A ciclodextrina glucosiltransferase (CGTase) é uma enzima industrialmente muito importante, capaz de converter o amido em ciclodextrinas (CDs). As CDs são capazes de formar complexos de inclusão com uma grande gama de compostos orgânicos e inorgânicos, podendo mudar suas propriedades químicas e físicas, propriedades estas que lhes confere extensiva aplicabilidade na indústria de alimentos, farmacêutica, química, cosmética e agrícola. Atualmente, diversas CGTases já foram isoladas e caracterizadas a partir de vários microrganismos, principalmente Bacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Xanthomonas, Thermococcus, Vibrio, Geobacillus e Thermoanaerobacterium. Neste trabalho, demonstramos o primeiro relato envolvendo a clonagem e expressão heteróloga da CGTase de Stenotrophomonas maltophilia, microrganismo isolado do solo brasileiro. O gene codificador da CGTase de S. maltophilia, foi amplificado com êxito através da técnica de PCR, clonado no vetor pET-23a(+) e expresso em Escherichia coli BL21(DE3). As células recombinantes necessitaram de aproximadamente 4 horas de cultivo em meio Luria Bertani (LB) após a adição de 0,1 mM de IPTG para a expressão elevada da proteína alvo. Porém, a CGTase recombinante foi expressa sob forma de corpos de inclusão permanecendo na fração insolúvel, sendo necessário utilizar protocolos para solubilização, incluindo diferentes concentrações de uréia, mas a precipitação não foi eficaz. Embora tenha sido observada uma expressão elevada da proteína com cerca de 60 kDa em SDS-PAGE 12%, que correspondeu ao tamanho esperado da proteína, a forma ativa da enzima não foi obtida. Uma análise bioinformática foi realizada, onde foi observou-se uma proteína conhecida como uma importante possível facilitadora transmembrana (PMFTP – putative Major Facilitator Transmembrane Protein) que ancora o gene cgt. Proteína esta que pode ser utilizada em novos estudos a fim de desenvolver um novo e mais eficaz sistema para expressão da CGTase, podendo facilitar a sua expressão extracelular. Assim, mais estudos são necessários para desenvolver um sistema de co-expressão de rCGTase::PMFTP em E. coli e obter mais informações desta proteína de Stenotrophomonas maltophilia. / Cyclodextrin glucosyltransferase (CGTase) is an industrially important enzyme, capable to convert starch into cyclodextrins (CDs). The CDs are able to form inclusion complexes with a wide range of organic and inorganic compounds, which can change their chemical and physical properties, that gives them extensive applicability in the food, pharmaceutical, chemical, cosmetics and agricultural. Currently, many CGTases have been isolated and characterized from various microorganisms, particularly Bacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Xanthomonas, Thermococcus, Vibrio, Geobacillus and Thermoanaerobacterium. This work demonstrates the first report involving cloning and expression of heterologous CGTase from Stenotrophomonas maltophilia, microorganism isolated from Brazilian soil. The gene encoding the S. maltophilia CGTase, was successfully amplified by PCR, cloned into the vector pET-23a (+) and expressed in Escherichia coli BL21(DE3). Recombinant cells required about 4 h of cultivation in Luria Bertani (LB) after addition of 0.1 mM IPTG for high expression of the target protein. However, the CGTase was expressed recombinant form of inclusion bodies remaining in the insoluble fraction, being necessary use protocols for solubilization, including different concentrations of urea, but the precipitation was not effective. Although it was observed a high expression of the protein about 60 kDa on SDS-PAGE 12%, corresponding to the expected size of the protein, but the active form of the enzyme was not obtained. Bioinformatic analysis was performed and observed a Putative Major Facilitator Transmembrane Protein (PMFTP) harboring the cgt gene. This protein can be used in further studies to develop a new and more effective system for expression of the CGTase, which may facilitate its extracellular expression. Thus, more studies are needed to develop a system of co-expression of rCGTase::PMFTP in E. coli and acquire more information about this protein of Stenotrophomonas maltophilia.

Ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) é a enzima capaz de converter o amido e seus açúcares relacionados em ciclodextrinas (CDs) através da reação de ciclização. As CDs têm inúmeras aplicações na indústria farmacêutica, cosmética e de alimentos, devido à sua capacidade de encapsular moléculas hidrofóbicas dentro de sua cavidade. A CGTase de Thermoanaerobacter sp. é capaz de converter o amido em CDs sob condições de processo industrial, em temperaturas elevadas. A produção de CDs em escala industrial é feita, geralmente, em processos de batelada, nos quais é utilizada a enzima livre diretamente. No entanto, a imobilização da CGTase tem sido testada, com o propósito de permitir seu uso contínua e repetidamente, de modo a prevenir sua solubilização e promover uma forma molecular mais estável. Neste trabalho, buscouse imobilizá-la em microesferas de sílica-polietilenoglicol (sílica-PEG). O suporte foi silanizado com 3- aminopropiltrimetoxisilano (APTMS) e ativado com glutaraldeído para gerar condições de imobilização de enzimas, que foi realizada a 6ºC e pH 6, durante 15h. O rendimento de imobilização e a atividade recuperada foram 83% e 73%, respectivamente. Os resultados foram comparados com estudos anteriores sobre a imobilização covalente de CGTase. As propriedades enzimáticas da CGTase imobilizada foram investigadas e comparadas com as da enzima solúvel. CGTases solúveis e imobilizadas apresentaram valores similares de pH ótimo. Por outro lado, a temperatura ótima foi de 100ºC e 80ºC para as formas solúvel e imobilizada da enzima, respectivamente. Em comparação com a CGTase solúvel, a forma imobilizada apresentou maior Km (constante de Michaelis), menor Vmax (velocidade máxima de reação), a estabilidade de armazenamento diminuiu cerca de 15% e apenas um ligeiro decréscimo foi observado quando a estabilidade térmica estava sob avaliação. A estabilidade operacional foi medida em repetidos processos de batelada e a enzima imobilizada reteve cerca de 60% da atividade catalítica inicial, após 15 ciclos. / Cyclodextrin glicosyltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) is the enzyme able to convert starch and related sugars into cyclodextrins (CDs) via cyclization reaction. Cyclodextrins have numerous applications in the pharmaceutical, cosmetics, and food industry, because of their capacity to encapsulate hydrophobic molecules within their cavity. The CGTase from the Thermoanaerobacter sp. is able to degrade starch into CDs under industrial conditions (high temperature). For the industrial scale production of CDs, conventional batch production methods, which utilize soluble CGTase directly, have been mainly adopted. However the immobilization of CGTase has been pursued with the purpose of allow its reuse continuously and repeatedly by avoiding enzyme solubilization and promoting a more stable molecule form. In this research, Thermoanaerobacter CGTase was immobilized on silica-polyethyleneglycol (silica-PEG) microspheres. The support was silanized with 3- aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) and activated with glutaraldehyde to generate conditions for enzyme immobilization, which was carried out at 6ºC and pH 6, during 15h. The immobilization yield and recovery activity was around 83% and 73%, respectively. Results were compared with previous studies on covalent immobilization of CGTase. The enzymatic properties of immobilized CGTase were investigated and compared with those of the soluble enzyme. Soluble and immobilized CGTases showed similar values for optimum pH. On the other hand, the optimum temperature was 100ºC and 80ºC for the soluble and immobilized forms, respectively. In comparison with the soluble CGTase, the immobilized form exhibited higher Km (Michaelis constant), lower Vmax (maximal reaction rate), the storage stability was decreased about 15% and just a slight decrease was observed when thermal stability was under evaluation. The operational stability was evaluated in repeated batch process and the immobilized enzyme retained about 60% of the initial catalytic activity after 15 cycles.

A ciclodextrina glucosiltransferase (CGTase) é uma enzima industrialmente muito importante, capaz de converter o amido em ciclodextrinas (CDs). As CDs são capazes de formar complexos de inclusão com uma grande gama de compostos orgânicos e inorgânicos, podendo mudar suas propriedades químicas e físicas, propriedades estas que lhes confere extensiva aplicabilidade na indústria de alimentos, farmacêutica, química, cosmética e agrícola. Atualmente, diversas CGTases já foram isoladas e caracterizadas a partir de vários microrganismos, principalmente Bacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Xanthomonas, Thermococcus, Vibrio, Geobacillus e Thermoanaerobacterium. Neste trabalho, demonstramos o primeiro relato envolvendo a clonagem e expressão heteróloga da CGTase de Stenotrophomonas maltophilia, microrganismo isolado do solo brasileiro. O gene codificador da CGTase de S. maltophilia, foi amplificado com êxito através da técnica de PCR, clonado no vetor pET-23a(+) e expresso em Escherichia coli BL21(DE3). As células recombinantes necessitaram de aproximadamente 4 horas de cultivo em meio Luria Bertani (LB) após a adição de 0,1 mM de IPTG para a expressão elevada da proteína alvo. Porém, a CGTase recombinante foi expressa sob forma de corpos de inclusão permanecendo na fração insolúvel, sendo necessário utilizar protocolos para solubilização, incluindo diferentes concentrações de uréia, mas a precipitação não foi eficaz. Embora tenha sido observada uma expressão elevada da proteína com cerca de 60 kDa em SDS-PAGE 12%, que correspondeu ao tamanho esperado