmeyers sob agitação, foi verificado que os parâmetros de conversão fixados a: temperatura de 35ºC, pH 6,5, concentração de substrato sacarose 35% e concentração de massa celular 10% foram os mais favoráveis, promovendo um alto rendimento em isomaltulose entre 70-75%, por 16 bateladas. Os ensaios realizados em escala piloto demonstraram a viabilidade da conversão de sacarose em isomaltulose por células livres, em que foram obtidos cerca de 114 litros de xarope com alto teor de isomaltulose (63,40%). Os cristais de isomaltulose, após clarificação e purificação do xarope convertido, apresentaram pureza de 96,5% / Abstract: Isomaltulose is a reducing disaccharide and a structural isomer of sucrose. It has a mild sweet flavour and very similar physical and sensorial properties and has been considered as a promising substitute for sucrose in the food industry, due to some of its characteristics such as a low cariogenic potential and low glycemic index and the promotion of beneficial bifid bacteria in the intestinal microbial flora. It also shows greater stability than sucrose in acidified foods and drinks, and can be converted into isomalt, a dietetic sugar alcohol with no cariogenic potential for use in the food and pharmaceutical industries. The objectives of this research were the optimisation of a culture medium with reduced costs for the production of the enzyme glucosyltransferase by the strain Erwinia sp. D12, and the study of isomaltulose production from sucrose by free and immobilized cells. In the optimisation of the culture medium in shaken flasks, the highest glucosyltransferase activity achieved was 12.4 UA/mL of culture medium after 8 hours of fermentation at 30ºC, in a medium composed of 150 g/L of sugar cane molasses, 20 g/L of corn steep liquor- Milhocina® and 15 g/L of yeast extract Prodex Lac SD®, with the pH adjusted to 7.5. In the study for glucosyltransferase production in a 6.6-liter reactor using the optimised culture medium, the highest glucosyltransferase production achieved was 22.5 UA/mL of culture medium, after 8 hours of fermentation at 27ºC. In the study for isomaltulose production using Erwinia sp. D12 cells immobilized in calcium alginate, it was shown that the addition of 0.06% glutaraldehyde during the immobilization process, promoted a higher conversion rate, reaching about 72.3% isomaltulose after 12 hours of incubation at 30°C in shaken flasks. The immobilized whole cells treated with 0.06% glutaraldehyde, used in packed-bed reactors, presented greater stability than those immobilized without the addition of the additive, and maintained the conversion of sucrose into isomaltulose between 50-60% for 10 days, using a 35% sucrose solution with a flow rate of 0.56 mL/min at 30ºC. Different treatments were studied for the preparation of whole cells, lysed cells and a crude enzyme extract immobilized in calcium alginate. The methods that showed the best results in batch processes were the crude enzyme extract immobilized in calcium alginate (EEI), where conversion rates between 59.7% and 63.3% were achieved; and immobilized lysed cells (CSI), with conversion rates between 47.6% and 62.3%. The packed bed column containing granules of immobilized lysed cells (CSI) presented greater stability than that containing granules of immobilized crude enzymatic extract (EEI). The packed bed column with CSI converted 53-59% of sucrose into isomaltulose during seven days, and then showed a gradual decline in conversion, ceasing completely after 21 days. In the study of isomaltulose production using free Erwinia sp. D12 cells in a batch process, the effects of pH, temperature, sucrose substrate concentration and cell mass concentration were determined in shaken flasks at 150 rpm and 30ºC. The following conditions favoured the conversion of sucrose into isomaltulose: temperatures above 30ºC, pH between 6.0-6.5, cell mass between 7.5-12.5% and a sucrose concentration between 20-35%; when isomaltulose yields above 50% were obtained. The half-life of the free cells was studied on a bench scale in shaken Erlenmeyers flasks and it was shown that the following fixed conversion parameters were the most favourable: temperature of 35ºC, pH 6.5, 35% sucrose substrate concentration and 10% cell mass concentration; promoting high isomaltulose yields between 70-75%, for 16 batches. The pilot scale assays demonstrated the viability of the conversion of sucrose into isomaltulose by free cells, obtaining about 114 liters of high isomaltulose syrup (63.40%). The isomaltulose crystals, after clarification and purification of the converted syrup, showed a purity of 96.5% / Doutorado / Mestre em Ciência de Alimentos