da proteína, a forma ativa da enzima não foi obtida. Uma análise bioinformática foi realizada, onde foi observou-se uma proteína conhecida como uma importante possível facilitadora transmembrana (PMFTP – putative Major Facilitator Transmembrane Protein) que ancora o gene cgt. Proteína esta que pode ser utilizada em novos estudos a fim de desenvolver um novo e mais eficaz sistema para expressão da CGTase, podendo facilitar a sua expressão extracelular. Assim, mais estudos são necessários para desenvolver um sistema de co-expressão de rCGTase::PMFTP em E. coli e obter mais informações desta proteína de Stenotrophomonas maltophilia. / Cyclodextrin glucosyltransferase (CGTase) is an industrially important enzyme, capable to convert starch into cyclodextrins (CDs). The CDs are able to form inclusion complexes with a wide range of organic and inorganic compounds, which can change their chemical and physical properties, that gives them extensive applicability in the food, pharmaceutical, chemical, cosmetics and agricultural. Currently, many CGTases have been isolated and characterized from various microorganisms, particularly Bacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Xanthomonas, Thermococcus, Vibrio, Geobacillus and Thermoanaerobacterium. This work demonstrates the first report involving cloning and expression of heterologous CGTase from Stenotrophomonas maltophilia, microorganism isolated from Brazilian soil. The gene encoding the S. maltophilia CGTase, was successfully amplified by PCR, cloned into the vector pET-23a (+) and expressed in Escherichia coli BL21(DE3). Recombinant cells required about 4 h of cultivation in Luria Bertani (LB) after addition of 0.1 mM IPTG for high expression of the target protein. However, the CGTase was expressed recombinant form of inclusion bodies remaining in the insoluble fraction, being necessary use protocols for solubilization, including different concentrations of urea, but the precipitation was not effective. Although it was observed a high expression of the protein about 60 kDa on SDS-PAGE 12%, corresponding to the expected size of the protein, but the active form of the enzyme was not obtained. Bioinformatic analysis was performed and observed a Putative Major Facilitator Transmembrane Protein (PMFTP) harboring the cgt gene. This protein can be used in further studies to develop a new and more effective system for expression of the CGTase, which may facilitate its extracellular expression. Thus, more studies are needed to develop a system of co-expression of rCGTase::PMFTP in E. coli and acquire more information about this protein of Stenotrophomonas maltophilia.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-03-10T13:25:39Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) tese juliana vasconcelos.pdf 2.pdf: 2676689 bytes, checksum: 3be9c8d80ebc1f51f2479aaec4fe30ce (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-10T13:25:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) tese juliana vasconcelos.pdf 2.pdf: 2676689 bytes, checksum: 3be9c8d80ebc1f51f2479aaec4fe30ce (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / CNPQ / O câncer de mama é o tipo de tumor que mais acomete as mulheres no mundo. No Brasil estimam-se para 2016/2017, 57.960 novos casos de câncer de mama por ano. O desenvolvimento destes tumores envolve um mecanismo complexo e multifatorial, onde glicosiltransferases e microRNAs (miRNAs) desempenham papeis importantes. O objetivo deste estudo foi avaliar a galactosiltransferase 7 (GALNAC7) e o miRNA 30c no carcinoma ductal invasivo mamário (CDI). Nosso estudo demonstrou, uma baixa expressão do antígeno Tn nos tumores mamários, diante da baixa expressão da GalNAC7 e do seu carboidrato-substrato N-acetil-galactosamina (GalNAc). O estudo evidenciou, também, que o gene GALNT7 não apresenta influência significativa quanto a um prognostico reservado para CDI, diante de sua baixa expressão gênica e proteica, demostrando que o mecanismo de O-glicosilação na formação de mucinas pode ser estimulado, também, por outros genes da família GALNT, porém observamos que o gene GALNT7 pode ser modulado pelo o miRNA 30c frente ao aumento de sua expressão nos tumores estudados, levantando a hipótese de um novo alvo diagnóstico e terapêutico via modulação da expressão de genes da glicosilação. A análise dos dados clínicopatologicos, não demonstrou correlação significativa, com exceção da expressão de GalNAc e tamanho do tumor. Diante da análise do segmento clínico de cada paciente, na curva de sobrevida, não houve resultados significativos quando comparados com os subtipos moleculares, estadiamento clínico, idade e tamanho do tumor. Assim, nossos resultados sugerem que o miRNA 30c pode ser um potencial regulador da expressão do gene GALNT7 e que assim favorece a menor expressão da enzima GALNAC7 levando a uma menor inserção do carboidrato GalNAc nos glicoconjugados de superfície de células de carcinoma ductal invasivo. / Breast cancer is the most common cancer in women in world. In Brazil, it is estimated 57,960 new cases of mammary cancers per year in 2016/2017. The development of these tumors comprises a complex and multifactorial mechanism where glycosyltransferase and microRNAs (miRNAs) play important roles. This study aimed to evaluate the galactosyltransferase 7 (GALNAC7) and the miRNA-30c in mammary invasive ductal carcinoma (IDC). Our results showed a low expression of Tn antigen in mammary tumors resulting from the low expression of GALNAC7 which leads to a low insertion of its saccharidesubstrate N-acetyl-galactosamine (GalNAc) in tumor cell glycoconjugates. The study also evidenced that the gene GALNT7 did not influenced the poor prognostic of IDC, since a low gene expression and, consequently, a low protein expression was observed. Such fact indicates that other genes of the GALNT family may stimulate the O-glycosylation. However, we observed that miRNA-30c might modulate GALNT7 expression and can be a new potential target for diagnosis and therapeutic via modulation of the expression of glycosylation genes. Among the clinocopathologic data, only GalNAc expression and tumor size present a correlation. Patient’s survival curve did not present correlation with tumor molecular subtyping, clinic staging, age and tumor size. Our results suggest that miRNA-30c may be a potential regulator of the GALNT7 gene expression and so favoring a lower expression of the enzyme GALNAC7 leading to a lower insertion of the saccharide GalNAc in glycoconjugates of cell surface in invasive ductal carcinoma.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-10-22T16:02:34Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maycon Carvalho Ribeiro - 2014.pdf: 1028131 bytes, checksum: 34ecaebcaac3768726bacc1c6c4f694b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-10-22T16:03:56Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maycon Carvalho Ribeiro - 2014.pdf: 1028131 bytes, checksum: 34ecaebcaac3768726bacc1c6c4f694b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-22T16:03:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maycon Carvalho Ribeiro - 2014.pdf: 1028131 bytes, checksum: 34ecaebcaac3768726bacc1c6c4f694b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-08-04 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) is an important industrial enzyme for being the only one able to convert starch and related glucans in cyclic oligosaccharides called cyclodextrins (CDs). The arrangement of the glucose units in the formation of CD results in a molecule with the shape of a cone, with hydrophobic interior and hydrophilic surface. This arrangement of glucose molecules in CDs allows its use as a host molecule in the formation of inclusion complexes with organic and inorganic compounds. This mechanism is advantageous in protecting the guest molecule from light, heat and oxidizing conditions and also enable the "dissolution" of compounds of low solubility in aqueous media. Cyclodextrins are used from the food industry to the pharmaceutical, in controlled drug delivery systems and immobilization of toxic compounds for environmental protection. The CGTases are mainly produced by bacteria of the genus Bacillus, found degrading starch rich substrates. The aim of this study was to identify, isolate, select and characterize strains of CGTase-producing bacteria from soil samples from different regions of Brazil as well as calculate the enzymatic production of these bacteria on low-cost substrates. With this work, it was possible to identify 17 bacteria producing cyclodextrin glycosyltransferase enzyme, with nine of them had values above 1.5 for enzymatic production. Of these, all were characterized as gram positive Bacillus. Bioprospecting of bacteria in soils of different cultures led to the identification of bacteria that may be used in studies for the production of cyclodextrin glycosyltransferase and subsequent implementation by various industries. / Ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase, EC 2.4.1.19) é uma enzima industrial importante, sendo a única capaz de converter o amido e glucanos afins em oligossacarídeos cíclicos chamados ciclodextrinas (CDs). O arranjo das unidades de glicose na formação da CD resulta em uma molécula com a forma de cone, com interior hidrofóbico e superfície hidrofílica. Este arranjo das moléculas de glicose permite seu uso como molécula hospedeira na formação de complexos de inclusão com compostos orgânicos e inorgânicos. Este mecanismo é vantajoso na proteção de moléculas contra luz, calor e condições oxidantes e também possibilita melhorar a solubilidade de compostos hidrofóbicos. Ciclodextrinas são utilizadas desde a indústria de alimentos até a farmacêutica, em sistemas de liberação controlada de drogasse e imobilização de compostos tóxicos para proteção ambiental. As CGTase são principalmente produzidas por bactérias do gênero Bacillus, encontradas degradando substratos ricos em amido. O objetivo deste estudo foi identificar, isolar, selecionar e caracterizar linhagens de bactérias produtoras de CGTase a partir de amostras de solo de diferentes regiões do Brasil bem como calcular o índice enzimático destas bactérias em substratos de baixo custo. Com a realização deste trabalho, foi possível identificar 17 bactérias produtoras da enzima ciclodextrina glicosiltransferase, sendo que nove delas apresentaram valores para índice enzimático acima de 1,5. Destas, todas foram caracterizadas como sendo Bacillus gram positivos. A bioprospecção de bactérias em solos de diferentes culturas possibilitou a identificação de bactérias que poderão ser usadas em estudos para a produção da ciclodextrina glicosiltransferase e posterior aplicação pelas mais diversas indústrias.