A parede celular de plantas é formada basicamente por celulose, hemicelulose e lignina. A formação dos polímeros de hemicelulose depende do suprimento de precursores chamados de açúcares-nucleotídeos. A biossíntese das diferentes estruturas de hemicelulose da parede celular envolve a participação de enzimas pertencentes às famílias das glicosiltransferases (GTs). Estudos feitos em Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon, Oryza sativa (arroz) e Zea mays (milho) auxiliaram na descoberta de 11 enzimas da via de interconversão nucleotídeo-açúcar e de enzimas da família das glicosiltransferases (GTs), como as GT2, GT8, GT43, GT47, GT61 e GT75, envolvidas na biossíntese de hemicelulose. O presente trabalho visa a identificação de genes da via de biossíntese de hemicelulose da parede celular de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) e análise filogenética entre Arabidopsis thaliana (planta modelo de eudicotiledôneas), Oryza sativa, Brachypodium distachyon, Zea mays, Sorghum bicolor e Saccharum spp. Foram identificados os genes das famílias GT2, GT8, GT43, GT47, GT61, GT75, CSL, Epimerase e UDPG em cana-de-açúcar a partir da busca em sete bibliotecas de RNA-Seq utilizando as sequências de O. sativa, Z. mays e S. bicolor como referência. Os domínios específicos de cada família gênica foram confirmados através do programa PFAM e consequentemente anotados. A identificação e anotação das sequencias possibilitou a construção de bancos de sequências das famílias envolvidas na biossíntese de hemicelulose para as espécies A. thaliana, B. distachyon, O. sativa, Z. mays e S. bicolor. Foram identificadas para cada espécie, respectivamente, um total de 67, 49, 49, 60 e 56 genes bona fides. O presente trabalho, além da identificação de genes nas diferentes espécies, permitiu a identificação e seleção de 27 genes candidatos envolvidos na biossíntese de hemicelulose em cana-de-açúcar e possivelmente envolvidos na recalcitrância da parede celular nas diferentes bibliotecas de RNA-Seq de cana-de-açúcar. / The plant cell wall is mainly composed of cellulose, hemicellulose and lignin. The formation of hemicellulose polymers lies on the supply of the so-called sugar-nucleotide precursors. The diverse hemicellulose structures biosynthesis of cell wall involves the participation of enzymes belonging to the families of glycosyltransferases (GTs). Studies in Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon, Oryza sativa (rice) and Zea mays (corn) aid the discovery of 11 enzymes of the nucleotide sugar interconversion pathway and enzymes of the GT family, as GT2, GT8, GT43, GT47, GT61 e GT75, involved in the hemicelluloses biosynthesis. This study aims to the identification of hemicellulose biosynthesis pathway genes from the cell wall of sugarcane (Saccharum spp.) and phylogenetic analysis of Arabidopsis thaliana (eudicotyledonous plant model), Oryza sativa, Brachypodium distachyon, Zea mays, Sorghum bicolor and Saccharum spp. The genes of the GT2, GT8, GT 43, GT47, GT61, GT75, CSL, epimerase and UDPG families were identified in sugarcane from a search in seven RNA-Seq libraries using the sequences of O. sativa, Z. mays and S. bicolor as reference. The specific domains of each gene family have been confirmed through the PFAM program and consequently noted. The identification and annotation of the sequences enabled the construction of sequences banks of the families involved in hemicellulose biosynthesis in the species A. thaliana, B. distachyon, O. sativa, Z. mays and S. bicolor. It was identified for each species, respectively, a total of 67, 49, 49, 60 and 56 bona fides genes. This work, in addition to the identification of genes in different species, allowed the identification and selection of 27 candidate genes involved in the biosynthesis of hemicelluloses in sugarcane and possibly involved in cell wall recalcitrance in the different sugarcane RNA-Seq libraries.