Orientador: Helia Harumi Sato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-12T13:27:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Orsi_DanielaCastilho_D.pdf: 2624783 bytes, checksum: add51ff0035724efe97b8947a93c9d67 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A sacarose é o principal açúcar utilizado no processamento de alimentos, contudo, o consumo excessivo e não balanceado de alimentos com alto teor de sacarose contribui para a prevalência de doenças como obesidade e cáries dentárias. Nas últimas décadas, tem ocorrido um aumento do interesse pela produção de novos açúcares como alternativa para substituir a sacarose. A isomaltulose (O-a-D-glicopiranosil-1,6-frutofuranosídeo) é um açúcar pouco cariogênico e isômero estrutural da sacarose, encontrada naturalmente no mel em pequenas quantidades. A bactéria Serratia plymuthica ATCC 15928 produz a enzima glicosiltransferase e catalisa a conversão da sacarose em isomaltulose. Neste trabalho, utilizou-se a metodologia de superfície de resposta para estudar o efeito dos componentes do meio de cultivo na produção de glicosiltransferase pela bactéria Serratia plymuthica em frascos sob agitação a 200 rpm e 30ºC. Foi obtida alta produção de glicosiltransferase (14,26 UA/mL, média dos pontos centrais) utilizando-se o meio de cultivo 1, composto de 40 g/L de melaço de cana de açúcar, 15 g/L de peptona bacteriológica da BiobrásÒ e 20 g/L de extrato de levedura Prodex Lac SDÒ. O meio de cultivo 2 (40 g/L de melaço de cana de açúcar e 20 g/L de extrato de levedura Prodex Lac SDÒ), além de render ótima produção de glicosiltransferase (13,54 UA/mL, média dos pontos centrais), teve seu custo reduzido por ser formulado sem a adição do componente peptona bacteriológica da BiobrásÒ. Foi estudado o efeito da temperatura (26ºC, 28ºC e 30ºC) na fermentação da bactéria Serratia plymuthica para produção de massa celular e de glicosiltransferase em fermentador de 6,6 L. A maior produção de glicosiltransferase ocorreu após 6 horas de fermentação na temperatura de 26ºC, sendo obtida atividade enzimática de 25,97 UA/mL. As células livres da bactéria Serratia plymuthica foram utilizadas para a conversão de sacarose em isomaltulose. Utilizando-se concentração de massa celular úmida de 20% (p/v) e concentração de solução de sacarose de 25% (p/v) obteve-se alta porcentagem de isomaltulose (84,33%, valor médio dos meios de cultivo 1 e 2) após 2 horas de reação a 27ºC, em frascos sob agitação a 180 rpm. As células livres cultivadas em meio de cultivo 2 (sem adição de peptona bacteriológica da BiobrásÒ) foram reutilizadas por nove bateladas sucessivas e obteve-se eficiente conversão de sacarose em isomaltulose (75,20%, média das bateladas). Foi estudada a produção de isomaltulose a partir de sacarose por células da bactéria Serratia plymuthica imobilizadas em alginato de cálcio. A conversão de sacarose em isomaltulose pelas células imobilizadas foi feita em bioreatores de leito empacotado mantidos a temperatura de 25°C. O tratamento das células imobilizadas em alginatoSynthÒ 2% com glutaraldeído aumentou a atividade enzimática, sendo obtida conversão de sacarose em isomaltulose acima de 64% por 15 dias. A goma gelana KELCOGELÒ F foi utilizada como suporte para imobilização das células de Serratia plymuthica. As células imobilizadas em goma gelana tratadas com glutaraldeído foram secas por 36 horas, sob refrigeração a 10°C. As células imobilizadas foram transferidas para bioreatores mantidos a 25ºC e usadas na conversão contínua de sacarose em isomaltulose. Quando as células imobilizadas secas foram utilizadas no processo contínuo, a conversão de sacarose em isomaltulose manteve-se acima de 69% por 15 dias. Esse estudo demonstrou a possibilidade do uso da goma gelana KELCOGELÒ F como suporte para imobilização das células de Serratia plymuthica. O suporte utilizado combina a simplicidade na técnica de imobilização celular, boa estabilidade operacional e altas taxas de bioconversão / Abstract: Sucrose is the main sweetener used in food processing, but, the excessive and imbalanced consumption of high-sucrose foods is a contributory factor in obesity and dental caries. In the last few decades, the production of new sweeteners as alternatives to sucrose has aroused great interest. Isomaltulose (O-a-D-glucopyranosyl-1,6- fructofuranose) is a low cariogenic sweetener and a structural isomer of sucrose, naturally present in honey in small quantities. The bacteria Serratia plymuthica ATCC 15928 produces the enzyme glucosyltransferase and catalyses the conversion of sucrose into isomaltulose. In this work, response surface methodology was applied to study the effect of culture medium components in the production of glucosyltransferase by Serratia plymuthica in shaken flasks at 200 rpm and 30ºC. Higher glucosyltransferase production (14.26 UA/mL, average of the central points) was obtained in culture medium 1, composed of 40 g/L of sugar cane molasses, 15 g/L of BiobrásÒ bacteriological peptone and 20 g/L of Prodex Lac SDÒ yeast extract. Culture medium 2 (40 g/L of sugar cane molasses and 20 g/L of Prodex Lac SDÒ yeast extract, formulated without the component BiobrásÒ bacteriological peptone, resulted in a low cost medium and optimized glucosyltransferase production (13.54 UA/mL, average of the central points). The influence of temperature (26ºC, 28ºC and 30ºC) on the growth of the bacterium Serratia plymuthica for cell mass and glucosyltransferase production in a 6.6 L bioreactor, was also studied. The highest production of glucosyltransferase (25.97 UA/mL) was obtained in culture medium 1 after 6 hours at 26ºC. Free Serratia plymuthica cells were used for the conversion of sucrose into isomaltulose. A higher isomaltulose production (84.33%, mean value for culture media 1 and 2) was obtained at a temperature of 27ºC, 20% (w/v) wet cell mass and 25% (w/v) sucrose solution after 2 hours of reaction in shaken flasks at 180 rpm. The free cells cultivated in the culture medium 2 (without BiobrásÒ bacteriological peptone) were reused for nine successive batches, with efficient conversion of sucrose into isomaltulose (75.20%, average of the batches). Furthermore, the conversion of sucrose into isomaltulose using Serratia plymuthica cells immobilized in calcium alginate was also studied. The continuous production of isomaltulose by immobilized cells was accomplished in packed bed bioreactors maintained at 25°C. The treatment of cells immobilized in 2% SynthÒ alginate with glutaraldeyde increased enzyme activity obtaining an isomaltulose production of over 64% for 15 days. The gellan gum KELCOGELÒ F was also used as a support in the immobilization of Serratia plymuthica cells. The cells immobilized in gellan gum and treated with glutaraldeyde, were dried for approximately 36 hours at 10°C and used for the continuous production of isomaltulose. The immobilized cells were packed into bioreactors maintained at 25°C. When dry immobilized cells were used in the continuous process, the conversion of sucrose into isomaltulose was over 69% for about 15 days. This study demonstrated the feasibility of using KELCOGELÒ F gellan gum as a support in the immobilization of Serratia plymuthica cells. This support used combines the simplicity of the immobilization technique with good operational stability and high levels of bioconversion / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-09-27T15:37:31Z No. of bitstreams: 1 brunaalvarengadias.pdf: 1910111 bytes, checksum: 734a6679680d6dbad241d7c324d0ec86 (MD5) / Approved for entry into archive by Diamantino Mayra (mayra.diamantino@ufjf.edu.br) on 2016-09-27T20:47:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 brunaalvarengadias.pdf: 1910111 bytes, checksum: 734a6679680d6dbad241d7c324d0ec86 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-27T20:47:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 brunaalvarengadias.pdf: 1910111 bytes, checksum: 734a6679680d6dbad241d7c324d0ec86 (MD5) Previous issue date: 2015-09-03 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cáries dentárias resultam de um desequilíbrio metabólico do biofilme dental, formado por bactérias, principalmente estreptococos e lactobacilos. Uma das formas de prevenir o processo carioso seria inibir a formação deste biofilme cariogênico. Este trabalho, portanto, objetiva verificar a inibição da formação de biofilme dentário formado por Streptococcus mutans (S. mutans) através da ação de quatro substâncias (epigalocatequina, clorexidina, xilitol e resveratrol), e verificar o provável mecanismo de ação a partir da expressão gênica das enzimas glicosiltransferase (GTF) e frutosiltransferase (FTF). O ensaio de reação de cadeia de polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) foi realizado para quantificar a expressão dos genes. Foram realizados ainda, ensaios de viabilidade celular e para verificação de formação de biofilme após tratamento com as substâncias testes para determinar concentrações em que houvesse inibição da formação de biofilme em condições de viabilidade celular. As concentrações de xilitol, resveratrol e clorexidina que se mostraram eficazes foram 100 mg/mL, 0,1 mg/mL e 0,001 mg/mL, respectivamente, ou seja, concentrações nas quais houve inibição da formação de biofilme sem modificação da viabilidade bacteriana. A epigalocatequina não apresentou uma concentração que proporcionasse inibição de biofilme sem a consequente morte bacteriana. Os tratamentos foram realizados com o xilitol, o resveratrol e a clorexidina, e após realização de RT-qPCR (reação de cadeia de polimerase quantitativa em tempo real de transcrição reversa) foram obtidos os resultados referentes à expressão dos genes ftf e gtfb. Houve uma diminuição significativa (72,8%) na expressão gênica do ftf após o tratamento com xilitol. O resveratrol não interferiu na expressão deste gene e a clorexidina provocou redução da expressão do gene de controle (housekeeping gene), inviabilizando a avaliação da expressão do ftf na concentração avaliada. Não houve modificação significativa na expressão de gtfb após o tratamento com o resveratrol e a clorexidina nas concentrações definidas. O xilitol reduziu a expressão do housekeeping gene 16S rRNA, indicando morte celular na concentração testada. Os resultados nos levaram a concluir que as três substâncias - resveratrol, xilitol e clorexidina - atuam como potenciais agentes inibidores de biofilme dentário formado por S. mutans. Verificou-se, entretanto, que o xilitol inibe a expressão do gene ftf, indicando que o provável mecanismo de ação de tal inibição da formação do biofilme foi através da redução da expressão deste gene do S. mutans. A clorexidina já possui reconhecida ação bactericida, entretanto neste trabalho verificamos uma concentração desta substância em que houve inibição de biofilme sem a consequente morte celular. Diante dos achados podemos propor outras formas de aplicação do xilitol e da clorexidina, em odontologia, e também a utilização do resveratrol como um agente inibidor do processo carioso, já que o mesmo é capaz de inibir a formação de biofilme dentário. A inibição do biofilme por estas substâncias seria interessante de modo que não geraríamos um desequilíbrio na flora bacteriana, mantendo, portanto, bactérias que atuam de forma positiva na cavidade bucal. Desta forma, outros estudos laboratoriais e clínicos são necessários 16 para demonstrar a eficácia de tais substâncias para prevenção ou até mesmo tratamento de cáries dentárias. / Dental caries results from a metabolic imbalance in the biofilm, formed by bacteria, especially streptococci and lactobacilli. One way of preventing caries process would be inhibit cariogenic biofilm formation. This work therefore aims to verify the possible inhibition of biofilm formation by Streptococcus mutans (S. mutans) after the treatment with four substances (epigallocatechin, chlorhexidine, xylitol and resveratrol), and to investigate the action mechanism through the expression of the genes