Produtos naturais constituem uma das principais fontes de moléculas bioativas que possuem diversas aplicabilidades. Dentre os produtos naturais, policetídeos representam uma ampla classe de compostos estruturalmente diversos cuja atividade biológica, muitas vezes está relacionada com os grupos funcionais que estão ligados ao seu esqueleto central (aglicona). Os macrolídeos representam uma classe de antibiótico amplamente utilizado e são um exemplo de policetídeos cuja atividade é dependente de moléculas de açúcares. As enzimas que realizam a glicosilação de policetídeos são as glicosiltransferases, as quais apresentam uma especificidade estrita para 6-desoxiaçúcares, porém uma especificidade relaxada para açúcares não usuais e substratos aceptores. Estudar essa flexibilidade catalítica das glicosiltransferases de produtos naturais pode contribuir para a geração de novos compostos através de glicodiversificação. Esses novos compostos podem apresentar novas atividades biológicas e propriedades farmacocinéticas melhoradas. Além da especificidade relaxada, existe um pequeno grupo de glicosiltransferases que possui um comportamento peculiar no qual uma proteína auxiliar é necessária para sua atividade catalítica, por exemplo o par TylM2/TylM3 envolvidos na biossíntese do antibiótico macrolídeo tilosina em Strepromyces fradiae. Estudar a interação e as mudanças conformacionais que ocorrem durante a formação do complexo glicosiltransferase-proteína auxiliar é fundamental para entender a influência que essas as proteínas auxiliares exercem sobre as glicosiltransferases, e com isso gerar informações que possam ser úteis na aplicação de glicodiversificação. Neste trabalho foi realizado a sublonagem de genes sintéticos que codificam a glicosiltransferase TylM2 e a proteína auxiliar TylM3 e as proteínas recombinantes foram produzidas e purificadas. Além disso foram realizadas técnicas de caracterização estrutural para proteína TylM2 no qual essa glicosiltransferase parece formar um tetrâmero em solução na ausência de sua proteína auxiliar. Ensaios de cristalização com TylM2 rendeu cristais que difratam a uma resolução abaixo de 3,0Å, mesmo após tentativas de otimização, que dificultam a determinação de sua estrutura A criação de modelos teóricos por modelagem comparativa para TylM2 e TylM3 permitiu uma investigação sobre possíveis diferenças entre a TylM2 e suas homólogas. / Natural products compose one of the main sources of bioactive molecules that have several applications. Amongst natural products, polyketides represent a broad class of structurally diverse compounds whose biological activity is often related to the functional groups that are linked to their central skeleton (aglycone). Macrolides represent a class of widely used antibiotic and are an example of polyketides whose activity is dependent on sugar molecules. The enzymes that perform the glycosylation of polyketides are glycosyltransferases, which have a strict specificity for 6-deoxy sugars, but a relaxed specificity for unusual sugars and acceptor substrates. Studying this catalytic flexibility of glycosyltransferases of natural products may contribute to the generation of novel compounds through glycodiversification. These novel compounds may exhibit new biological activities and improved pharmacokinetic properties. In addition to the relaxed specificity, there is a small group of glycosyltransferases who have a peculiar behavior in which an auxiliary protein is required for its catalytic activity, an example of such is the TylM2 / TylM3 pair involved in the biosynthesis of the macrolide antibiotic tylosin in Strepromyces fradiae. Studying the interaction and conformational changes that occur during the formation of the glycosyltransferase-auxiliary protein complex is critical to understanding the influence that these auxiliary proteins have on glycosyltransferases, and thereby generate information that may be useful in the application of glycodiversification. In this work, synthetic genes coding the glycosyltransferase TylM2 and the auxiliary protein TylM3 was sub cloned into pET28a vectors and the recombinant proteins were produced and purified. In addition, structural characterization techniques were performed with TylM2 which appears to form a tetramer in solution in the absence of its auxiliary protein. Crystallization assays of TylM2 yielded crystals that diffracted bellow 3.0Å and presented pathologies which prevented determining of its structure, even after attempts of optimization. The creation of theoretical models by homology modelling for TylM2 and TylM3 allowed for an investigation into possible differences that make TylM2 possess a more stringent flexibility toward acceptor substrates when compared to other homologues.

A ciclodextrina glicosiltransferase (EC 2.4.1.19) é a única enzima capaz de converter amido e açúcares relacionados em ciclodextrinas através de reação de ciclização. Estes compostos podem formar complexos de inclusão com moléculas hidrofóbicas, tornando-se importante para aplicação nas indústrias alimentícias, farmacêuticas, agrícolas, químicas e de cosméticos. Um novo microorganismo produtor de CGTase foi encontrado entre bactérias isoladas do solo e foi identificado como Stenotrophomonas maltophilia. A enzima produzida por este microrganismo foi purificada em quatro etapas: precipitação por afinidade com amido, ultrafiltração, cromatografia de troca iônica e cromatografia de interação hidrofóbica. A CGTase assim purificada obteve, aproximadamente, atividade específica de 200.000 U/mg e fator de purificação de 2500. Com uma única banda, o peso molecular da enzima purificada foi estimado em 70kDa por SDS-PAGE. A temperatura ótima para atividade da enzima foi de 60 º C, enquanto que a atividade enzimática permaneceu praticamente estável entre pH 6 e 10, indicando natureza alcalotolerante. Km e Vmax para a enzima pura foram de 2,5 g/mL e 12,5 U/mg de proteína, respectivamente, usando amido solúvel como substrato. / Cyclodextrin glycosyltransferase (EC 2.4.1.19) is the unique enzyme able to convert starch and related sugars into cyclodextrins via cyclization reaction. These compounds can form inclusion complexes with hydrophobic molecules, becoming important for application in the food, pharmaceutical, agricultural, chemical and cosmetics industries. A new microorganism producing the CGTase was found among strains isolated from soil and identified as Stenotrophomonas maltophilia. The enzyme produced by this strain was purified by four steps: starch affinity precipitation, ultrafiltration, ion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography. The CGTase thus obtaining specific activity 200,000 U.mg-1 and 2500-fold purification. With a single band, the molecular weight of the purified enzyme was estimated in 70kDa by SDS-PAGE. The optimum temperature for enzyme activity was 60ºC, whereas the enzyme activity remained almost stable between pH 6 to 10, indicating its alkalotolerant nature. Km e Vmax for the pure enzyme were 2.5 g/mL and 12.5 U/mg protein, respectively, using soluble starch as substrate.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-04-08Bitstream added on 2014-06-13T19:40:50Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_ds_dr_sjrp.pdf: 1933738 bytes, checksum: baca389347279bb3f5a0eea7681d038d (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O desenvolvimento da tecnologia de pães é um fenômeno de grande impacto na indústria de alimentos. Ao longo dos anos vários aditivos foram incorporados à tecnologia de panificação, elevando a qualidade destes produtos e fazendo crescer a sua aceitação pela população em geral. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos sobre a qualidade do pão e sobre o processo de envelhecimento, da adição de enzimas na massa. As enzimas usadas foram xilanase produzida pelo fungo Thermoascus aurantiacus CBMAI 756 nas concentrações de 20, 35 e 50U/100 g de farinha de trigo e/ou da ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) produzida pela bactéria Bacillus clausii E16 nas concentrações de 15 e 30U/100 g de farinha de trigo, parcialmente purificadas. O mecanismo de ação dessas enzimas sobre os seus respectivos substratos arabinoxilana e amido, respectivamente, também foram avaliadas. Os pães adicionados de xilanase, CGTase e xilanase/CGTase foram produzidos em três etapas distintas. Para o estudo do envelhecimento os pães foram mantidos a temperatura de 4ºC durante 10 dias, e foram avaliados quanto à perda de água, a textura e a retrogradação da amilopectina. Os produtos obtidos pela ação da xilanase e CGTase sobre as arabinoxilanas e o amido, respectivamente, isolados da farinha de trigo, foram analisados por HPAEC-PAD e HPLC. O fungo T. aurantiacus exibiu uma variação no perfil enzimático de acordo com cada substrato usado no seu cultivo. O substrato que resultou no melhor perfil enzimático para o uso em panificação foi o sabugo de milho, porque esse extrato enzimático exibiu alta atividade xilanolítica e baixa atividade amilolítica e proteolítica. A adição de xilanase, CGTase e xilanase/CGTase aumentou o volume da massa e o volume específico dos pães. Quanto ao... / The development of bread technology is a phenomenon of great impact on food industry. For years, many additives were used on bread technology, increasing the bread quality and improving the acceptance of general population. The aim of this work was to study the effects on the bread quality and on the staling process, by adding enzymes to the dough. The enzymes used were xylanase from the fungus Thermoascus aurantiacus CBMAI 756 in the concentrations 20, 35 and 50U/100 g wheat flour and/or cyclodextryn glycosiltransferase (CGTase) from the bacteria Bacillus clausii E16 in the concentration 15 and 30U/100 g wheat flour, partially purified. The action mechanisms of these enzymes under