glycosyltrasferase (GTF) and fructosyltransferase (FTF). The test of quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was carried out to quantify the expression of these enzymes. Cell viability assays as well as tests for verification of biofilm formation were also carried out after the treatment with the test substances to determine the concentration when the inhibition of biofilm formation occurred under conditions of cell viability.The xylitol, resveratrol and chlorhexidine concentrations that proved effective were 100 mg/ml, 0.1 mg/ml and 0.001 mg/mL, respectively, concentrations in which there was inhibition of biofilm formation without modification of the bacterial viability. The epigallocatechin didn’t demonstrate a concentration that would provide biofilm inhibition without the consequent inhibition of bacterial viability. The treatments were performed with xylitol, resveratrol and chlorhexidine, and after completion of RT-qPCR (reverse transcription real time polymerase chain reaction), they’re obtained the results for enzyme expression of FTF and GTFB. There was a significant decrease (72.8%) in the enzyme FTF expression after treatment with xylitol. The resveratrol didn’t affect the expression of this enzyme and chlorhexidine caused reduced gene expression control (housekeeping gene), precluding to evaluate the FTF gene expression in the assessed concentration. There was no significant change in GTFB expression after treatment with resveratrol and chlorhexidine in defined concentrations. Xylitol reduced housekeeping gene 16S rRNA expression, indicating cell death in the concentration tested. The results led us to conclude that the three substances (resveratrol, xylitol and chlorhexidine) act as potential dental biofilm inhibitors formed by S. mutans. It was found, however, that xylitol inhibits FTF gene expression, indicating that the probable mechanism of action of such inhibition of biofilm formation was by reducing the expression of this S. mutans gene. Chlorhexidine has already recognized bactericidal action, however this work we see a concentration of this substance that was inhibiting biofilm without subsequent cell death. Considering those findings may suggest other ways of applying the xylitol and chlorhexidine in dentistry and also the use of resveratrol as an inhibitory agent of the carious process, since it is capable of inhibiting dental plaque formation. Biofilm inhibition these substances would be interesting to such an extent that there would generate an imbalance in the bacterial flora, thus keeping bacteria that act in a positive manner in the oral cavity. Thus, clinical studies are necessary to demonstrate the efficacy of these substances to prevent or even caries treatment.

A ciclodextrina glicosiltransferase [E.C. 2.4.1.19; CGTase] é uma enzima industrialmente importante, usada para produzir ciclodextrinas. Neste trabalho foi utilizado o planejamento experimental e a metodologia de superfície de resposta a fim de identificar as melhores condições para a produção de CGTase pela bactéria alcalófila Bacillus circulans. As melhores condições de temperatura e pH, para a produção de CGTase foram, respectivamente, 36 ºC e 9,7. Em seguida, utilizando estes parâmetros otimizados, a produção de CGTase foi avaliada em cultivos submersos, batelada e batelada alimentada, e em cultivo semi-sólido (CSS), usando um resíduo fibroso de soja (SIFR) como substrato. Nos cultivos em batelada, a atividade máxima de CGTase obtida foi de 1155 U.mL-1, em aerobiose. A produção de CGTase foi bastante influenciada pelo fluxo de ar e pela agitação, sendo que uma alta produtividade enzimática (155 U.(mLh)-1) foi obtida em condições de aeração moderada (400 rpm para a velocidade de agitação e 1,7 vvm para o fluxo de ar). Com estes parâmetros otimizados, a produtividade de CGTase obtida em cultivo em batelada alimentada foi de 137 U.(mLh)-1, com uma taxa de alimentação de 0,17 g.(Lh)-1. O crescimento celular e a síntese de CGTase, usando o resíduo fibroso de soja como substrato apresentou um rendimento de 32.776 U.g(SIFR) -1. As diferentes abordagens utilizadas neste trabalho poderão ser aplicadas para a produção de outras enzimas amilolíticas e também para a produção de CGTase com outros substratos. / Cyclodextrin glycosyltransferase [E.C. 2.4.1.19; CGTase] is an industrially important enzyme, which is used to produce cyclodextrins. In this study we report the use of experimental factorial design and response surface methodology to find the best conditions for CGTase production by alkaliphilic Bacillus circulans. The optimized calculated values for the tested variables were pH 9.7 and temperature 36oC. The CGTase production was further studied with the optimized process parameters on submerged cultivations (SC), batch or fedbatch, and solid-state cultivations (SSC) using soybean industrial fibrous residue (SIFR). The maximum CGTase activity obtained on batch cultivation was 1,155 U.mL-1 under aerobic conditions. The CGTase production was strongly affected by air flow rate and agitation speed, showing high enzyme productivity (155 U.mL-1h-1) under moderate conditions of aeration (400 rpm for speed agitation and 1.7 vvm for air flow rate). With these optimized process parameters, CGTase productivity obtained on fed-batch cultivations was 137 U.mL-1h-1, with feeding rate at 0.17 g.L-1h-1. Cell growth and CGTase synthesis in SSC using soybean industrial fibrous residue as substrate was excellent, with CGTase yield of 32,776 U.g(SIFR) -1. The different approaches used in this study may also find applications for the production of other starch-converting enzymes and also for other CGTase-producing substrates.