the substrates arabinoxylan and starch, respectively, were also evaluated. The breads added of xylanase, CGTase and xylanase/CGTase were produced in three distinct stages. For bread staling study, the breads were stored at 4ºC for 10 days, and they were analyzed regarding to the moisture content, texture and amylopectin retrogadation. The products obtained by the action of xylanase and CGTase on arabinoxylans and starch, respectively, isolated from wheat flour, were analyzed by using HPAEC-PAD and HPLC. The fungus T. aurantiacus exhibited a variation on the enzymatic profile according to each substrate used on its cultivation. The substrate which resulted in a better enzymatic profile for using on breadmaking was corncob, since this enzymatic extract exhibited high xylanolytic activity and low amylolytic and proteolytic activities. The addition of xylanase, CGTase and xylanase/CGTase increased the dough volume and the specific volume of the breads. Regarding to the staling study, the enzymes added separated or together reduced amylopectin retrogradation and firmness of the crumb during storage, when compared... (Complete abstract click electronic access below)

A parede celular de plantas é formada basicamente por celulose, hemicelulose e lignina. A formação dos polímeros de hemicelulose depende do suprimento de precursores chamados de açúcares-nucleotídeos. A biossíntese das diferentes estruturas de hemicelulose da parede celular envolve a participação de enzimas pertencentes às famílias das glicosiltransferases (GTs). Estudos feitos em Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon, Oryza sativa (arroz) e Zea mays (milho) auxiliaram na descoberta de 11 enzimas da via de interconversão nucleotídeo-açúcar e de enzimas da família das glicosiltransferases (GTs), como as GT2, GT8, GT43, GT47, GT61 e GT75, envolvidas na biossíntese de hemicelulose. O presente trabalho visa a identificação de genes da via de biossíntese de hemicelulose da parede celular de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) e análise filogenética entre Arabidopsis thaliana (planta modelo de eudicotiledôneas), Oryza sativa, Brachypodium distachyon, Zea mays, Sorghum bicolor e Saccharum spp. Foram identificados os genes das famílias GT2, GT8, GT43, GT47, GT61, GT75, CSL, Epimerase e UDPG em cana-de-açúcar a partir da busca em sete bibliotecas de RNA-Seq utilizando as sequências de O. sativa, Z. mays e S. bicolor como referência. Os domínios específicos de cada família gênica foram confirmados através do programa PFAM e consequentemente anotados. A identificação e anotação das sequencias possibilitou a construção de bancos de sequências das famílias envolvidas na biossíntese de hemicelulose para as espécies A. thaliana, B. distachyon, O. sativa, Z. mays e S. bicolor. Foram identificadas para cada espécie, respectivamente, um total de 67, 49, 49, 60 e 56 genes bona fides. O presente trabalho, além da identificação de genes nas diferentes espécies, permitiu a identificação e seleção de 27 genes candidatos envolvidos na biossíntese de hemicelulose em cana-de-açúcar e possivelmente envolvidos na recalcitrância da parede celular nas diferentes bibliotecas de RNA-Seq de cana-de-açúcar. / The plant cell wall is mainly composed of cellulose, hemicellulose and lignin. The formation of hemicellulose polymers lies on the supply of the so-called sugar-nucleotide precursors. The diverse hemicellulose structures biosynthesis of cell wall involves the participation of enzymes belonging to the families of glycosyltransferases (GTs). Studies in Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon, Oryza sativa (rice) and Zea mays (corn) aid the discovery of 11 enzymes of the nucleotide sugar interconversion pathway and enzymes of the GT family, as GT2, GT8, GT43, GT47, GT61 e GT75, involved in the hemicelluloses biosynthesis. This study aims to the identification of hemicellulose biosynthesis pathway genes from the cell wall of sugarcane (Saccharum spp.) and phylogenetic analysis of Arabidopsis thaliana (eudicotyledonous plant model), Oryza sativa, Brachypodium distachyon, Zea mays, Sorghum bicolor and Saccharum spp. The genes of the GT2, GT8, GT 43, GT47, GT61, GT75, CSL, epimerase and UDPG families were identified in sugarcane from a search in seven RNA-Seq libraries using the sequences of O. sativa, Z. mays and S. bicolor as reference. The specific domains of each gene family have been confirmed through the PFAM program and consequently noted. The identification and annotation of the sequences enabled the construction of sequences banks of the families involved in hemicellulose biosynthesis in the species A. thaliana, B. distachyon, O. sativa, Z. mays and S. bicolor. It was identified for each species, respectively, a total of 67, 49, 49, 60 and 56 bona fides genes. This work, in addition to the identification of genes in different species, allowed the identification and selection of 27 candidate genes involved in the biosynthesis of hemicelluloses in sugarcane and possibly involved in cell wall recalcitrance in the different sugarcane RNA-Seq libraries.