A ciclodextrina glicosiltransferase [E.C. 2.4.1.19; CGTase] é uma enzima industrialmente importante, usada para produzir ciclodextrinas. Neste trabalho foi utilizado o planejamento experimental e a metodologia de superfície de resposta a fim de identificar as melhores condições para a produção de CGTase pela bactéria alcalófila Bacillus circulans. As melhores condições de temperatura e pH, para a produção de CGTase foram, respectivamente, 36 ºC e 9,7. Em seguida, utilizando estes parâmetros otimizados, a produção de CGTase foi avaliada em cultivos submersos, batelada e batelada alimentada, e em cultivo semi-sólido (CSS), usando um resíduo fibroso de soja (SIFR) como substrato. Nos cultivos em batelada, a atividade máxima de CGTase obtida foi de 1155 U.mL-1, em aerobiose. A produção de CGTase foi bastante influenciada pelo fluxo de ar e pela agitação, sendo que uma alta produtividade enzimática (155 U.(mLh)-1) foi obtida em condições de aeração moderada (400 rpm para a velocidade de agitação e 1,7 vvm para o fluxo de ar). Com estes parâmetros otimizados, a produtividade de CGTase obtida em cultivo em batelada alimentada foi de 137 U.(mLh)-1, com uma taxa de alimentação de 0,17 g.(Lh)-1. O crescimento celular e a síntese de CGTase, usando o resíduo fibroso de soja como substrato apresentou um rendimento de 32.776 U.g(SIFR) -1. As diferentes abordagens utilizadas neste trabalho poderão ser aplicadas para a produção de outras enzimas amilolíticas e também para a produção de CGTase com outros substratos. / Cyclodextrin glycosyltransferase [E.C. 2.4.1.19; CGTase] is an industrially important enzyme, which is used to produce cyclodextrins. In this study we report the use of experimental factorial design and response surface methodology to find the best conditions for CGTase production by alkaliphilic Bacillus circulans. The optimized calculated values for the tested variables were pH 9.7 and temperature 36oC. The CGTase production was further studied with the optimized process parameters on submerged cultivations (SC), batch or fedbatch, and solid-state cultivations (SSC) using soybean industrial fibrous residue (SIFR). The maximum CGTase activity obtained on batch cultivation was 1,155 U.mL-1 under aerobic conditions. The CGTase production was strongly affected by air flow rate and agitation speed, showing high enzyme productivity (155 U.mL-1h-1) under moderate conditions of aeration (400 rpm for speed agitation and 1.7 vvm for air flow rate). With these optimized process parameters, CGTase productivity obtained on fed-batch cultivations was 137 U.mL-1h-1, with feeding rate at 0.17 g.L-1h-1. Cell growth and CGTase synthesis in SSC using soybean industrial fibrous residue as substrate was excellent, with CGTase yield of 32,776 U.g(SIFR) -1. The different approaches used in this study may also find applications for the production of other starch-converting enzymes and also for other CGTase-producing substrates.

A ciclodextrina glicosiltransferase [E.C. 2.4.1.19; CGTase] é uma enzima industrialmente importante, usada para produzir ciclodextrinas. Neste trabalho foi utilizado o planejamento experimental e a metodologia de superfície de resposta a fim de identificar as melhores condições para a produção de CGTase pela bactéria alcalófila Bacillus circulans. As melhores condições de temperatura e pH, para a produção de CGTase foram, respectivamente, 36 ºC e 9,7. Em seguida, utilizando estes parâmetros otimizados, a produção de CGTase foi avaliada em cultivos submersos, batelada e batelada alimentada, e em cultivo semi-sólido (CSS), usando um resíduo fibroso de soja (SIFR) como substrato. Nos cultivos em batelada, a atividade máxima de CGTase obtida foi de 1155 U.mL-1, em aerobiose. A produção de CGTase foi bastante influenciada pelo fluxo de ar e pela agitação, sendo que uma alta produtividade enzimática (155 U.(mLh)-1) foi obtida em condições de aeração moderada (400 rpm para a velocidade de agitação e 1,7 vvm para o fluxo de ar). Com estes parâmetros otimizados, a produtividade de CGTase obtida em cultivo em batelada alimentada foi de 137 U.(mLh)-1, com uma taxa de alimentação de 0,17 g.(Lh)-1. O crescimento celular e a síntese de CGTase, usando o resíduo fibroso de soja como substrato apresentou um rendimento de 32.776 U.g(SIFR) -1. As diferentes abordagens utilizadas neste trabalho poderão ser aplicadas para a produção de outras enzimas amilolíticas e também para a produção de CGTase com outros substratos. / Cyclodextrin glycosyltransferase [E.C. 2.4.1.19; CGTase] is an industrially important enzyme, which is used to produce cyclodextrins. In this study we report the use of experimental factorial design and response surface methodology to find the best conditions for CGTase production by alkaliphilic Bacillus circulans. The optimized calculated values for the tested variables were pH 9.7 and temperature 36oC. The CGTase production was further studied with the optimized process parameters on submerged cultivations (SC), batch or fedbatch, and solid-state cultivations (SSC) using soybean industrial fibrous residue (SIFR). The maximum CGTase activity obtained on batch cultivation was 1,155 U.mL-1 under aerobic conditions. The CGTase production was strongly affected by air flow rate and agitation speed, showing high enzyme productivity (155 U.mL-1h-1) under moderate conditions of aeration (400 rpm for speed agitation and 1.7 vvm for air flow rate). With these optimized process parameters, CGTase productivity obtained on fed-batch cultivations was 137 U.mL-1h-1, with feeding rate at 0.17 g.L-1h-1. Cell growth and CGTase synthesis in SSC using soybean industrial fibrous residue as substrate was excellent, with CGTase yield of 32,776 U.g(SIFR) -1. The different approaches used in this study may also find applications for the production of other starch-converting enzymes and also for other CGTase-producing substrates.